一种制备重组白蛋白的细胞转染方法

摘要

本申请涉及一种白蛋白细胞转染方法，属于细胞转染领域。包括以下步骤：1）细胞以及培养基准备；2）分别配置分别含有Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒混合液、含有转染A试剂混合液以及含有转染B试剂混合液；3）将含有转染A试剂混合液转至含有质粒混合液中形成质粒‑PEI复合物；4）将质粒‑PEI复合物滴加至培养基中悬浮培养，再滴加含有转染B试剂混合液；所述转染A试剂包括：γ‑环糊精、鲁斯可皂苷元、羧甲基壳聚糖、聚乙烯亚胺；所述转染B剂包括：丝素、聚赖氨酸、聚乙二醇二缩水甘油醚。本申请的白蛋白细胞转染方法具有高转染效率、低细胞毒性，转染的白蛋白表达水平高，具有良好的应用价值。

权利要求

1.一种制备重组白蛋白的细胞转染方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1）细胞以及培养基准备：转染当天，细胞活率≥90%，100mL培养基的细胞浓度在36

×10 cells/mL左右；

步骤2）配置转染工作液：以KPM缓冲液分别配置5mL的三种混合液，分别为含有100～

150μg 的Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒混合液、含有400～600μL的转染A试剂混合液以及含有400～600μL的转染B试剂混合液；

步骤3）配置质粒‑PEI复合物：将步骤2）的含有转染A试剂混合液转至含有Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒混合液中，室温静置10min，形成质粒‑PEI复合物；

步骤4）质粒‑PEI复合物转染细胞：将步骤3）的制成的质粒‑PEI复合物滴加至步骤1）的培养基中悬浮培养12h，再往培养基中滴加步骤2）的含有转染B试剂混合液；

所述转染A试剂包括：γ‑环糊精0.3ng/mL、鲁斯可皂苷元0.005ng/mL、羧甲基壳聚糖

0.15ng/mL、聚乙烯亚胺5ng/mL；

所述转染B剂包括：丝素6ng/mL、聚赖氨酸2ng/mL、聚乙二醇二缩水甘油醚0.3ng/mL。

2.根据权利要求1所述的一种制备重组白蛋白的细胞转染方法，其特征在于，所述细胞为HEK‑293细胞。

3.根据权利要求2所述的一种制备重组白蛋白的细胞转染方法，其特征在于，100mL含有HEK‑293细胞的培养基投加含有100μg 的Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒混合液。

4.根据权利要求2所述的一种制备重组白蛋白的细胞转染方法，其特征在于，100mL含有HEK‑293细胞的培养基投加含有500μL的转染A试剂混合液以及含有500μL的转染B试剂混合液。

5.根据权利要求1所述的一种制备重组白蛋白的细胞转染方法，其特征在于，所述转染A剂的制备方法为：在20KHz的超声震荡和200RPM的搅拌条件下，往γ‑环糊精溶液中依次缓慢滴加鲁斯可皂苷元溶液、羧甲基壳聚糖溶液，滴加结束后继续搅拌6h，然后再缓慢滴加聚乙烯亚胺溶液，滴加结束后继续搅拌12h，用0.2μm滤膜过滤，与KPM缓冲液混合，得到转染A剂。

6.根据权利要求1所述的一种制备重组白蛋白的细胞转染方法，其特征在于，所述转染B剂的制备方法为：在20KHz的超声震荡和200RPM的搅拌条件下，往含有丝素的溶液中依次缓慢滴加聚赖氨酸溶液、聚乙二醇二缩水甘油醚溶液，滴加结束后继续搅拌10h，用0.2μm滤膜过滤，与KPM缓冲液混合，得到转染B剂。

7.根据权利要求6所述的一种制备重组白蛋白的细胞转染方法，其特征在于，溶解所述丝素的溶液以质量比为1: (3～4): (5～6)的氯化钙、乙醇和水混合制得。

8.根据权利要求1所述的一种制备重组白蛋白的细胞转染方法，其特征在于，所述转染B试剂的丝素为ASF丝素。

说明书

一种制备重组白蛋白的细胞转染方法

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞转染领域，尤其是涉及一种白蛋白细胞转染方法。

背景技术

[0002] 白蛋白（albumin，又称清蛋白）是人体血浆中最主要的蛋白质，维持机体营养与渗透压，因此在医学应用上需求量较大，一般通过天然提取或体外重组获得，由于天然蛋白提取自动物组织，而重组蛋白是通过基因工程重组而来的，因此，重组获得的白蛋白相比天然提取的白蛋白具有更高的活性与纯度，有利于人体更好地吸收利用，安全性方面也能够得到更好的保障。

[0003] 基因重组过程是指通过载体（质粒）转染至工程细胞中，使其携带有目的蛋白基因片段，再利用细胞培养表达目标蛋白。目前，白蛋白细胞的转染一般通过将Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)质粒与阳离子聚合物转染剂复配制得质粒‑阳离子聚合物的复合成分，再将该复合成分投加于含有HEK293细胞或CHO细胞的培养基中，利用电荷的吸附作用，将质粒吸附于带有负电荷的细胞膜上，从而通过细胞的内吞作用使质粒进入细胞膜中，完成白蛋白细胞转染。

[0004] 阳离子聚合物转染的效率与阳离子聚合物的分子量、支链化程度、阳离子电荷密度呈正相关，但是，阳离子聚合物会对工程细胞有一定的细胞毒性，阳离子聚合物的分子量越大、支链化程度越高、阳离子电荷密度越大，对细胞的毒害性就越高，因此，为了提高转染后细胞的存活率，使得后续的细胞培养能够具有高量的目标蛋白表达，对阳离子聚合物的选择会有一定的局限性，从而导致白蛋白的细胞转染效率不尽人意，有待进一步改进。

发明内容

[0005] 为了解决上述技术问题，本申请提供一种白蛋白细胞转染方法，采用如下的技术方案：

[0006] 一种白蛋白细胞转染方法，包括以下步骤：

[0007] 步骤1）细胞以及培养基准备：转染当天，细胞活率≥90%，100mL培养基的细胞浓度6
在3×10 cells/mL左右；

[0008] 步骤2）配置转染工作液：分别以KPM缓冲液配置分别配置15mL的三种混合液，分别为含有100～150μg 的Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒混合液、含有400～600μL的转染A试剂混合液以及含有400～600μL的转染B试剂混合液；

[0009] 步骤3）配置质粒‑PEI复合物：将步骤2）的含有转染A试剂混合液转至含有Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒混合液中，室温静置10min，形成质粒‑PEI复合物；

[0010] 步骤4）质粒‑PEI复合物转染细胞：将步骤3）的制成的质粒‑PEI复合物滴加至步骤1）的培养基中悬浮培养12h，再往培养基中滴加步骤2）的含有转染B试剂混合液；

[0011] 所述转染A试剂包括：γ‑环糊精0.3ng/mL、鲁斯可皂苷元0.005ng/mL、羧甲基壳聚糖0.15ng/mL、聚乙烯亚胺5ng/mL；

[0012] 所述转染B剂包括：丝素6ng/mL、聚赖氨酸2ng/mL、聚乙二醇二缩水甘油醚0.3ng/mL。

[0013] 优选的，100mL含有HEK‑293细胞的培养基投加含有100μg 的Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒混合液。

[0014] 优选的，100mL含有HEK‑293细胞的培养基投加含有500μL的转染A试剂混合液以及含有300μL的转染B试剂混合液。

[0015] 通过采用以上转染方法，首先采用含有鲁斯可皂苷元的阳离子PEI聚合物转染剂进行细胞转染，利用转染A剂中聚乙烯亚胺的阳离子与表面带负电的细胞吸附作用，使得含有Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒吸附于细胞膜表面，同时，质粒上带有的微量鲁斯可皂苷元能够降低细胞膜通透性，促进提高细胞对质粒的内吞作用，使得转染效率明显提高，此外，通过在质粒转染效率接近平台后投加转染B剂，利用含有丝素的胞吞后的张力较低的细胞膜部位处具有的生物修复作用，使得细胞膜在转染后存活条件得到改善，从而大幅提高了转染后细胞活性，使得细胞转染效率得到进一步的提升，有利于更好地稳定转染获取表达水平更高的重组白蛋白产物。

[0016] 优选的，所述培养基细胞为HEK‑293细胞。

[0017] 通过以HEK‑293细胞作为重组白蛋白工程细胞，具有更理想的转染稳定性以及蛋白表达水平。

[0018] 优选的，所述转染A剂的制备方法为：在20KHz的超声震荡和200RPM的搅拌条件下，往γ‑环糊精溶液中依次缓慢滴加鲁斯可皂苷元溶液、羧甲基壳聚糖溶液，滴加结束后继续搅拌6h，然后再缓慢滴加聚乙烯亚胺溶液，滴加结束后继续搅拌12h，用0.2μm滤膜过滤，与KPM缓冲液混合，得到转染A剂。

[0019] 通过采用上述制备方法，利用静电作用原理，把带有负电荷的羧甲基壳聚糖簇拥鲁斯可皂苷元自组装至γ‑环糊精上，并通过羧甲基壳聚糖与聚乙烯亚胺的氢键结合，从而将鲁斯可皂苷元引入至聚乙烯亚胺上。

[0020] 优选的，所述转染B剂的制备方法为：在20KHz的超声震荡和200RPM的搅拌条件下，往含有丝素的溶液中依次缓慢滴加聚赖氨酸溶液、聚乙二醇二缩水甘油醚溶液，滴加结束后继续搅拌10h，用0.2μm滤膜过滤，与KPM缓冲液混合，得到转染B剂。

[0021] 通过采用上述制备方法，聚乙二醇二缩水甘油醚促使聚赖氨酸与丝素交联结合，利用聚赖氨酸中含有的多酚结构基元作为粘附位点，使得丝素更好地吸附于细胞膜上而起到修复作用。

[0022] 优选的，溶解所述丝素的溶液以质量比为1:3:6的氯化钙、乙醇和水混合制得。

[0023] 优选的，所述转染B试剂的丝素为ASF丝素。

[0024] 通过将含有ASF丝素与胞吞质粒后的细胞混合，由于ASF丝素含有由特殊的天门冬氨酸‑甘氨酸‑精氨酸三肽结构，使其与HEK‑293细胞具有更好的吸附效果与修复效果。

[0025] 溶解所述丝素的溶液以质量比为1: (3～4): (5～6)的氯化钙、乙醇和水混合制得。

[0026] 通过将氯化钙、乙醇和水以特定配比混合，能够更好地溶解丝素，提高丝素利用率。

[0027] 综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：

[0028] 1.通过对含有Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)白蛋白基因片段的质粒采用两步法转染，首先利用含有γ‑环糊精、鲁斯可皂苷元、羧甲基壳聚糖的聚乙烯亚胺阳离子质粒载体与细胞混合，通过电荷吸附作用与细胞膜通透性降低作用，有助于质粒更好地通过内吞作用进入细胞中，然后再利用含有丝素、聚赖氨酸、聚乙二醇二缩水甘油醚的混合液与细胞混合，使得胞吞部位处的细胞膜得到良好的修复作用，从而使细胞活性提高，大幅降低了阳离子聚合物对细胞的毒害性，最终使得白蛋白细胞转染效率得到明显的提升；

[0029] 2.通过对Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒、转染A试剂以及转染B试剂之间采用特定范围的投加比，使得白蛋白细胞转染效率以及细胞毒性之间维持较好的平衡，有利于更好地提高白蛋白产物的表达水平。

附图说明

[0030] 图1是本申请实施例1的重组白蛋白电泳图谱。

具体实施方式

[0031] 以下结合实施例和性能检测结果对本申请作进一步详细说明。

[0032] 实施例1

[0033] 一种白蛋白细胞转染方法，包括以下步骤：

[0034] 步骤1）细胞以及培养基准备：

[0035] 1.1）准备好30～50支HEK‑293细胞，细胞浓度在1×107～2×107cells/支，细胞活率≥90%，转染前一周，复苏准备细胞，扩增细胞，适时传代，使细胞保持在指数生长期；

[0036] 1.2）转染前一天，对HEK‑293细胞稀释传代至细胞浓度在2×106 cells/mL左右，于135RPM、37℃、5%CO2饱和湿度条件下悬浮培养；

[0037] 1.3）转染当天，细胞计算，保证细胞活率≥90%，用新鲜培养基稀释到细胞浓度在36
×10 cells/mL左右，100mL/瓶，完成细胞及其培养基准备。

[0038] 步骤2）配置转染工作液：

[0039] 准备三只15mL的无菌离心管；一支加入5mL KPM缓冲液和100μg 含有Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)基因片段的质粒，轻轻混匀，获得含有白蛋白质粒DNA混合液；一支加入5mL KPM缓冲液和50μL 转染A试剂，轻轻混匀，获得A剂混合液；一支加入5mL KPM缓冲液和
50μL 转染B试剂，获得B剂混合液。

[0040] 步骤3）配置质粒‑PEI复合物：

[0041] 将步骤2）配置好的A剂混合液转至含有白蛋白质粒DNA混合液的离心管中，轻轻混匀，室温静置10min，形成质粒‑PEI复合物，质粒‑PEI复合物的静置制备过程以及制备后不可剧烈晃动。

[0042] 步骤4）质粒‑PEI复合物转染HEK‑293细胞：

[0043] 将步骤3）制成的质粒‑PEI复合物缓慢滴加至步骤1）准备好的含有HEK‑293细胞的培养基中，边滴加边轻轻摇动，滴加完成后转至135RPM、37℃、5%CO2饱和湿度条件下悬浮培养12h，往培养基中缓慢滴加B剂混合液，边滴加边轻轻摇动，完成转染。

[0044] 实施例1使用的转染A剂与转染B剂的制备方法如下：

[0045] 转染A剂：以5mL/min的滴加速度依次往200mL的30g/L的γ‑环糊精溶液中滴加投入2g/L的鲁斯可皂苷元溶液50mL、20g/L的羧甲基壳聚糖溶液150mL，滴加过程保持20KHz的超声震荡和200RPM的搅拌，滴加结束后停止超声并继续搅拌6h，然后再以2mL/min的滴加速度滴加投入500g/L聚乙烯亚胺溶液200mL，滴加过程同样保持20KHz的超声震荡和200RPM的搅拌，滴加结束后停止超声并继续搅拌12h，最后用0.2μm滤膜过滤，与KPM缓冲液混合，得到转染A剂，转染A剂成分中含有0.3ng/mL的γ‑环糊精、0.005ng/mL的鲁斯可皂苷元、0.15ng/mL的羧甲基壳聚糖以及5ng/mL的聚乙烯亚胺。

[0046] 转染B剂：取3g的ASF丝素溶解于100mL的氯化钙、乙醇和水的三元体系溶液中，氯化钙、乙醇和水的质量比为1:4:5，再以5mL/min的滴加速度依次滴加20g/L的聚赖氨酸溶液50mL、3g/L聚乙二醇二缩水甘油醚溶液50mL，滴加过程保持20KHz的超声震荡和200RPM的搅拌，滴加结束后停止超声并继续搅拌10h，最后用0.2μm滤膜过滤，与KPM缓冲液混合，得到转染B剂，转染B剂成分中含有6ng/mL的ASF丝素、2ng/mL的聚赖氨酸以及0.3ng/mL的聚乙二醇二缩水甘油醚。

[0047] 实施例2

[0048] 一种白蛋白细胞转染方法，与实施例1的不同之处在于步骤2）：

[0049] 准备三只15mL的无菌离心管；一支加入5mL KPM缓冲液和100μg 含有Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)基因片段的质粒，轻轻混匀，获得含有白蛋白质粒DNA混合液；一支加入5mL KPM缓冲液和400μL 转染A试剂，轻轻混匀，获得A剂混合液；一支加入5mL KPM缓冲液和
600μL 转染B试剂，获得B剂混合液。

[0050] 实施例3

[0051] 一种白蛋白细胞转染方法，与实施例1的不同之处在于步骤2）：

[0052] 步骤2）配置转染工作液：

[0053] 准备三只15mL的无菌离心管；一支加入5mL KPM缓冲液和100μg 含有Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)基因片段的质粒，轻轻混匀，获得含有白蛋白质粒DNA混合液；一支加入5mL KPM缓冲液和600μL 转染A试剂，轻轻混匀，获得A剂混合液；一支加入5mL KPM缓冲液和
400μL 转染B试剂，获得B剂混合液。

[0054] 实施例4

[0055] 一种白蛋白细胞转染方法，与实施例1的不同之处在于步骤2）：

[0056] 步骤2）配置转染工作液：

[0057] 准备三只15mL的无菌离心管；一支加入5mL KPM缓冲液和150μg 含有Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)基因片段的质粒，轻轻混匀，获得含有白蛋白质粒DNA混合液；一支加入5mL KPM缓冲液和50μL 转染A试剂，轻轻混匀，获得A剂混合液；一支加入5mL KPM缓冲液和
50μL 转染B试剂，获得B剂混合液。

[0058] 实施例5

[0059] 一种白蛋白细胞转染方法，与实施例1的不同之处在于转染B剂，转染B剂的制备方法如下：

[0060] 取3g的BSF丝素溶解于100mL的氯化钙、乙醇和水的三元体系溶液中，氯化钙、乙醇和水的质量比为1:3:6，再滴加过程保持20KHz的超声震荡和200RPM的搅拌，滴加结束后停止超声并继续搅拌10h，最后用0.2μm滤膜过滤，与KPM缓冲液混合，得到转染B剂，转染B剂成分中含有6ng/mL的BSF丝素、2ng/mL的聚赖氨酸以及0.3ng/mL的聚乙二醇二缩水甘油醚。

[0061] 对比例1，与实施例1的不同之处在于，对比例1以市售的PEI型转染剂作为转染A试剂进行滴加。

[0062] 对比例2，与实施例1的不同之处在于，对比例2的步骤4）中不投加B剂混合液。

[0063] 对比例3，与实施例1的不同之处在于，对比例3以市售的PEI型转染剂作为转染A试剂进行滴加，且不投加B剂混合液。

[0064] 对比例4，与实施例1的不同之处在于，对比例4的B剂混合液在步骤2）A剂混合液转至含有白蛋白质粒DNA混合液的离心管摇晃2min后剂投加。

[0065] 性能检测试验

[0066] 分别对实施例1‑5以及对比例1‑3转染后的培养基进行转染效率、细胞存活率以及蛋白浓度的测定。

[0067] 1.重组蛋白电泳图谱扫描分析：

[0068] 对实施例1‑5以及对比例1‑4的重组白蛋白进行PCR电泳图谱扫描，确定实施例1‑5以及对比例1‑4的白蛋白基因片段表达成功，附图1为实施例1的重组白蛋白电泳图谱。

[0069] 2.转染效率测定：

[0070] 将转染完成后将培养基转至135RPM、37℃、5%CO2饱和湿度条件下悬浮培养24h，在荧光显微镜下观测细胞转染情况，以10个视野作观测分析，以绿色荧光细胞数与总细胞数之比计算转染率。

[0071] 3.细胞存活率测定：

[0072] 以Egfp/ pcDNA3.1作为非转然对照组，转染48h后，采用CCK‑8法测定细胞存活率，以酶标仪测定转染OD值与非转染OD值之比计算细胞存活率。

[0073] 4.蛋白浓度测定：

[0074] 转染后第6天，取转染细胞进行酶联免疫吸附夹心法检测，以罗丹明作为荧光标记抗体添加，做表达蛋白标准曲线，在荧光酶标仪中检测本底数据与实验数据，两数相减，代入标曲得到表达蛋白浓度。

[0075] 检测数据如下表所示：实验组别 转染效率（%） 细胞存活率（%） 蛋白浓度（ng/mL）
实施例1 96.5 97.4 1174
实施例2 95.8 98.1 1118
实施例3 97.2 94.9 1096
实施例4 96.0 96.8 1142
实施例5 95.3 95.6 1027
对比例1 87.3 95.4 884
对比例2 92.4 79.2 832
对比例3 84.1 90.8 815
对比例4 82.8 91.4 824

[0076] 从细胞转染效率、细胞存活率以及蛋白浓度的检测结果上看，通过将含有γ‑环糊精、鲁斯可皂苷元、羧甲基壳聚糖以及聚乙烯亚胺阳的转染A剂以及含有丝素、聚赖氨酸、聚乙二醇二缩水甘油醚的转染B剂配合进行细胞转染，相比目前大多采用的PEI阳离子聚合物转染剂具有更高的转染效率以及更高的细胞存活率，结合实施例1与对比例1‑4的检测结果分析，转染A剂与转染B剂单独投加的最终白蛋白表达水平较为不理想，只有当转染A剂与转染B剂配合添加，且以特定的次序与间隔时间操作投加，才能够起到提高即使转染效率与提高细胞存活率的作用，最终使白蛋白表达浓度达到理想的水平。

[0077] 从实施例1‑4的检测数据对比可以看出，将含有Albumin‑His tag/pcDNA3.1(+)基因片段质粒的混合液、含有转染A试剂的混合液以及含有转染B试剂的混凝土之间采用100μg/500μL/500μL的投加比效果更优，能够对细胞的毒性较低，同时具有较高的白蛋白细胞转染效率。

[0078] 从实施例1相比实施例5具有更高的细胞转染率与细胞存活率，说明ASF丝素相比BSF丝素对于白蛋白细胞的转染过程有更好的促进转染与提高细胞活性的效果。

[0079] 本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。