一种阿托西班的合成方法

摘要

本发明属于多肽合成领域，公开了一种阿托西班的合成方法，该方法包括以下步骤：合成Fmoc‑Pro‑Orn‑Gly‑NH2三肽，以三苯甲基型树脂为起始树脂，制得Fmoc‑Pro‑Orn(三苯甲基型树脂)‑Gly‑NH2；采用缩合剂依次接入阿托西班序列中相应的保护氨基酸或片段，制得阿托西班线性肽树脂；经裂解、氧化得到阿托西班。本发明有效减少了tBu类杂质的生成，可以减少Pro缺失肽杂质的问题，是一种操作简便，质量易于控制，利于纯化和提升产品质量的阿托西班合成方法。

权利要求

1.一种固相合成阿托西班的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

1)合成得到Fmoc‑Pro‑Orn‑Gly‑NH2三肽，之后用树脂与之反应得到Fmoc‑Pro‑Orn(树脂)‑Gly‑NH2；

2)脱除Fmoc‑Pro‑Orn(树脂)‑Gly‑NH2的Fmoc保护，之后采用缩合剂依次接入阿托西班序列中相应的保护氨基酸或片段，制得阿托西班线性肽树脂；

3)裂解、氧化，得到阿托西班。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中树脂选自能与Orn的侧链氨基官能团结合的聚合物树脂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤中的聚合物树脂选自三苯甲基型树脂。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述树脂的替代度为0.8～1.0mmol/g。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中三肽在DIEA作用下与树脂反应生成三肽树脂。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)具体为：在Fmoc‑Pro‑Orn(树脂)‑Gly‑NH2肽树脂上依次偶联Fmoc‑Cys(Trt)‑OH、Fmoc‑Asn‑OH、Fmoc‑Thr‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑D‑Tyr(Et)‑OH、Mpa(Trt)‑OH得到Mpa(Trt)‑D‑Tyr(Et)‑Ile‑Thr‑Asn‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(三苯甲基型树脂)‑Gly‑NH2。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中接入的阿托西班序列中相应的片段选自Mpa(Trt)‑D‑Tyr(Et)‑OH、Fmoc‑D‑Tyr(Et)‑Ile‑OH、Fmoc‑Asn‑Cys(Trt)‑OH。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中缩合剂选自HOBt/DIC、HCTU/DIEA、HBTU/DIEA、HATU/HOAt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA中任意一种。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)裂解试剂选自TFA/DCM，其体积比为TFA：DCM＝1：99～20：80。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中氧化剂选自碘、过氧化氢。

说明书

一种阿托西班的合成方法

技术领域

[0001] 本发明涉及多肽合成领域，尤其涉及一种阿托西班的合成方法。

背景技术

[0002] 阿托西班注射液(AtosibanAcetate Injection)2000年3月23日首次在奥地利上市，商品名为： 阿托西班(Atosiban)，一种由Ferring Gmbh研制的新型抗早产药，是一种催产素类似物，是子宫内及蜕膜、胎膜上催产素受体的竞争性拮抗剂，是欧洲医学会推荐的一线用药；它可以抑制催产素和催产素受体结合，从而直接抑制催产素作用于子宫，抑制子宫收缩；也可以抑制磷脂酰肌醇的水解作用。

[0003] 阿托西班是一个环九肽，其分子式为C43H67N11O12S2；分子量为994.19；CAS登记号为90779‑69‑4；其肽序如下式所示：

[0004] Cyclo[Mpa‑D‑Tyr(Et)‑Ile‑Thr‑Asn‑Cys]‑Pro‑Orn‑Gly‑NH2

[0005] 公告号为CN101314613B和CN101696236B的中国专利中，阿托西班的固相合成使用Rink Amide AM Resin树脂固相逐步偶联得到Mpa(Trt)‑D‑Tyr(Et)‑Ile‑Thr(tBu)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑Resin，直接固相氧化生成二硫键，再裂解得到阿托西班。现有技术中采用的Rink Amide AM Resin树脂需要在强酸性环境下才能裂解下来，不利于产品稳定且操作危险性较大；Mpr和Cys都有巯基，巯基有捕获tBu的能力生成双tBu杂质，固相氧化后的肽树脂在裂解脱除保护基和树脂时，由于有tBu或tBu源的Boc保护基，对捕获剂要求高，不利于产品质量控制，降低产品收率。

[0006] 公告号为CN105408344B的中国专利，公开了一种由Fmoc‑Orn‑Gly‑NH2起始合成阿托西班的方法，其中Fmoc‑Orn‑Gly‑NH2通过鸟氨酸的侧链连接于三苯甲基树脂上，可以有效控制杂质。然而使用二肽与三苯甲基型树脂偶联，二肽Orn侧链上接入的树脂导致后续Pro偶联的空间位阻增大，偶联时间延长，易造成缺失肽杂质。

[0007] 因此，需要寻找一种便于偶联和裂解，有利于产品质量稳定，方便安全操作，产品质量可控，提升产品收率的阿托西班合成方法。

发明内容

[0008] 针对现有技术中存在异构体、插入肽、tBu阳离子捕获杂质以及位阻和反应时间过长导致Pro缺失肽杂质的问题，本发明提供了一种阿托西班的合成方法，所述方法包括如下步骤：

[0009] 1)合成得到Fmoc‑Pro‑Orn‑Gly‑NH2三肽，之后用树脂与之反应得到Fmoc‑Pro‑Orn(树脂)‑Gly‑NH2肽树脂；

[0010] 2)脱除Fmoc‑Pro‑Orn(树脂)‑Gly‑NH2的Fmoc保护，之后采用缩合剂依次接入阿托西班序列中相应的保护氨基酸或片段，制得阿托西班线性肽树脂；

[0011] 3)裂解、氧化，得到阿托西班。

[0012] 在本发明优选的实施方案中，步骤1)中树脂采用能与Orn的侧链氨基官能团结合的聚合物树脂。进一步优选的，所述聚合物树脂选自三苯甲基型树脂。其中三苯甲基型树脂具体为三苯甲基树脂、2‑氯‑三苯甲基树脂、4‑甲基‑三苯甲基树脂、4‑甲氧基‑三苯甲基树脂。

[0013] 此工艺既要考虑能将三肽偶联在树脂上，又要考虑将肽较容易的切割下来。三苯甲基型树脂是指含有三苯基甲基结构的树脂，易与氨基反应，使用温和的条件即可裂解，易脱除，符合条件。使用三苯甲基型树脂，三肽可以偶联在三苯基甲基上。

[0014] 在本发明优选的实施方案中，步骤1)中树脂的替代度为0.8～1.0mmol/g，替代度过低成本增加，替代度过高偶联困难。

[0015] 在本发明优选的实施方案中，步骤1)中三肽在DIEA作用下与树脂反应生成三肽树脂。DIEA作为碱有助于推动整个反应的进行。

[0016] 在本发明优选的实施方案中，步骤2)具体为：在Fmoc‑Pro‑Orn(树脂)‑Gly‑NH2肽树脂上依次偶联Fmoc‑Cys(Trt)‑OH、Fmoc‑Asn‑OH、Fmoc‑Thr‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑D‑Tyr(Et)‑OH、Mpa(Trt)‑OH得到Mpa(Trt)‑D‑Tyr(Et)‑Ile‑Thr‑Asn‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(三苯甲基型树脂)‑Gly‑NH2。

[0017] 在本发明优选的实施方案中，步骤2)中接入的阿托西班序列中相应的片段选自Mpa(Trt)‑D‑Tyr(Et)‑OH、Fmoc‑D‑Tyr(Et)‑Ile‑OH、Fmoc‑Asn‑Cys(Trt)‑OH。

[0018] 在本发明优选的实施方案中，步骤2)中缩合剂选自HOBt/DIC、HCTU/DIEA、HBTU/DIEA、HATU/HOAt/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA中任意一种。更优选的，缩合剂选择HOBt/DIC。

[0019] 在本发明优选的实施方案中，步骤3)裂解试剂选自TFA/DCM，裂解试剂配比进一步优选为TFA：DCM＝1：99～20：80。低浓度的TFA即可将肽和树脂分离，保证已环化肽链的稳定性，同时Trt脱落也不需要高浓度的酸。

[0020] 在本发明优选的实施方案中，步骤3)中氧化剂选自碘、过氧化氢。

[0021] 本发明在合成Fmoc‑Pro‑Orn‑Gly‑NH2三肽后与树脂偶联，可以减少因位阻和反应时间延长导致Pro缺失肽杂质的问题；以三苯甲基型树脂作为起始树脂，Fmoc‑Pro‑Orn(三苯甲基型树脂)‑Gly‑NH2为中间体，将三肽中Orn的活性基团‑NH2挂在树脂上偶联减少一个Boc保护基，同时采用Fmoc‑Thr‑OH，进而减少tBu类杂质的生成，提高主峰纯度，增加收率；使用对酸敏感的树脂，在弱酸性条件下切割肽，仅需裂解一次，保护基即可完全脱除，操作方便安全。使用本发明得到的阿托西班产品质量可控收率高，利于纯化和提升产品质量，同时操作安全方便，后处理简单，溶剂可回收，降低生产成本，适合工业化生产。

附图说明

[0022] 图1为采用实施例10制得的阿托西班粗肽HPLC谱图。

[0023] 图2为采用实施例14制得的阿托西班精肽HPLC谱图。

具体实施方式

[0024] 下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。

[0025] 实施例1、Fmoc‑Pro‑Orn‑Gly‑NH2三肽的合成

[0026] 称取Fmoc‑Pro‑OH(134.94g，400mmol)和N‑羟基琥珀酰亚胺(46.00g，400mmol)加入到四氢呋喃1600ml中，室温搅拌。控温5℃左右，缓慢地加DCC(90.72g，440mmol)的四氢呋喃(320ml)溶液室温搅拌2.5h，过滤，浓缩后加入到石油醚中重结晶析出固体，洗涤后干燥，将得到的活化酯固体溶于四氢呋喃400ml中，将H‑Orn(Boc)‑NH2(92.92g，400mmol)溶于四氢呋喃300ml缓慢的滴加入上述溶液中，滴完室温下继续反应，监控原料反应完全，过滤，滤液减压浓缩干，加入N‑羟基琥珀酰亚胺(46.00g，400mmol)和四氢呋喃1600ml溶解，室温搅拌。控温5℃左右，缓慢地加DCC(90.72g，440mmol)的四氢呋喃(320ml)溶液室温搅拌2.5h，过滤，浓缩后加入到石油醚中重结晶析出固体，洗涤后干燥，将得到的活化酯固体溶于四氢呋喃400ml中，将H‑Gly‑NH2(29.64g，400mmol)溶于四氢呋喃300ml缓慢的滴加入上述溶液中，滴完室温下继续反应，监控原料反应完全，过滤，滤液减压浓缩干，向反应液中加入1000mL浓度为5％的TFA/DCM溶液，继续反应1h，浓缩干，得黄色油状物，用异丙醇重结晶得到白色固体171.56g，收率69％。

[0027] 实施例2、取代度为0.42mmol/g的Fmoc‑Pro‑Orn(三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2肽树脂的合成

[0028] 称取三苯甲基树脂(37.5g，30mmol，替代度：0.80mmol/g)于固相反应合成柱中。加入400mL干燥的DMF溶胀30min，抽去DMF。用3*400mL干燥的DMF洗涤树脂，抽去DMF。加入实施例1制得的Fmoc‑Pro‑Orn‑Gly‑NH2(37.30g，60mmol)，DIEA(11.63g，90mmol)，加入100mL干燥DMF溶解澄清，加入到树脂中反应2h，加入甲醇(9.61g，300mmol)反应20min，抽干，用3*400mL的CH2Cl2洗涤树脂，抽去CH2Cl2。取出树脂，25～35℃真空干燥，得到Fmoc‑Pro‑Orn(三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2树脂52.14g，测得取代度0.42mmol/g。

[0029] 实施例3、取代度为0.50mmol/g的Fmoc‑Pro‑Orn(2‑CTC Resin)‑Gly‑NH2肽树脂的合成

[0030] 称取2‑CTC Resin树脂(30.0g，30mmol，替代度：1.00mmol/g)于固相反应合成柱中。加入400mL干燥的DMF溶胀30min，抽去DMF。用3*400mL干燥的DMF洗涤树脂，抽去DMF。加入实施例1制得的Fmoc‑Pro‑Orn‑Gly‑NH2(37.30g，60mmol)，DIEA(11.63g，90mmol)，加入100mL干燥DMF溶解澄清，加入到树脂中反应2h，加入甲醇(9.61g，300mmol)反应20min，抽干，用3*400mL的CH2Cl2洗涤树脂，抽去CH2Cl2。取出树脂，25～35℃真空干燥，得到Fmoc‑Pro‑Orn(2‑CTC Resin)‑Gly‑NH2树脂43.80g，测得取代度0.50mmol/g。

[0031] 实施例4、取代度为0.50mmol/g的Fmoc‑Pro‑Orn(4‑甲基‑三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2肽树脂的合成

[0032] 称取4‑甲基‑三苯甲基树脂(33.33g，30mmol，替代度：0.90mmol/g)于固相反应合成柱中。加入400mL干燥的DMF溶胀30min，抽去DMF。用3*400mL干燥的DMF洗涤树脂，抽去DMF。加入实施例1制得的Fmoc‑Pro‑Orn‑Gly‑NH2(37.30g，60mmol)，DIEA(11.63g，90mmol)，加入100mL干燥DMF溶解澄清，加入到树脂中反应2h，加入甲醇(9.61g，300mmol)反应20min，抽干，用3*400mL的CH2Cl2洗涤树脂，抽去CH2Cl2。取出树脂，25～35℃真空干燥，得到Fmoc‑Pro‑Orn(4‑甲基‑三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2树脂43.89g，测得取代度0.50mmol/g。

[0033] 实施例5、取代度为0.50mmol/g的Fmoc‑Pro‑Orn(4‑甲氧基‑三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2肽树脂的合成

[0034] 称取4‑甲氧基‑三苯甲基树脂(30.0g，30mmol，替代度：1.00mmol/g)于固相反应合成柱中。加入400mL干燥的DMF溶胀30min，抽去DMF。用3*400mL干燥的DMF洗涤树脂，抽去DMF。加入实施例1制得的Fmoc‑Pro‑Orn‑Gly‑NH2(37.30g，60mmol)，DIEA(11.63g，90mmol)，加入100mL干燥DMF溶解澄清，加入到树脂中反应2h，加入甲醇(9.61g，300mmol)反应20min，抽干，用3*400mL的CH2Cl2洗涤树脂，抽去CH2Cl2。取出树脂，25～35℃真空干燥，得到Fmoc‑Pro‑Orn(4‑甲氧基‑三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2树脂43.69g，测得取代度0.50mmol/g。

[0035] 实施例6、阿托西班线性肽树脂的合成1

[0036] 称取实施例2制得的Fmoc‑Pro‑Orn(三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2(35.71g)于固相反应合成柱中。加入400mL的DMF溶胀30min，抽去DMF。用3*200mL干燥的DMF洗涤树脂，抽去DMF。加入200mL的DBLK溶液(20％哌啶/DMF溶液,V/V)，脱保护两次，第一次5min，第二次15min。
脱保护完每次用200mL DMF洗涤树脂，洗涤6遍，第4次洗涤完毕，用玻璃棒取少许树脂，茚三酮检测呈阳性，表明Fmoc已脱。

[0037] 称取17.57g Fmoc‑Cys(Trt)‑OH和4.86g HOBt，加入100mL DMF溶解，待完全溶解后，将溶液冷却至5℃以下，然后加入5.68g DIC(预冷至<0℃),于溶液中活化约3～5min，将活化后的溶液控制加入反应柱中，在20～35℃下反应2～3h，茚三酮检测呈阴性，抽掉反应液，加入200mL的DMF洗涤树脂，洗涤6遍。洗毕后，抽除洗涤液，得到Fmoc‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2。

[0038] 重复接肽反应步骤及去除Fmoc保护基的操作，按照阿托西班氨基酸序列，在Fmoc‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2上依次偶联Fmoc‑Asn‑OH、Fmoc‑Thr‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑D‑Tyr(Et)‑OH、Mpa(Trt)‑OH得到Mpa(Trt)‑D‑Tyr(Et)‑Ile‑Thr‑Asn‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2。DMF洗毕后，抽除洗涤液。再每次用200ml DCM洗涤树脂，洗涤4遍，5min/次，抽掉DCM，树脂在室温(20～35℃)下真空抽干至呈流沙状。肽树脂干燥完后为48.72g,树脂增重率89.0％。

[0039] 实施例7、阿托西班线性肽树脂的合成2

[0040] 称取实施例3制得的Fmoc‑Pro‑Orn(2‑CTC Resin)‑Gly‑NH2(30.00g)于固相反应合成柱中。加入400mL的DMF溶胀30min，抽去DMF。用3*200mL干燥的DMF洗涤树脂，抽去DMF。加入200mL的DBLK溶液(20％哌啶/DMF溶液,V/V)，脱保护两次，第一次5min，第二次15min。
脱保护完每次用200mL DMF洗涤树脂，洗涤6遍，第4次洗涤完毕，用玻璃棒取少许树脂，茚三酮检测呈阳性，表明Fmoc已脱。

[0041] 称取17.57g Fmoc‑Cys(Trt)‑OH和13.65g HBTU，加入100mL DMF溶解，待完全溶解后，将溶液冷却至5℃以下，然后加入5.82g DIEA(预冷至<0℃),于溶液中活化约3～5min，将活化后的溶液控制加入反应柱中，在20～35℃下反应2～3h，茚三酮检测呈阴性，抽掉反应液，加入200mL的DMF洗涤树脂，洗涤6遍。洗毕后，抽除洗涤液，得到Fmoc‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(2‑CTC Resin)‑Gly‑NH2。

[0042] 称取Fmoc‑D‑Tyr(Et)‑OH(86.30g，200mmol)和N‑羟基琥珀酰亚胺(23.00g，200mmol)加入到四氢呋喃800ml中，室温搅拌。控温5℃左右，缓慢地加DCC(45.36g，
220mmol)的四氢呋喃(160ml)溶液室温搅拌2.5h，过滤，浓缩后加入到石油醚中重结晶析出固体，洗涤后干燥，将得到的活化酯固体溶于四氢呋喃200ml中，将H‑Ile‑OH(26.24g，
200mmol)溶于四氢呋喃150ml中缓慢的滴加入上述溶液中，滴完室温下继续反应，监控原料反应完全，过滤后，减压浓缩，将浓缩液加入到石油醚中析出固体，洗涤固体后再干燥，用异丙醇重结晶干燥得到Fmoc‑D‑Tyr(Et)‑Ile‑OH 75.60g，收率75％。

[0043] 重复接肽反应步骤及去除Fmoc保护基的操作，按照阿托西班氨基酸序列，在Fmoc‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(2‑CTC Resin)‑Gly‑NH2上依次偶联Fmoc‑Asn‑OH、Fmoc‑Thr‑OH、Fmoc‑D‑Tyr(Et)‑Ile‑OH、Mpa(Trt)‑OH得到Mpa(Trt)‑D‑Tyr(Et)‑Ile‑Thr‑Asn‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(2‑CTC Resin)‑Gly‑NH2。DMF洗毕后，抽除洗涤液。再每次用200ml DCM洗涤树脂，洗涤4遍，5min/次，抽掉DCM，树脂在室温(20～35℃)下真空抽干至呈流沙状。肽树脂干燥完后为42.77g,树脂增重率87.4％。

[0044] 实施例8、阿托西班线性肽树脂的合成3

[0045] 称取实施例4制得的Fmoc‑Pro‑Orn(4‑甲基‑三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2(30.00g)于固相反应合成柱中。加入400mL的DMF溶胀30min，抽去DMF。用3*200mL干燥的DMF洗涤树脂，抽去DMF。加入200mL的DBLK溶液(20％哌啶/DMF溶液,V/V)，脱保护两次，第一次5min，第二次15min。脱保护完每次用200mL DMF洗涤树脂，洗涤6遍，第4次洗涤完毕，用玻璃棒取少许树脂，茚三酮检测呈阳性，表明Fmoc已脱。

[0046] 称取17.57g Fmoc‑Cys(Trt)‑OH、13.65g HBTU和4.05g HOBt，加入100mL DMF溶解，待完全溶解后，将溶液冷却至5℃以下，然后加入5.82g DIEA(预冷至<0℃),于溶液中活化约3～5min，将活化后的溶液控制加入反应柱中，在20～35℃下反应2～3h，茚三酮检测呈阴性，抽掉反应液，加入200mL的DMF洗涤树脂，洗涤6遍。洗毕后，抽除洗涤液，得到Fmoc‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(4‑甲基‑三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2。

[0047] 称取Mpa(Trt)‑OH(69.69g，200mmol)和N‑羟基琥珀酰亚胺(23.00g，200mmol)加入到四氢呋喃800ml中，室温搅拌。控温5℃左右，缓慢地加DCC(45.36g，220mmol)的四氢呋喃(160ml)溶液室温搅拌2.5h，过滤，浓缩后加入到石油醚中重结晶析出固体，洗涤后干燥，将得到的活化酯固体溶于四氢呋喃200ml中，将H‑D‑Tyr(Et)‑OH(41.85g，200mmol)溶于四氢呋喃150ml中缓慢的滴加入上述溶液中，滴完室温下继续反应，监控原料反应完全，过滤后，减压浓缩，将浓缩液加入到石油醚中析出固体，洗涤固体后再干燥，用异丙醇重结晶干燥得到Mpa(Trt)‑D‑Tyr(Et)‑OH 77.98g，收率72％。

[0048] 重复接肽反应步骤及去除Fmoc保护基的操作，按照阿托西班氨基酸序列，在Fmoc‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(4‑甲基‑三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2上依次偶联Fmoc‑Asn‑OH、Fmoc‑Thr‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Mpa(Trt)‑D‑Tyr(Et)‑OH得到Mpa(Trt)‑D‑Tyr(Et)‑Ile‑Thr‑Asn‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(4‑甲基‑三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2。DMF洗毕后，抽除洗涤液。再每次用200ml DCM洗涤树脂，洗涤4遍，5min/次，抽掉DCM，树脂在室温(20～35℃)下真空抽干至呈流沙状。肽树脂干燥完后为42.91g,树脂增重率88.3％。

[0049] 实施例9、阿托西班线性肽树脂的合成4

[0050] 称取实施例5制得的Fmoc‑Pro‑Orn(4‑甲氧基‑三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2(30.00g)于固相反应合成柱中。加入400mL的DMF溶胀30min，抽去DMF。用3*200mL干燥的DMF洗涤树脂，抽去DMF。加入200mL的DBLK溶液(20％哌啶/DMF溶液,V/V)，脱保护两次，第一次5min，第二次15min。脱保护完每次用200mL DMF洗涤树脂，洗涤6遍，第4次洗涤完毕，用玻璃棒取少许树脂，茚三酮检测呈阳性，表明Fmoc已脱。

[0051] 称取Fmoc‑Asn‑OH(70.87g，200mmol)和N‑羟基琥珀酰亚胺(23.00g，200mmol)加入到四氢呋喃800ml中，室温搅拌。控温5℃左右，缓慢地加DCC(45.36g，220mmol)的四氢呋喃(160ml)溶液室温搅拌2.5h，过滤，浓缩后加入到石油醚中重结晶析出固体，洗涤后干燥，将得到的活化酯固体溶于四氢呋喃200ml中，将H‑Cys(Trt)‑OH(79.96g，200mmol)溶于四氢呋喃150ml中缓慢的滴加入上述溶液中，滴完室温下继续反应，监控原料反应完全，过滤后，减压浓缩，将浓缩液加入到石油醚中析出固体，洗涤固体后再干燥，用异丙醇重结晶干燥得到Fmoc‑Asn‑Cys(Trt)‑OH 102.17g，收率73％。

[0052] 称取20.99g Fmoc‑Asn‑Cys(Trt)‑OH和13.65g HCTU，加入100mL DMF溶解，待完全溶解后，将溶液冷却至5℃以下，然后加入5.82g DIEA(预冷至<0℃),于溶液中活化约3～5min，将活化后的溶液控制加入反应柱中，在20～35℃下反应2～3h，茚三酮检测呈阴性，抽掉反应液，加入200mL的DMF洗涤树脂，洗涤6遍。洗毕后，抽除洗涤液，得到Fmoc‑Asn‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(4‑甲氧基‑三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2。

[0053] 重复接肽反应步骤及去除Fmoc保护基的操作，按照阿托西班氨基酸序列，在Fmoc‑Asn‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(4‑甲氧基‑三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2上依次偶联Fmoc‑Thr‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑D‑Tyr(Et)‑OH、Mpa(Trt)‑OH得到Mpa(Trt)‑D‑Tyr(Et)‑Ile‑Thr‑Asn‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(4‑甲氧基‑三苯甲基树脂)‑Gly‑NH2。DMF洗毕后，抽除洗涤液。再每次用200ml DCM洗涤树脂，洗涤4遍，5min/次，抽掉DCM，树脂在室温(20～35℃)下真空抽干至呈流沙状。肽树脂干燥完后为42.28g,树脂增重率84.0％。

[0054] 实施例10、阿托西班粗肽的合成1

[0055] 配置TFA/DCM＝2/98(V/V)裂解液487.2ml，冷却到5～10℃，将实施例6制得的48.72g肽树脂加入到裂解液中，室温(20～35℃)下反应5h，过滤，用乙腈洗涤肽树脂2次，
50ml/次，合并至滤液中，将滤液旋干，干燥后得到固体，异丙醚洗涤，过滤，在20‑35℃减压干燥至恒重得阿托西班线性肽14.77g，将阿托西班线性肽14.30g溶于0.75L冰醋酸溶解，加水6.75L稀释，滴加0.1M/L碘乙醇溶液至溶液变色，室温反应1.0h，即得到阿托西班粗肽，其HPLC谱图见图1。

[0056] 实施例11、阿托西班粗肽的合成2

[0057] 配置TFA/DCM＝5/95(V/V)裂解液448.6ml，冷却到5～10℃，将实施例7制得的42.77g肽树脂加入到裂解液中，室温(20～35℃)下反应3h，过滤，用乙腈洗涤肽树脂2次，
50ml/次，合并至滤液中，将滤液旋干，干燥后得到固体，异丙醚洗涤，过滤，在20‑35℃减压干燥至恒重得阿托西班线性肽14.21g，将阿托西班线性肽14.21g溶于1.5L冰醋酸溶解，加水6L稀释，滴加0.1M/L碘乙醇溶液至溶液变色，室温反应1.0h，即得到阿托西班粗肽，其HPLC谱图与图1相似。

[0058] 实施例12、阿托西班粗肽的合成3

[0059] 配置TFA/DCM＝20/80(V/V)裂解液450.5ml，冷却到5～10℃，将实施例8制得的45.05g肽树脂加入到裂解液中，室温(20～35℃)下反应2h，过滤，用乙腈洗涤肽树脂2次，
50ml/次，合并至滤液中，将滤液旋干，干燥后得到固体，异丙醚洗涤，过滤，在20‑35℃减压干燥至恒重得阿托西班线性肽14.63g，将阿托西班线性肽14.63g溶于1.5L冰醋酸溶解，加水6L稀释，加10％过氧化氢溶液，室温反应1.0h，即得到阿托西班粗肽，其HPLC谱图与图1相似。

[0060] 实施例13、阿托西班粗肽的合成4

[0061] 配置TFA/DCM＝1/99(V/V)裂解液442.7ml，冷却到5～10℃，将实施例9制得的44.27g肽树脂加入到裂解液中，室温(20～35℃)下反应5h，过滤，用乙腈洗涤肽树脂2次，
50ml/次，合并至滤液中，将滤液旋干，干燥后得到固体，异丙醚洗涤，过滤，在20‑35℃减压干燥至恒重得阿托西班线性肽14.13g，将阿托西班线性肽14.13g溶于1.5L冰醋酸溶解，加水6L稀释，加30％过氧化氢溶液，室温反应1.0h，即得到阿托西班粗肽，其HPLC谱图与图1相似。

[0062] 实施例14、阿托西班粗肽的纯化1

[0063] 将实施例10制得的阿托西班粗肽用15％乙腈水溶液溶解过滤后，经制备型反相HPLC(C18柱)纯化，转盐，收集大于99％的馏分，浓缩冻干得到10.12g，收率64％，纯度99％，得到的阿托西班精肽HPLC谱图见图2。

[0064] 实施例15、阿托西班粗肽的纯化2

[0065] 将实施例11制得的阿托西班粗肽用15％乙腈水溶液溶解过滤后，经制备型反相HPLC(C18柱)纯化，转盐，收集大于99％的馏分，浓缩冻干得到9.80g，收率62％，纯度99％，得到的阿托西班精肽HPLC谱图与图2相似。

[0066] 实施例16、阿托西班粗肽的纯化3

[0067] 将实施例12制得的阿托西班粗肽用15％乙腈水溶液溶解过滤后，经制备型反相HPLC(C18柱)纯化，转盐，收集大于99％的馏分，浓缩冻干得到10.28g，收率65％，纯度99％，得到的阿托西班精肽HPLC谱图与图2相似。

[0068] 实施例17、阿托西班粗肽的纯化4

[0069] 将实施例13制得的阿托西班粗肽用15％乙腈水溶液溶解过滤后，经制备型反相HPLC(C18柱)纯化，转盐，收集大于99％的馏分，浓缩冻干得到10.27g，收率65％，纯度99％，得到的阿托西班精肽HPLC谱图与图2相似。