一种Bcl-2荧光探针及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种Bcl‑2小分子荧光探针和其制备方法和应用，所属化合物结构如通式Ⅰ所示， 试剂。其中R1、R2、R3、R和X如说明书中所定义。本发明的探针结构新颖，对Bcl‑2蛋白的结合亲和力强，选择性高，且具有良好的荧光特性。本发明的化合物可以用于制备Bcl‑2蛋白抑制剂的高通量筛选试剂、癌症的早期诊断及肿瘤细胞的标记与分选

权利要求

1.一种Bcl‑2小分子荧光探针，其特征在于，选自具有以下结构式的化合物：。

2.如权利要求1所述的Bcl‑2小分子荧光探针在制备用于特异性识别且定量测定Bcl‑2蛋白的试剂中的应用。

3.如权利要求1所述的Bcl‑2小分子荧光探针在制备用于实现Bcl‑2蛋白抑制剂的高通量筛选试剂及在制备用于检测抑制Bcl‑2蛋白试剂中的应用。

4.如权利要求1所述的Bcl‑2小分子荧光探针在制备用于Bcl‑2蛋白高表达的肿瘤细胞的标记和分选试剂中的应用。

5.如权利要求1所述的Bcl‑2小分子荧光探针在制备用于Bcl‑2蛋白过表达相关恶性肿瘤早期诊断试剂中的应用。

6.如权利要求5所述的Bcl‑2小分子荧光探针的应用，所述Bcl‑2蛋白过表达相关恶性肿瘤为胰腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤以及白血病。

说明书

一种Bcl‑2荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及药物技术领域，具体涉及Bcl‑2小分子荧光探针及其制备方法，及其在Bcl‑2蛋白特异定量检测、Bcl‑2抑制剂筛选、癌症检测及细胞分选中的应用。

背景技术

[0002] Bcl‑2家族蛋白作为一类重要信号分子，根据结构和功能可以划分为促凋亡蛋白(Bax，Bak等)、抗凋亡蛋白(Bcl‑2，Mcl‑1，Bcl‑XL等)和BH3‑only蛋白(Bad,Bid,Bim和Noxa等)。Bcl‑2家族促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间复杂的相互作用可以准确的调控线粒体介导的内源性凋亡通路，对多细胞有机体的发育，维持机体内环境的稳态具有重要意义。

[0003] 正常的生理条件下，Bcl‑2家族的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的表达量维持动态平衡，以实现对内源性凋亡通路的准确调控，但某些病理刺激或基因突变会导致抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白表达失衡，导致自身免疫性疾病、神经退行性疾病和癌症等等一系列疾病。此外，抗凋亡蛋白的过度表达会拮抗促凋亡蛋白的功能，抑制细胞凋亡进程，阻碍机体清除异常或病变的细胞。研究表明，过表达Bcl‑2家族抗凋亡蛋白(如Bcl‑2，Mcl‑1等蛋白)是造成肿瘤细胞凋亡逃逸的主要原因，而过表达Bcl‑2家族抗凋亡蛋白已经成为肿瘤细胞的标志物之一，乳腺癌，肺癌，前列腺癌，卵巢癌，胰腺癌和宫颈癌、白血病和黑色素瘤等多种肿瘤细胞中均发现了过表达的Bcl‑2家族抗凋亡蛋白。因此，我们可以通过检测细胞内抗凋亡蛋白的表达量来区分肿瘤细胞和正常细胞。

[0004] 目前，人们开发了几个Bcl‑2蛋白荧光探针，但是它们对靶蛋白亲和力低、选择性差的问题极大地限制了它们的应用。此外，现有的Bcl‑2荧光探针也无法检测活细胞内Bcl‑2蛋白表达量。为了解决现有Bcl‑2蛋白荧光探针存在的问题，我们开发了一系列新型的Bcl‑2蛋白荧光探针，该系列探针对Bcl‑2蛋白表现出极高的亲和力和选择性，并成功应用于活细胞内Bcl‑2蛋白表达量的检测。

发明内容

[0005] 本发明提供一种Bcl‑2小分子荧光探针及其制备方法和其在制备Bcl‑2蛋白定量测定、癌症早期诊断、肿瘤细胞的标记试剂和分选试剂中的应用。

[0006] 具体技术方案如下：

[0007] 一、Bcl‑2小分子荧光探针

[0008] 一种Bcl‑2小分子荧光探针，具有下述结构通式Ⅰ所示的结构：

[0009]

[0010] 其中，R1代表氢原子，卤素原子，C1‑6烷基或者C1‑6卤代烷基，

[0011] R2、R3分别独立的代表氢原子，卤素原子，C1‑6烷基或者C1‑6卤代烷基，[0012] R4代表氢原子，C1‑6烷基或者C3‑8环烷基，

[0013] X为N或者CH＝CH，

[0014] R为荧光基团。

[0015] 优选地，

[0016] 所述R1代表氢原子，氟原子，氯原子，C1‑4烷基或者C1‑4卤代烷基，

[0017] R2、R3分别独立的代表氢原子，卤素原子，C1‑4烷基或者C1‑4卤代烷基，[0018] X为CH＝CH，

[0019] R4代表氢原子，C1‑4烷基或者C3‑6环烷基，

[0020] R为5‑二甲氨基‑1‑磺酰基萘、8‑氨基喹啉、8‑羟基喹啉、7‑氨基‑4‑甲基香豆素、7‑羟基‑4‑甲基香豆素、8‑磺酰胺基喹啉，2‑磺酰胺基‑10‑乙基吖啶酮，4‑(N‑苯并吡咯酮)‑苯磺酰胺、四苯乙烯衍生物。

[0021] 进一步优选地，

[0022] Bcl‑2小分子荧光探针选自具有以下结构式的化合物：

[0023]

[0024] 二、Bcl‑2小分子荧光探针的制备方法

[0025] 一种Bcl‑2小分子荧光探针的制备方法如下：

[0026] 3,3‑二甲基环己酮与三氯氧磷、N,N‑二甲基甲酰胺反应生成中间体2；中间体2与对氯苯硼酸反应生成中间体3；4‑氯‑2‑氟苯甲酸通过甲酯保护得到中间体4，而后与Boc‑哌嗪反应生成中间体6，再通过亲核取代反应得到中间体7，其脱除Boc保护基后得到中间体8；然后中间体8再通过还原胺化反应得到中间体9，其水解后得中间体10；中间体10与不同结构的荧光团反应得到通式I的化合物；

[0027] 反应路线如下：

[0028]

[0029] 其中，R、R1、R2、R3、R4定义同上通式I所述；

[0030] 反应试剂和反应条件：(a)三氯氧磷，N,N‑二甲基甲酰胺,二氯甲烷；(b)[1,1'‑双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯，取代芳基硼酸或杂环硼酸，1,4‑二氧六环，水；(c)乙酰氯，甲醇，回流；(d)醋酸钯，碳酸铯，甲苯，80℃；(e)氢化钠，N,N‑二甲基甲酰胺，140℃；(f)氯化氢饱和的乙酸乙酯，二氯甲烷；(g)3，1,2‑二氯乙烷，三乙酰氧基硼氢化钠；(h)LiOH,四氢呋喃/水；(i)R‑NH2，氯甲酸异丁酯，N‑甲基吗啉，四氢呋喃；或R‑NH2，2‑(7‑氮杂苯并三氮唑)‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸酯,N,N‑二异丙基乙氨，二氯甲烷。

[0031] 三、Bcl‑2小分子荧光探针的应用

[0032] 本发明的Bcl‑2小分子荧光探针在制备用于特异性识别且定量测定Bcl‑2蛋白的试剂中的应用；

[0033] 本发明的Bcl‑2小分子荧光探针在制备用于实现Bcl‑2蛋白抑制剂的高通量筛选及在制备用于检测抑制Bcl‑2蛋白试剂中的应用；

[0034] 本发明的Bcl‑2小分子荧光探针在制备用于Bcl‑2蛋白高表达的肿瘤细胞的标记和分选试剂中的应用；

[0035] 本发明的Bcl‑2小分子荧光探针在制备用于Bcl‑2蛋白过表达相关恶性肿瘤早期诊断试剂中的应用。

[0036] 本发明Bcl‑2小分子荧光探针的应用中所述的Bcl‑2蛋白过表达相关恶性肿瘤为胰腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤以及白血病。

[0037] 本发明所述“卤素”是指氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等。优选氟原子和氯原子。

[0038] 本发明所述“卤代”是指所述基团中任意一个能被取代的原子被卤素所取代，可全卤代，即卤素原子取代基团中所有能被取代的位置。

[0039] 本发明所述“C1‑6烷基”表示直链或支链的含有1‑6个碳原子的烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、2‑甲基丁基、新戊基、1‑乙基丙基、正己基、异己基、3‑甲基戊基、2‑甲基戊基、1‑甲基戊基、3,3‑二甲基丁基、2,2‑二甲基丁基、1,1‑二甲基丁基、1,2‑二甲基丁基、1,3‑二甲基丁基、2,3‑二甲基丁基、2‑乙基丁基、1,2‑二甲基丙基等。优选C1‑4烷基。本发明所述“C1‑4烷基”指含有1‑4个碳原子上述实施例。

[0040] 本发明所述3‑8元环烷基，包括3‑8元饱和单环环烷基和3‑8元部分饱和单环环烷基。3‑8元饱和单环环烷基，是指该单环为全部饱和的碳环，其实例包括但不限于：环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基、环庚烷基、环辛烷基、甲基环丙烷基、二甲基环丙烷基、甲基环丁烷基、二甲基环丁烷基、甲基环戊烷基、二甲基环戊烷基、甲基环己烷基、二甲基环己烷基等。3‑8元部分饱和单环环烷基，是指该单环为部分饱和的碳环，其实例包括但不仅限于环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、1,4‑环己二烯基、环庚烯基、1,4‑环庚二烯基、环辛烯基、1,5‑环辛二烯基等；

[0041] 术语“C3‑8环烷基”、“C3‑6环烷基”分别为下述实例中含有3‑8个、3‑6个碳原子的具体实例。

[0042] 本发明的有益效果：

[0043] 1.本发明的探针结构新颖，对Bcl‑2蛋白具有极高的亲和力和选择性，具有荧光探针微量、高效、专属性高的特性。

[0044] 2.本发明的Bcl‑2荧光探针能选择性地标记肿瘤细胞，能实现癌症及其相关疾病的早期诊断和肿瘤细胞的分选。本发明的Bcl‑2小分子荧光探针在制备筛选Bcl‑2蛋白相关恶性肿瘤的药物制剂中的应用，所述的相关恶性肿瘤为恶性肿瘤；优选为胰腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤以及白血病。

附图说明

[0045] 图1为(A)化合物11的吸收光谱(B)不同浓度下探针在PBS缓冲溶液中的荧光激发光谱(C)不同浓度下探针在PBS缓冲溶液中的荧光发射光谱(D)不同的溶剂中探针的荧光激发光谱(E)不同溶剂中探针的荧光发射光谱。

[0046] 图2为(A)化合物12的吸收光谱(B)不同浓度下探针在PBS缓冲溶液中的荧光激发光谱(C)不同浓度下探针在PBS缓冲溶液中的荧光发射光谱(D)不同的溶剂中探针的荧光激发光谱(E)不同溶剂中探针的荧光发射光谱。

[0047] 图3为(A)化合物13的吸收光谱(B)不同浓度下探针在PBS缓冲溶液中的荧光激发光谱(C)不同浓度下探针在PBS缓冲溶液中的荧光发射光谱(D)不同的溶剂中探针的荧光激发光谱(E)不同溶剂中探针的荧光发射光谱。

[0048] 图4为(A)化合物14的吸收光谱(B)不同浓度下探针在PBS缓冲溶液中的荧光激发光谱(C)不同浓度下探针在PBS缓冲溶液中的荧光发射光谱(D)不同的溶剂中探针的荧光激发光谱(E)不同溶剂中探针的荧光发射光谱。

[0049] 图5为化合物11与Bcl‑2蛋白共孵育后荧光性质分析。(A)室温下2μM的化合物11与不同浓度的Bcl‑2蛋白(0.0125，0.025,0.05,0.075,0.1和0.125mg/mL)孵育20min后的荧光发射光谱；(B)室温下2μM化合物11,2μM化合物11+0.125mg/mL Bcl‑2蛋白、2μM化合物11+0.125mg/mL Bcl‑2蛋白+5μM ABT‑199(Bcl‑2蛋白抑制剂)孵育20min后的荧光发射光谱；
(C)室温下2μM化合物11，0.125mg/mL Bcl‑2蛋白，2μM化合物11+0.125mg/mL Bcl‑2蛋白，2μM化合物11+0.125mg/mL Mcl‑1蛋白在缓冲溶液中孵育的荧光发射光谱；(D)室温下2μM化合物11，0.125mg/mL Bcl‑2蛋白，2μM化合物11+0.125mg/mL Bcl‑2蛋白，2μM化合物11+
0.125mg/mL Mcl‑1蛋白孵育20min后的荧光强度柱状图。

[0050] 图6为化合物12与Bcl‑2蛋白共孵育后荧光性质分析。(A)室温下1μM的化合物12与不同浓度的Bcl‑2蛋白(0.025，0.05,0.1,0.2和0.4mg/mL)在缓冲溶液中孵育20min后的荧光发射光谱；(B)室温下1μM化合物12,1μM化合物12+0.4mg/mL Bcl‑2蛋白、1μM化合物12+0.4mg/mL Bcl‑2蛋白+5μM ABT‑199(Bcl‑2蛋白抑制剂)在缓冲溶液中孵育的荧光发射光谱；(C)室温下，1μM化合物12,1μM化合物12+0.4mg/mL Bcl‑2蛋白，1μM化合物12+0.4mg/mL Mcl‑1蛋白,1μM化合物12+0.4mg/mL BSA，孵育20min后的荧光发射光谱。(D)室温下1μM化合物12，1μM化合物12+0.4mg/mL Bcl‑2蛋白，1μM化合物12+0.4mg/mL Mcl‑1蛋白,1μM化合物
12+0.4mg/mL BSA，孵育20min后的荧光强度柱状图。

[0051] 图7为1μM化合物11与ACHN和HUVEC细胞分别孵育后的成像(A1：ACHN细胞，明场成像；A2：ACHN细胞，荧光成像；B1：HUVEC细胞明场成像；B2：HUVEC细胞荧光成像)镜头的放大倍数:63×。

[0052] 图8中(A)为室温下ACHN和HUVEC混合细胞与1μM化合物11共孵育20min后的流式分析结果；(B)为室温下HL‑60和HUVEC混合细胞与1μM化合物11共孵育20min后的流式分析结果。

具体实施方式

[0053] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

[0054] 实施例1 2‑氯‑4,4‑二甲基环己‑1‑烯‑1‑甲醛的制备：

[0055] 将N，N‑二甲基甲酰胺(1.16mL，15mmol)溶于二氯甲烷(30mL)中，冰浴下加入POCl3(1.05mL，11.25mmol)，室温反应2h。然后加入3,3‑二甲基环己酮(1.04mL，7.5mmol),室温反应4h。将反应液倒入冰水(120mL)中，用二氯甲烷萃取3次。合并有机相，MgSO4干燥后旋干，1
得粗品，柱层析纯化得无色油状液体，产率：76％。H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.22(S,1H),
2.37(s,2H),2.32(t,J＝6.4Hz,2H),1.43(t,J＝6.4Hz,2H),0.98(s,6H).

[0056] 4‑氯‑5,5‑二甲基‑3,4,5,6‑四氢‑[1,1‑联苯]‑2‑甲醛的制备：

[0057] 向两颈烧瓶中加入4‑氯苯基硼酸(0.75g，4.81mmol)，Pd(dppf)Cl2(0.11g，0.148mmol)。加入2‑氯‑4,4‑二甲基环己‑1‑烯‑1‑甲醛(0.64g，3.7mmol)的1,4‑二氧六环溶液和K2CO3(1.33g，9.62mmol)的水溶液，氮气置换三次后85℃条件下反应6小时。停止加热，冷却至室温，向混合物中加入20mL H2O，并用乙酸乙酯萃取三次。硅藻土垫过滤除去Pd
1
(dppf)Cl2，浓缩有机相得粗品。柱层析得无色油状物，产率：78％。H NMR(400MHz,CDCl3)δ
9.51(d,J＝11.1Hz,1H),7.35(d,J＝8.3Hz,2H),7.14(d,J＝8.4Hz,2H),2.38(dd,J＝7.5,
5.5Hz,2H),2.28(s,2H),1.49(t,J＝6.5Hz,2H),1.01(s,6H).

[0058] 4‑溴‑2‑氟苯甲酸甲酯的制备：

[0059] 冰浴下，将乙酰氯(5.4mL，75mmol)缓慢加入无水甲醇(140mL)中，反应30分钟。将4‑溴‑2‑氟苯甲酸(7.01g，30mmol)加入溶液中，回流6小时。蒸除溶剂，用正己烷洗涤粗产物
1
得白色固体，产率：98％，熔点58‑60℃。H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(t,J＝8.2Hz,1H),7.35(t,J＝7.7Hz,2H),3.93(s,3H).

[0060] 4‑(3‑氟‑4‑(甲氧基羰基)苯基)哌嗪‑1‑甲酸叔丁酯的制备：

[0061] 将4‑溴‑2‑氟苯甲酸甲酯(0.47g，2mmol)、1‑Boc‑哌嗪(0.52g，2.8mmol)、Pd(OAc)2(0.0224g，0.1mol)与BINAP(0.125g，0.2mol)、Cs2CO3(0.717g，2.2mol)加入到两颈瓶中，加入干燥的甲苯(20mL)，置换氮气后，80℃下反应8h。停止加热，冷却至室温，硅藻土垫过滤。1
旋干滤液。粗品用乙酸乙酯重结晶得白色固体，产率：81％，熔点148‑149℃。H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84(t,J＝8.8Hz,1H),6.62(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),6.51(dd,J＝14.5,
2.3Hz,1H),3.88(s,3H),3.68–3.50(m,4H),3.40–3.17(m,4H),1.49(s,9H).

[0062] 4‑(3‑((1H‑吡咯并[2,3‑b]吡啶‑5‑基]氧基)‑4‑(甲氧羰基)苯基)哌嗪‑1‑羧酸叔丁酯的制备：

[0063] 将4‑(3‑氟‑4‑(甲氧基羰基)苯基)哌嗪‑1‑甲酸叔丁酯溶解于无水N，N‑二甲基甲酰胺(120mL)溶液中，加入1H‑吡咯并[2,3‑b]吡啶‑5‑醇(2.1g，15mmol)和NaH(0.66g，16.5mmol)，氮气置换三次。120℃下加热反应8h。停止加热，冷却至室温后，将反应液倒入水(300mL)中。用乙酸乙酯(150ml)萃取三次，无水硫酸镁干燥。蒸除溶剂，粗品用柱层析的方
1
法纯化得白色固体，产率：76％，熔点193‑194℃。H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.64(s,1H),
8.01(d,J＝2.5Hz,1H),7.79(d,J＝8.9Hz,1H),7.48(t,J＝2.8Hz,1H),7.43(d,J＝2.5Hz,
1H),6.79(dd,J＝9.0,2.1Hz,1H),6.43(d,J＝2.0Hz,1H),6.38(dd,J＝2.9,1.8Hz,1H),
3.65(s,3H),3.42(t,J＝4.6Hz,4H),3.21(t,J＝4.7Hz,4H),1.39(s,9H).

[0064] 2‑((1H‑吡咯[2,3‑b]吡啶‑5‑基)氧基]‑4‑(哌嗪‑1‑基)苯甲酸甲酯的制备：

[0065] 将4‑(3‑((1H‑吡咯并[2,3‑b]吡啶‑5‑基]氧基)‑4‑(甲氧羰基)苯基)哌嗪‑1‑羧酸叔丁酯(4.5g，10mmol)溶解于乙酸乙酯(60mL)中，加入HCl/EA(40mL)。搅拌过夜后过滤。向滤饼中加入乙酸乙酯(100mL)和饱和NaHCO3(100mL)的混合溶液，室温搅拌1h，用乙酸乙酯萃取三次。合并有机相，无水MgSO4干燥，旋干溶剂得白色固体，产率：96％，熔点146‑148℃1
.H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.65(s,1H),8.01(d,J＝2.5Hz,1H),7.77(d,J＝9.0Hz,1H),
7.48(t,J＝2.8Hz,1H),7.44(d,J＝2.5Hz,1H),6.78(dd,J＝9.0,2.1Hz,1H),6.46–6.29(m,
2H),3.66(s,3H),3.16–3.05(m,4H),2.81–2.62(m,4H).

[0066] 甲基2‑((1H‑吡咯并[2,3‑b]吡啶基‑5‑基)氧基]‑4‑(4‑((4'‑氯‑5,5‑二甲基‑3,4,5,6‑四氢‑[[1,1'‑联苯]‑2‑基)甲基)哌嗪‑1‑基)苯甲酸酯的制备：

[0067] 将2‑((1H‑吡咯[2,3‑b]吡啶‑5‑基)氧基]‑4‑(哌嗪‑1‑基)苯甲酸甲酯(3.17g，9mmol)溶解在1，2‑二氯乙烷(80mL)，加入4‑氯‑5,5‑二甲基‑3,4,5,6‑四氢‑[1,1‑联苯]‑2‑甲醛(2.46g，9.9mmol)，室温反应1h。加入三乙酰氧基硼氢化钠(5.72g，27mmol)，室温反应6小时。过滤，有机相用饱和NaHCO3和饱和NaCl溶液洗涤，MgSO4干燥，旋干后得粗品。柱层析得
1
白色固体，产率：79％。熔点92‑94℃。H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.63(s,1H),7.99(d,J＝
2.5Hz,1H),7.75(d,J＝9.0Hz,1H),7.50–7.46(m,1H),7.42(d,J＝2.3Hz,1H),7.35(d,J＝
8.3Hz,2H),7.05(d,J＝8.3Hz,2H),6.78–6.70(m,1H),6.40–6.31(m,2H),3.65(s,3H),3.12(m,4H),2.73(m,2H),2.19(m,6H),1.97(d,J＝12.7Hz,2H),1.39(t,J＝6.3Hz,2H),0.94(s,
6H).

[0068] 2‑((1H‑吡咯并[2,3‑b]吡啶基‑5‑基)氧基]‑4‑(4‑((4'‑氯‑5,5‑二甲基‑3,4,5,6‑四氢‑[[1,1'‑联苯]‑2‑基)甲基)哌嗪‑1‑基)苯甲酸的制备：

[0069] 甲基2‑((1H‑吡咯并[2,3‑b]吡啶基‑5‑基)氧基]‑4‑(4‑((4'‑氯‑5,5‑二甲基‑3,4,5,6‑四氢‑[[1,1'‑联苯]‑2‑基)甲基)哌嗪‑1‑基)苯甲酸酯(4.09g，7mmol)的THF/MeOH/H 
2O＝1∶3∶1(60mL)的混合溶剂中，加入KOH(1.57g，28mmol)，回流6小时。蒸除有机相，用6M 
1
HCl调pH＝2。过滤,即得产物，产率：89％。熔点249‑250℃。H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.57(s,1H),7.96(s,1H),7.60(d,J＝8.5Hz,1H),7.42(s,1H),7.35(m,3H),7.05(d,J＝7.8Hz,
2H),6.64(d,J＝8.6Hz,1H),6.33(s,1H),6.29(s,1H),3.03(s,4H),2.73(s,2H),2.29–2.11(m,6H),1.96(s,2H),1.39(t,2H),0.93(s,6H).

[0070] 2‑(((1H‑吡咯并[2,3‑b]吡啶基‑5‑基)氧基]‑4‑(4‑(((4'‑氯‑5,5‑二甲基‑3,4,5,6‑四氢‑[[1,1'‑联苯]‑2‑基)甲基)哌嗪‑1‑基)‑N‑((5‑(二甲基氨基)萘‑1‑基)磺酰基)苯甲酰胺(11)的制备：

[0071] 冰浴下，2‑((1H‑吡咯并[2,3‑b]吡啶基‑5‑基)氧基]‑4‑(4‑((4'‑氯‑5,5‑二甲基‑3,4,5,6‑四氢‑[[1,1'‑联苯]‑2‑基)甲基)哌嗪‑1‑基)苯甲酸(0.86g，1.5mmol)的DMF(30mL)溶液中加入氯甲酸异丁酯(0.21mL，1.65mmol)、N‑甲基吗啉(0.20mL，1.65mmol)，反应30分钟即为混合酸酐。向5‑(二甲基氨基)萘‑1‑磺酰胺(0.41g，1.65mmol)的DMF(30mL)溶液中加入NaH(0.09g，1.5mmol)，80℃下搅拌30分钟。将上述溶液加入混合酸酐中，80℃下反应8h。停止加热，冷却至室温，将反应物倒入水(120mL)中，用乙酸乙酯萃取三次。合并有机
1
相，蒸除溶剂，粗品用柱层析的方法纯化，得白色固体，产率：60％，熔点175‑176℃。H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.40(s,1H),9.06(s,1H),8.61(d,J＝7.3Hz,1H),8.57(d,J＝8.6Hz,
1H),8.21(s,1H),8.13(d,J＝8.6Hz,1H),7.85(d,J＝8.8Hz,1H),7.70(s,1H),7.61(t,J＝
8.0Hz,1H),7.49(s,1H),7.22(d,J＝7.6Hz,2H),7.07(d,J＝7.5Hz,1H),6.90(d,J＝7.3Hz,
2H),6.59(s,1H),6.48(d,J＝9.0Hz,1H),5.96(s,1H),3.02(s,4H),2.86(s,6H),2.72(s,
13
2H),2.24–2.08(m,6H),1.95(s,2H),1.40(t,J＝6.0Hz,2H),0.92(s,6H). C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.68,158.29,154.53,151.08,145.33,144.37,141.05,135.68,134.21,132.77,
131.41,130.89,130.42,128.74,128.65,128.51,128.02,127.30,127.19,126.30,122.34,
119.99,119.76,117.17,113.85,108.19,108.02,100.46,99.67,59.27,51.17,45.89,
44.37,34.28,28.68,28.16,27.13,24.54.HRMS(AP‑ESI)m/z,Calcd for C45H47ClN6O4S,([M+
+H]):803.3141,found:803.3122.

[0072] 实施例2 2‑(((1H‑吡咯并[2,3‑b]吡啶基‑5‑基)氧基]‑4‑(4‑(((4'‑氯‑5,5‑二甲基‑3,4,5,6‑四氢‑[[1,1'‑联苯]‑2‑基)甲基)哌嗪‑1‑基)‑N‑(((10‑乙基‑9‑氧代‑9,10‑二氢吖啶‑2‑基)磺酰基)苯甲酰胺(12)的制备：

[0073] 化合物12的制备方法如化合物11，收率：62％。熔点222‑224℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.24(s,1H),9.20(s,1H),9.17(s,1H),8.56(d,J＝8.5Hz,2H),8.26(s,1H),7.93(d,J＝9.0Hz,1H),7.80(d,J＝7.9Hz,1H),7.76(s,1H),7.62(d,J＝8.8Hz,1H),7.57(d,J＝8.6Hz,1H),7.45(s,1H),7.37(t,J＝7.5Hz,1H),7.22(d,J＝7.4Hz,2H),6.90(d,J＝7.6Hz,
2H),6.57(s,1H),6.50(d,J＝9.0Hz,1H),5.97(s,1H),4.49(d,J＝7.0Hz,2H),3.49(s,2H),
3.04(s,4H),2.73(s,2H),2.28–2.11(m,6H),1.95(s,2H),1.40(t,J＝6.5Hz,3H),0.93(s,
13
6H). C NMR(101MHz,DMSO‑d6)δ176.56,173.29,164.44,158.44,154.97,146.98,145.92,
143.99,142.45,141.63,135.88,135.38,134.84,132.59,132.45,131.30,130.46,129.30,
129.19,128.53,128.27,128.12,127.32,122.90,122.52,120.91,120.26,118.54,117.02,
116.71,109.16,102.75,100.44,60.11,52.48,47.04,46.77,41.54,35.27,29.32,28.37,+
25.60,12.76.HRMS(AP‑ESI)m/z,Calcd for C48H47ClN6O5S,([M+H]):855.3090,found:
855.3065.

[0074] 实施例3 2‑((1H‑吡咯并[2,3‑b]吡啶基‑5‑基)氧基]‑4‑(4‑((4'‑氯‑5,5‑二甲基‑3,4,5,6‑四氢‑[[1,1'‑联苯]‑2‑基)甲基)哌嗪‑1‑基)‑N‑(喹啉‑8‑基)苯甲酰胺(13)制备：

[0075] 2‑((1H‑吡咯并[2,3‑b]吡啶基‑5‑基)氧基]‑4‑(4‑((4'‑氯‑5,5‑二甲基‑3,4,5,6‑四氢‑[[1,1'‑联苯]‑2‑基)甲基)哌嗪‑1‑基)苯甲酸(0.57g，1mmol)溶解在DMF(30mL)溶液中，加入DIPEA(0.19mL，1.1mmol)以及HATU(0.46g，1.2mmol)，室温反应30分钟后。加入8‑氨基喹啉(0.15g，1.1mmol)，60℃反应6h。冷却至室温，将反应混合物倒入水(90mL)中，用乙酸乙酯(60ml)萃取3次。除去溶剂，粗品用柱层析得方法纯化，得白色固体，产率：61％。熔点
1
114‑116℃。H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.24(s,1H),9.40(s,1H),8.99(d,J＝7.7Hz,1H),8.47(s,2H),8.28(d,J＝8.9Hz,1H),8.07(d,J＝8.1Hz,1H),7.80(s,1H),7.55(t,J＝7.9Hz,
1H),7.44(d,J＝8.2Hz,1H),7.40(s,1H),7.30(dd,J＝8.1,4.2Hz,1H),7.24(s,2H),6.94(d,J＝7.6Hz,2H),6.73(d,J＝9.0Hz,1H),6.52(s,1H),6.33(s,1H),3.14(s,4H),2.80(s,
13
3H),2.29(s,4H),2.20(s,2H),1.98(s,2H),1.43(t,J＝6.1Hz,2H),0.95(s,6H). C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.35,157.78,154.68,152.61,148.00,147.10,145.66,142.15,
139.12,137.05,135.99,135.94,133.58,131.97,121.33,120.99,120.41,119.53,116.88,
114.25,109.59,102.46,101.40,100.00,60.41,52.48,47.48,47.03,38.63,35.37,29.23,+
28.20,25.64.HRMS(AP‑ESI)m/z,Calcd for C42H41ClN6O2,([M+H]):697.3052,found:
697.3033.

[0076] 实施例4 2‑((1H‑吡咯并[2,3‑b]吡啶基‑5‑基)氧基]‑4‑(4‑((4'‑氯‑5,5‑二甲基‑3,4,5,6‑四氢‑[[1,1'‑联苯]‑2‑基)甲基)哌嗪‑1‑基)‑N‑(4‑甲基‑2‑氧代‑2H‑苯并呋喃‑7‑基)苯甲酰胺(14)的制备：

[0077] 化合物14的制备方法如化合物13，白色固体，产率：47％。熔点136‑138℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.34(s,1H),8.71(d,J＝4.2Hz,1H),8.41(d,J＝8.4Hz,1H),8.21(d,J＝8.4Hz,2H),7.66(s,1H),7.40(dd,J＝10.9,8.2Hz,2H),7.24(,J＝7.4Hz,,2H),6.93(d,J＝
7.3Hz,2H),6.61(d,J＝9.0Hz,1H),6.49(s,1H),6.16(s,1H),3.19(s,4H),2.78(s,2H),
13
2.26(m,5H),2.19(m,2H),1.98(s,2H),1.62(s,2H),1.43(t,J＝5.8Hz,2H),0.95(s,1H). C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.70,160.13,156.57,151.54,146.73,145.80,142.10,141.18,
136.75,135.36,135.12,134.59,131.96,129.71,129.35,129.08,128.28,126.53,120.56,
120.14,107.89,102.61,101.63,101.29,60.32,52.24,47.01,46.74,35.36,29.23,28.19,+
25.62.HRMS(AP‑ESI)m/z,Calcd for C43H42ClN5O4,([M+H]):728.2925,found:728.2974.[0078] 实施例5化合物11‑14的荧光性质测定实验

[0079] 本发明的化合物用二甲基亚砜配置成浓度为10mM的浓储备液，用PBS缓冲溶液稀释得到不同浓度的溶液；用不同的有机溶剂稀释成1μM的溶液，使用荧光分光光度计测定不同浓度和不同溶剂下化合物的荧光光谱，以探究探针的荧光特性。图1‑4分别是化合物11‑14的光谱学性质。结果表明本发明的化合物具有良好的荧光特性，适于进行生物医学的荧光检测。

[0080] 实施例6化合物11和12与Bcl‑2蛋白共孵育后荧光性质测定

[0081] 图5结果表明，将1μM化合物11与不同浓度的Bcl‑2蛋白共孵育出现了荧光强度增强现象，且Bcl‑2蛋白浓度越高荧光越强，而加入Bcl‑2抑制剂ABT‑199后，荧光强度又回到了初始状态。化合物11与其它蛋白共孵育不会出现荧光增强现象，上述实验结果表明本发明中的化合物11能特异性地识别Bcl‑2蛋白，且Bcl‑2蛋白浓度越高，化合物11释放出的荧光信号越强。上述结果表明，本发明中的化合物11是一种高能、高选择性的荧光工具，可用于癌症的早期诊断、肿瘤细胞的分选及Bcl‑2蛋白抑制剂的高通量筛选。

[0082] 此外，如图6所示，化合物12与Bcl‑2蛋白孵育后其荧光强度增强，而与Mcl‑1蛋白或牛血清白蛋白(BSA)孵育后化合物12的荧光强度没有发生明显变化。上述结果表明，化合物12也能特异性识别Bcl‑2蛋白，且其荧光强度随孵育的Bcl‑2蛋白浓度的增加而增强。实施例7化合物11在肾癌细胞ACHN(高表达Bcl‑2蛋白的细胞)和正常组织细胞HUVECs(低表达Bcl‑2蛋白的细胞)成像中的应用。

[0083] 将培养好的ACHN细胞和HUVECs细胞分别接种于共聚焦小皿中，在37℃，5％CO2的恒温孵育箱中培养12h后弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞三次后加入1μM化合物11的溶液，室温避光孵育20min后用Zeiss Axio Observer A1荧光显微镜成像。

[0084] 如图7所示，在高表达Bcl‑2蛋白的肾癌细胞ACHN被绿色荧光标记，而在低表达Bcl‑2蛋白的正常组织细胞HUVECs中则未观察到绿色荧光。上述结果表明，化合物11能够选择性地标记肿瘤细胞。

[0085] 实施例8化合物11用于肿瘤细胞的分选

[0086] 我们构建了含有肿瘤细胞和正常细胞的组织模型(组织模型1：将肾癌细胞ACHN和正常组织细胞HUVECs混合；组织模型2：将人白血病细胞HL‑60和正常组织细胞HUVECs混合)。将上述组织模型与1μM化合物11在避光条件下共孵育20min，而后运用流式细胞仪分析细胞的荧光性质。结果表明(图8)，在两种组织模型中，肿瘤细胞因高表达Bcl‑2蛋白，在于化合物11共孵育后释放出较强的荧光，而正常细胞内的Bcl‑2蛋白含量较低，发出的荧光较弱。因此根据释放荧光的强弱，肿瘤细胞和正常细胞被成功分离成两簇，从而实现了肿瘤细胞与正常细胞的分选。

[0087] 将本发明中的化合物11与细胞样品共孵育后，检测样品的荧光强度的变化，如果出现荧光增强现象即说明该细胞为肿瘤细胞。据此，本发明中的化合物11可用于肿瘤细胞的检测和分选。

[0088] 上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。