一种成体干细胞衍生的类器官制备方法

摘要

本发明涉及一种成体干细胞衍生的类器官制备方法。本发明通过筛选特定的抗原表位，并通过专有的杂交瘤技术产生抗GSK‑3β的单克隆抗体。在本发明报道的抗体具有高结合亲和力；特异性结合GSK‑3β人蛋白，没有交叉反应；能够有效的抑制GSK‑3β的表达，能够促进骨髓间充质干细胞构建类肾器官，也能够促进iPSC分化为神经干细胞，具有很好的应用前景。

权利要求

1.一种特异性针对GSK‑3β的单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻重链序列分别如下：轻链可变区的序列如SEQ ID NO：2所示，重链可变区的序列如SEQ ID NO：3所示。

2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于促进iPSC分化为神经干细胞的药物中的用途。

3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备促进骨髓间充质干细胞构建类肾器官的药物中的用途。

说明书

一种成体干细胞衍生的类器官制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物领域，更具体的涉及一种成体干细胞衍生的类器官制备方法。

背景技术

[0002] 类器官(Organoids)，即是指它类似于组织器官。其实，它本身是一种基于3D体外细胞培养系统建立的，与体内的来源组织或器官高度相似的一种模型。这些3D体外培养系统可复制出已分化组织的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞之间、细胞与其周围基质之间的相互作用和空间位置形态。而其本身又能做到与体内分化的组织器官具有相似的生理反应，与来源组织具有极高的相似性。与传统2D细胞培养模式相比，3D培养的类器官包含多种细胞类型，能够形成具有功能的“微器官”，能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态，因而在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。

[0003] 类器官用于生理状态下的研究，其材料可来源于多能干细胞(human pluripotent stem cells，hPSCs)或成体干细胞。其中多能干细胞可来源于胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，而成体干细胞则一般来源于手术取材后的组织样本的分离提纯。正常组织类器官除了应用于生理性的研究如胚胎发育等之外，也可应用于肿瘤研究，包括致癌危险因素的机制研究和基因编辑条件下肿瘤类器官的建立。

[0004] 类器官的研究主要集中于疾病模型，如发育相关问题，遗传疾病，肿瘤癌症等。通过使用患者的iPSCs可建立有价值的疾病模型，并能在体外模拟重现病人疾病模型；同时，类器官的建立可以实现对药物药效和毒性进行更有效、更真实的检测。由于类器官可以直接由人类iPSCs直接培养生成，相比于动物模型很大程度上避免了因动物和人类细胞间的差异而导致的检测结果不一致。

[0005] 已有研究表明，干细胞通过定向分化，可以诱导分化为集合管和肾单位。输尿管芽也起源于中间中胚层，与一个相邻细胞群(即后肾间充质)相互作用，输尿管芽将产生输尿管树，从而形成输尿管、肾盂和集合管，而后肾间充质祖细胞会产生肾单位。输尿管上皮来源于中肾管的一个侧支，其本身形成于前中间中胚层，而后肾间充质来源后中间中胚层。细胞从原始条纹(体节中胚层)向头侧迁移形成中间中胚层。早期迁移的原始条纹细胞在成纤维细胞生长因子9(fibroblast growth factor9，FGF9)刺激下形成输尿管上皮细胞，而肝糖原合成激酶3β受体的选择性抑制剂(CHIR99021)通过改变Wnt信号的持续时间刺激较晚迁移的原始条纹细胞，引起后肾间充质增加。根据此原理，2015年国外学者利用诱导多能干细胞的定向诱导分化获得了类肾器官。肖枫林等采用BM‑MSCs利用CHIR99021肝糖原合成激酶3β受体的选择性抑制剂以及通过细胞因子控制BM‑MSCs的分化，成功构建出类肾器官。由此可见，肝糖原合成激酶3β是形成类器官的关键步骤。

[0006] 糖原合成酶激酶‑3(glycogensynthasekinase3，GSK‑3)是一种在进化上非常保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，普遍存在于哺乳动物真核细胞中，除去最早发现的调控糖原合成酶(gloycogensynthase，GS)的活性外，GSK‑3β还能作用于众多信号蛋白、结构蛋白和转录因子，调节细胞的分化、增殖、存活和凋亡。在癌症、神经退行性疾病、神经精神类疾病等多种重大疾病的研究中，选择其作为治疗靶点，受到越来越多研究者的重视。肝糖原合成激酶3β通路抑制剂目前种类很少，可选择类型还不多。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种特异性针对GSK‑3β单克隆抗体。所述抗体是采用特异性的优势抗原表位筛选获得的。

[0008] 一方面，本发明提供了GSK‑3β‑C1单抗，其亲和力解离常数(Kd)为7.23×10－10，属于高亲和力抗体。

[0009] 单抗的轻重链序列分别如下：

[0010] 轻链可变区(SEQ ID NO：2)

[0011] DIVITQRPALMAASPGEKVTITCMLYLRDMKAKSKWYQQKSGISPKPWIYFNTKMSCGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCQSDYREVDVFGAGTKLELK

[0012] 重链可变区(SEQ ID NO：3)

[0013] EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSTFYQVWIKQRPGQGLEWIGVICLEDTYDLLHKELGGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGSIYYSPSWGLGTTLAVSS

[0014] 优选地，重链可变区的氨基酸序列是与序列3具有至少50％同源性的类似序列，优选地，重链可变区的氨基酸序列是与序列3具有至少60％同源性的类似序列，优选地，重链可变区的氨基酸序列是与序列3具有至少70％同源性的类似序列，优选地，重链可变区的氨基酸序列是与序列3具有至少80％同源性的类似序列，优选地，重链可变区的氨基酸序列是与序列3具有至少90％同源性的类似序列，优选地，重链可变区的氨基酸序列是与序列3具有至少99％同源性的类似序列。

[0015] 优选地，轻链可变区的氨基酸序列是与序列2具有至少50％同源性的类似序列，优选地，轻链可变区的氨基酸序列是与序列2具有至少60％同源性的类似序列，优选地，轻链可变区的氨基酸序列是与序列2具有至少70％同源性的类似序列，优选地，轻链可变区的氨基酸序列是与序列2具有至少80％同源性的类似序列，优选地，轻链可变区的氨基酸序列是与序列2具有至少90％同源性的类似序列，优选地，轻链可变区的氨基酸序列是与序列2具有至少100％同源性的类似序列。

[0016] 本公开包括编码GSK‑3β单克隆抗体的免疫球蛋白轻链和重链基因的核酸分子，包含这种核酸的载体，和能够产生本公开的抗GSK‑3β单克隆抗体的宿主细胞。

[0017] 本发明的GSK‑3β单克隆抗体可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备。为了重组表达抗体，用携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的一种或多种重组表达载体转染宿主细胞，使得轻链和重链在宿主细胞中表达，任选地，分泌到培养宿主细胞的培养基中，从该培养基中可以回收抗体。使用标准的重组DNA方法获得抗体重链和轻链基因，将这些基因整合到重组表达载体中，并将载体导入宿主细胞中。

[0018] 本公开的GSK‑3β单克隆抗体包括完整的分子和抗体片段(例如Fab和F(ab')2能特异性结合hpg.Fab和F(ab')的片段)2片段缺少完整抗体的Fc片段，从动物或植物的循环中更快地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合。因此，抗体片段可用于其它应用中的治疗应用。

[0019] 术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，通常是靶结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段。“Fv”片段是包含完整靶识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密，非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体(V1，V2)组成。H‑VL在该构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以在V的表面上定义靶结合位点。H‑VL二聚体。通常，六个CDR赋予抗体靶结合特异性。然而，在一些情况下，即使是单个可变结构域(或仅包含靶特异性的三个CDR的Fv的一半)也能够具有识别和结合靶的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含VH和VL抗体的结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，Fv多肽还包括在Vv和Vb之间的多肽接头。H和VL能使scFv形成靶结合所需结构的结构域。“单结构域抗体”由单个VH或VL对HPG显示足够亲和力的结构域。

[0020] GSK‑3β单克隆抗体可以配制在组合物中。任选地，本文提供的组合物通常作为无菌药物组合物的一部分提供，所述无菌药物组合物通常包括药学上可接受的载体。该组合物可以是任何合适的形式(取决于给予患者所需的方法)。

[0021] 本发明另外一方面，提供了GSK‑3β单克隆抗体在制备抑制GSK‑3β活性的药物组合物中的用途。

[0022] 本发明的GSK‑3β单克隆抗体可以通过多种途径给予患者，例如口服，透皮，皮下，鼻内，静脉内，肌内，眼内，局部，鞘内和脑室内。在任何给定的情况下，最合适的给药途径将取决于特定的抗体，受试者，疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。该抗体可配制成水溶液，通过皮下注射给药。

[0023] 药物组合物可以方便地以单位剂量形式存在，该单位剂量形式包含预定量的本公开的抗GSK‑3β单克隆抗体/剂量。这样的单元可包含例如但不限于5mg至5g，例如10mg至1g，或20mg至50mg。用于本公开的药学上可接受的载体可以采取多种形式，例如，取决于待治疗的病症或给药途径。

[0024] 通过将具有所需纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体混合，本领域通常使用的赋形剂或稳定剂(所有这些在本文中都被称作“载体”)，即缓冲剂，稳定剂，防腐剂，等渗剂，非离子洗涤剂，抗氧化剂和其它各种添加剂。这些添加剂在所用剂量和浓度下必须对接受者无毒。

[0025] 缓冲剂有助于将pH保持在接近生理条件的范围内。它们可以以约2mM至约50mM的浓度存在。用于本公开的合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸一钠‑柠檬酸二钠混合物，柠檬酸‑柠檬酸三钠混合物，柠檬酸‑柠檬酸一钠混合物，等)，琥珀酸盐缓冲液(例如，琥珀酸‑琥珀酸单钠混合物，琥珀酸‑氢氧化钠混合物，琥珀酸‑琥珀酸二钠混合物，等)，酒石酸盐缓冲液(例如，酒石酸‑酒石酸钠混合物，酒石酸‑酒石酸钾混合物，酒石酸‑氢氧化钠混合物，等)，富马酸盐缓冲液(例如，富马酸‑富马酸一钠混合物，富马酸‑富马酸二钠混合物，富马酸一钠‑富马酸二钠混合物，等)，葡糖酸盐缓冲液(例如，葡萄糖酸‑葡萄糖酸钠混合物，葡萄糖酸‑氢氧化钠混合物，葡萄糖酸‑葡萄糖酸钾混合物，等)，草酸盐缓冲液(例如，草酸‑草酸钠混合物，草酸‑氢氧化钠混合物，草酸‑草酸钾混合物等)，乳酸缓冲液(例如乳酸‑乳酸钠混合物，乳酸‑氢氧化钠混合物，乳酸‑乳酸钾混合物等)和乙酸缓冲液(例如乙酸‑乙酸钠混合物，乙酸‑氢氧化钠混合物等)。另外，可以使用磷酸缓冲液，组氨酸缓冲液和三甲胺盐如Tris。

[0026] 本发明另外一方面，提供了GSK‑3β单克隆抗体在促进骨髓间充质干细胞构建类肾器官中的用途。

[0027] 进一步的，所述用途中GSK‑3β单克隆抗体的浓度为10μmol/L。

[0028] 进一步的，本发明的单克隆抗体也能够促进iPSC分化为神经干细胞，有利于后续制备神经相关类器官。

[0029] 有益效果

[0030] 本发明的有益效果在通过筛选特定的抗原表位，并通过专有的杂交瘤技术产生抗GSK‑3β的单克隆抗体。在本发明报道的抗体具有高结合亲和力；特异性结合GSK‑3β人蛋白，没有交叉反应；能够有效的抑制GSK‑3β的表达，能够促进骨髓间充质干细胞构建类肾器官，也能够促进iPSC分化为神经干细胞，具有很好的应用前景。

附图说明

[0031] 图1 GSK‑3β抗原优势表位分析结果图

[0032] 图2抗体对GSK‑3β蛋白表达的影响结果图

[0033] 图3抗体对iPSC分化为神经干细胞细胞密度影响结果图

具体实施方式

[0034] 下面通过具体实施方式及实验数据对本发明作进一步的说明。尽管为了清楚的目的，在下文中使用了专用术语，但这些术语并不意味着定义或限制本发明的范围。

[0035] 实施例1GSK‑3β单克隆抗体的制备

[0036] 按照人Glycogen Synthase Kinase‑3 Beta的氨基酸序列，根据抗原决定簇进行分析，通过计算机Parker软件分析(如图1所示)，选择优势的抗原表位如下：

[0037] kvsrdkdgsk vttvvatpgq gpdrpqevsy tdtkvigngs fgvvyqaklc dsgelvaikk vlqdkrfknr elqimrkldh cnivrlryff yssgekkdev(SEQ ID NO：1)。将所述抗原进行人工合成，用于下述免疫。

[0038] (1)初次免疫：取4只6周龄健康雌性BALB/c小鼠，将800μg GSK‑3β抗原片段用100μl无菌PBS稀释后与100μl完全弗氏佐剂混合并充分乳化后，给每只小鼠腹腔注射；

[0039] (2)第二次免疫：三周后之后，将80μg GSK‑3β抗原片段用100μl无菌PBS稀释后与100μl不完全弗氏佐剂充分乳化混匀，每只小鼠腹腔注射；

[0040] (3)小鼠眼眶静脉丛取血，用间接ELISA法测定血清效价，选择血清效价达1:105以上的小鼠，在细胞融合的前3天用不加佐剂的200μg GSK‑3β抗原片段以100μl PBS稀释后腹腔注射冲击免疫1次；

[0041] (4)三天后取BALB/c小鼠脾细胞进行细胞融合。

[0042] (5)将对数生长期的骨髓瘤细胞Sp2/0，1000rpm心5min，弃上清，用10ml无血清7
RPMI‑1640完全培养基重悬细胞后计数，调整细胞数为1x10 ，用无血清RPMI‑1640完全培养基洗涤2次；

[0043] (6)将Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞以1:1(V/V)的比例在50ml塑料锥底离心管中混合。用无血清RPMI‑1640完全培养基加满离心管，室温下，1000rpm离心5mim；

[0044] (7)预热50％PEG溶液和无血清的RPMI‑1640完全培养基；

[0045] (8)吸取离心后的混合细胞上清部分，向混合细胞沉淀中加入1ml热的PEG，在1min内匀速逐滴缓慢加入，每加入一滴即用移液器轻轻搅匀细胞，滴加完成后轻轻搅匀1min；

[0046] (9)向混合细胞液中逐滴加入预热的无血清RPMI‑1640完全培养基，加入的同时轻轻搅匀，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入lml，2ml，3ml，4ml，5ml，10ml，最后补加无血清RPMI‑1640完全培养基至50ml；

[0047] (10)离心，1000rpm离心5mim，弃上清，加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开；

[0048] (11)补加HAT和RPMI‑1640完全培养基和1％MagicTM杂交瘤细胞克隆因子，将融合5
后细胞悬液加5个96孔板内，1×10个细胞/(150μl/孔)，放入37℃细胞培养箱中，5％CO2及饱和湿度条件下培养。

[0049] (12)融合后第14天，收集有融合细胞生长的上清进行检测，用间接ELISA法筛选阳性克隆，以骨髓瘤细胞Sp2/0培养上清作为阴性对照；共筛选17株阳性较好的杂交瘤细胞，用有限稀释法进一步克隆化，选择稳定表达的GSK‑3β‑C1和GSK‑3β‑D8二株阳性最强的杂交瘤细胞株备用。

[0050] 将筛选得到的单克隆细胞株以106个细胞/只注入小鼠腹腔制备腹水。待小鼠腹水生成至最大量，脱颈处死小鼠，收集腹水，以间接ELISA法检测腹水抗体效价。采用辛酸硫酸铵法、蛋白A柱对腹水中的抗体进行纯化。

[0051] 以SDS‑PAGE、紫外分光光度法检测抗体纯度和浓度；利用鼠抗体亚型鉴定试剂盒对单克隆抗体进行亚型鉴定，结果如表1所示。

[0052] 表1抗体浓度和亚型

[0053]杂交瘤细胞 抗体浓度(mg/mL) 细胞亚型
GSK‑3β‑C1 12.11±0.55 IgG1
GSK‑3β‑D8 15.32±0.67 IgG2a

[0054] 为验证获得的2株单抗特异性，将二个抗体分别与SEQ ID NO：1、重组人GSK‑3β(Biovision，货号：7004‑100)、GSK‑3β另外抗原片段sidvwsagcv laelllgqpifpgdsgvdqlveiikvlgtptreqiremnp、HCG、BSA进行间接ELISA法检测后对比显示，筛选获得的2株单克隆抗体与其他各类物质间的交叉反应率均小于0.1％，而能够特异性的与GSK‑3β全蛋白以及本发明的免疫原片段反应，这说明其特异性较好(表2)。

[0055] 表2抗体的交叉反应性

[0056]

[0057] 实施例2GSK‑3β‑C1单克隆抗体亲和力及序列特性鉴定

[0058] 利用间接ELISA方法测定单抗的亲和力:以2μg/mL GSK‑3β蛋白包被酶标板，封闭后加入倍比稀释纯化的单抗，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，酶标仪读取OD450nm吸光值，按照本领域常规数据处理方法(A practical guide to monoclonal antibodies)计算－10得到GSK‑3β‑C1单抗亲和力解离常数(Kd)为7.23×10 ，属于高亲和力抗体。

[0059] 利用PCR方法扩增抗体轻重链序列通过测序鉴定得到单抗的轻重链序列分别如下：

[0060] 轻链可变区(SEQ ID NO：2)

[0061] DIVITQRPALMAASPGEKVTITCMLYLRDMKAKSKWYQQKSGISPKPWIYFNTKMSCGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCQSDYREVDVFGAGTKLELK

[0062] 重链可变区(SEQ ID NO：3)

[0063] EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSTFYQVWIKQRPGQGLEWIGVICLEDTYDLLHKELGGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGSIYYSPSWGLGTTLAVSS

[0064] 实施例3 GSK‑3β‑C1单克隆抗体对GSK‑3β的影响

[0065] 人结肠癌细胞HT‑29(HT29)，对数生长期细胞经0.25％的胰酶消化后，以8
2x10cells/L的密度接种于6孔板中，2d后加入不同浓度的单抗(0、1、10、100μmol/L)，阳性对照为BIO(1μmol/L，CAS号：667463‑62‑9，sigma)，继续培养24h，经0.25％不含EDTA的胰酶消化，收集各组细胞，PBS离心重悬1次。采用Western blotting检测GSK‑3β蛋白表达：按蛋白提取试剂盒操作步骤提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度，每泳道加20μg总蛋白进行SDS‑PAGE电泳，湿转将蛋白转移至NC膜，5％脱脂奶粉室温封闭1h，加鼠抗GSK‑3β(1：100)，4℃摇床孵育过夜，TBS‑T洗膜10minx3次，加入相应辣根过氧化物酶标记羊抗鼠及羊抗兔IgG(1：
4000)室温摇床孵育1h，TBS—T洗膜10min×3次后，ECL化学发光系统显色。扫描胶片，QuantityOne软件分析灰度值，计算以β‑actin的表达量作为相对表达量基础，来计算GSK‑3β的相对蛋白含量。实验重复3次。结果如图2所示。

[0066] 从图2的蛋白质印迹法检测结果可以看出，C1单抗和阳性对照组与空白对照组相比，差异显著具有统计学意义(P<0.05),采用100μmol/L C1单抗处理后，GSK‑3β的相对表达量只有(0.03±0.01)，比阳性对照的(0.36±0.06)效果有显著提高。从以上结果可以看出，本发明提供的GSK‑3β‑C1单克隆抗体能够显著的抑制GSK‑3β蛋白的活性。

[0067] 实施例4 GSK‑3β‑C1单克隆抗体对iPSC分化为神经干细胞的影响

[0068] 将iPSC细胞( iPSM0041，三启生物)接种至Matrigel包被的6孔板，加入TMmTeSR 1多能干细胞培养基培养1d，次日(Day1)换为神经分化培养基(DMEM/F12和NeurobasalMedium按1∶1混合，再加入0.5×N2、0.5×B27、0.1mmol/Lascorbicacid、1×Glutamax、1×Antibi‑otic‑Antimycotic)。在此阶段加入利于iPSC向外胚层分化的Smad抑制剂SB和DMH1。同时为了研究GSK‑3β‑C1单克隆抗体对iPSC分化的影响，加入不同浓度的GSK‑3β‑C1单克隆抗体，按不同浓度分0、1、10、100μmol/L(μM)4个实验组，其种0μmol/L组作为对照组，阳性对照为BIO(1μmol/L，CAS号：667463‑62‑9，sigma)，培养6d，隔日换液。分别
6
检测细胞浓度“以6孔板1个孔为单位行细胞计数(单位10 个/孔)”以及NSC标志物SOX1、Nestin的表达情况。结果如图3所示。

[0069] 从图3的结果可以看出，实验组加入单抗的浓度越高，细胞聚集越紧密，细胞数量6
越多，1μmol/L C1单抗组细胞数为(0.70±0.02)×10比阳性对照组细胞数为(0.65±
6 6
0.03)×10的促分化增殖效果明显；100μmol/L C1单抗组细胞数为(1.61±0.05)×10 ，增殖最显著。0μmol/L组与实验组比较差异有统计学意义(P<0.05)。此外，免疫荧光结果示，阳性对照组和各实验组的细胞均表达NSC标志物SOX1、Nestin。说明各组iPSC均已分化为NSC。
其中1μmol/L C1单抗组平均阳性率为92.14％，比阳性对照组的90.53％略有提高，也比高浓度的C1单抗阳性率高。这也表明iPSC分化为NSC，单抗的浓度越高，细胞密度越大，但高浓度组SOX1的表达较其他组低。提示C1单抗可使细胞增殖更加旺盛，一定浓度的抑制剂(1μmol/L)不会影响分化，但高浓度C1单抗则不利于分化。

[0070] 实施例5骨髓间充质干细胞构建类肾器官实验

[0071] 骨髓间充质干细胞(CP‑H166，武汉普诺赛生命科技有限公司)利用含10％胎牛血清的DMEM/F‑12液体培养基培养，传代后需2‑3d达到40％‑50％汇合度，去除培养皿中的含10％胎牛血清的DMEM/F‑12液体培养基，加入含10μmol/L C1单抗的APEL液体培养基，37℃培养4d，每2d更换培养基。4d后换为含有200ng/mlFGF9+1μg/ml肝素的APEL液体培养基。37℃培养至第7天，每2d更换培养基。在第7天，利用胰酶消化细胞后，离心细胞400g，3min，用
5
3ml纯APEL液体培养基重悬细胞。每个类肾器官需要约5×10个细胞，将所需的细胞悬液量吸取进1.5mlEppendorf管。离心400g，2min，弃去上清液，仅剩1个细胞球。将含10μmol/L单抗的APEL液体培养基加入到Transwell培养板中。Transwell过滤器附在培养基表面。把细胞球放在Transwell过滤器上。37℃孵育1h，换为1.2ml含200ng/mlFGF9+1μg/ml肝素的APEL液体培养基培养5d，每2d更换培养基，在第12天更换为纯APEL液体培养基。每2d更换培养基，在纯APEL液体培养基中培养类肾器官至第25天。对照组采用CHIR99021替换本发明的单抗。结果显示，无论是实验组还是对照组，在类肾器官中，均可检测到远端肾小管(ECAD+)、近端肾小管(LTL+)、肾小球(WT1+)和血管(CD31)的荧光标记物，表明初步形成了类肾器官，本发明的抗体能够通过调控Wnt信号而控制后肾间充质的形成比例，从而最终控制肾单位的形成。所述结果显示本发明的C1单抗与CHIR99021作用基本相似，都能够用于骨髓间充质干细胞构建类肾器官。

[0072] 鉴于可以应用所公开的本发明的原理的许多可能的实施例，应当认识到，所示的实施例仅是本发明的优选实施例，而不应当被认为是对本发明范围的限制。相反，本发明的范围由所附权利要求限定。因此，我们要求保护属于这些权利要求的范围和精神之内的所有发明。