类蛇毒三肽的液相合成方法

摘要

本发明公开了一种类蛇毒三肽的液相合成方法，属于多肽合成技术领域，具体涉及类蛇毒三肽的液相合成方法，包括：以Fmoc‑Dab(Boc)‑OH、苄胺、Boc‑β‑Ala‑OH、H‑Pro‑OMe.HCl为反应原料，在包括HOBT衍生物的添加剂作用下合成多肽H‑β‑Ala‑Pro‑Dab(Boc)‑NHBzl，最后在酸性试剂作用下脱除保护基Boc，纯化得到类蛇毒三肽。本发明中使用的HOBT衍生物由3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯与水合肼溶液于正庚醇中制备合成。本发明方法合成的类蛇毒三肽的收率高且纯度高。

权利要求

1.类蛇毒三肽的液相合成方法，包括：以Fmoc‑Dab(Boc)‑OH、苄胺、Boc‑β‑Ala‑OH、H‑Pro‑OMe.HCl为反应原料，在添加剂作用下合成多肽H‑β‑Ala‑Pro‑Dab(Boc)‑NHBzl，最后在酸性试剂作用下脱除保护基Boc，纯化得到类蛇毒三肽；所述添加剂中含有HOBT衍生物和氰尿酸，所述HOBT衍生物由3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯与水合肼溶液于正庚醇中制备合成；

所述苄胺的使用量为Fmoc‑Dab(Boc)‑OH的20‑30wt%；所述H‑Pro‑OMe.HCl的使用量为Boc‑β‑Ala‑OH的500‑1500wt%；

HOBT衍生物的使用量为Fmoc‑Dab(Boc)‑OH的35‑45wt%；氰尿酸的使用量为Fmoc‑Dab(Boc)‑OH的2‑8wt%。

2.根据权利要求1所述的类蛇毒三肽的液相合成方法，其特征是：所述酸性试剂为硫酸、盐酸、醋酸、甲磺酸、对甲基苯磺酸、三氟乙酸中至少一种。

3.根据权利要求1所述的类蛇毒三肽的液相合成方法，其特征是：所述添加剂包括NMM、EDCI、PIP或其组合。

说明书

类蛇毒三肽的液相合成方法

技术领域

[0001] 本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种类蛇毒三肽的液相合成方法。

背景技术

[0002] H‑β‑Ala‑Pro‑Dab‑NHBzl是一种模拟蛇毒毒素Waglerin I活性的小分子多肽，临床试验表明该多肽可以通过抑制肌肉收缩而减少皱纹的产生，具有优秀的光滑和迅速祛皱性能，H‑β‑Ala‑Pro‑Dab‑NH‑Bzl作用于突触后膜，是肌肉烟碱乙酰胆碱受体(mmAChR)可逆转的拮抗剂，寻找一种合适的合成方法对于该小分子多肽的产业化具有重要意义。

[0003] 公开号CN107936108A，专利名称为一种类蛇毒三肽的液相片段合成方法的发明专利中所用方法用到了两次水解反应，水解反应有发生消旋的可能性，尤其是Dab‑OMe的水解，而对于Pro‑OMe的水解反应消旋可能性非常低。另外，在Boc‑β‑Ala‑Pro‑Dab(Boc)‑OH与苄胺连接反应中，因为Dab(Boc)主链氨基酸并非是氧羰基类保护基，所以在缩合反应中，非常容易产生Dab的消旋，对产品质量有很大影响。

[0004] 公开号CN107857797A，专利名称为一种类蛇毒三肽的液相片段合成方法的发明专利中所提到的技术路线中，首先Fmoc‑Pro‑OH制备成了Fmoc‑Pro‑OSu与H‑Dab(Boc)‑OH反应形成Fmoc‑Pro‑Dab(Boc)‑OH的反应过程中，反应由于Pro氨基酸的较大位阻，反应会比较困难，收率会比较低；另外，在Fmoc‑Pro‑Dab(Boc)‑OH与苄胺连接反应中，因为Dab(Boc)主链氨基酸并非是氧羰基类保护基，所以在缩合反应中，非常容易产生Dab的消旋，对产品质量有很大影响。

[0005] 公开号CN103570804A，专利名称为一种类蛇毒三肽的液相片段合成方法的发明专利中所提到的技术路线中，采用了固液结合的方法来获得类蛇毒三肽，在此工艺路线中，用到了CTC树脂，CTC树脂本身就存在了非常的的稳定性问题，工艺控制比较困难。在Boc‑β‑Ala‑Pro‑Dab(Boc)‑OH与苄胺连接反应中，因为Dab(Boc)主链氨基酸并非是氧羰基类保护基，所以在缩合反应中，非常容易产生Dab的消旋，对产品质量有很大影响。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种可以用合成多肽的HOBT衍生物、并且液相合成的类蛇毒三肽的产率高、纯度高的方法。

[0007] 本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

[0008] 一种HOBT衍生物的制备方法，包括：3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯与水合肼溶液于正庚醇中制备合成。

[0009] 优选地，水合肼溶液的质量分数为40‑80%。

[0010] 优选地，水合肼溶液的使用量为3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯的300‑400wt%。

[0011] 优选地，HOBT衍生物的制备中，将3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯加入正庚醇中，加入水合肼溶液，在回流温度下反应3‑8h，反应完成后，冷却至50‑60℃，加入碱性溶液，搅拌处理20‑60min，蒸馏回收水合肼和正庚醇，反应液中加入大量去离子水，调节pH至3‑3.5，析出沉淀，过滤，冰水洗涤，得到HOBT衍生物。

[0012] 更优选地，HOBT衍生物的制备中，3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯的使用量为正庚醇的50‑100wt%。

[0013] 更优选地，HOBT衍生物的制备中，水合肼溶液的质量分数为40‑80%，水合肼溶液的使用量为3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯的300‑400wt%。

[0014] 更优选地，HOBT衍生物的制备中，碱性溶液为氢氧化钠溶液，碱性溶液中含有30‑50wt%的氢氧化钠，碱性溶液的使用量使氢氧化钠为3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯的10‑30wt%。

[0015] 本发明公开了上述方法制备得到的HOBT衍生物。

[0016] 本发明公开了类蛇毒三肽的液相合成方法，包括：以Fmoc‑Dab(Boc)‑OH、苄胺、Boc‑β‑Ala‑OH、H‑Pro‑OMe.HCl为反应原料，在添加剂作用下合成多肽H‑β‑Ala‑Pro‑Dab(Boc)‑NHBzl，最后在酸性试剂作用下脱除保护基Boc，纯化得到类蛇毒三肽；添加剂中上述的HOBT衍生物。本发明方法以Fmoc‑Dab(Boc)‑OH、苄胺、Boc‑β‑Ala‑OH、H‑Pro‑OMe.HCl为反应原料，通过6步反应最终获得类蛇毒三肽产品，在该技术路线中，HOBT衍生物及Fmoc‑Dab(Boc)‑OH的使用，不涉及到Dab的消旋问题，可以防止Dab的消旋对类蛇毒三肽质量的影响，通过液相合成，本发明方法对类蛇毒三肽的合成中，保证了类蛇毒三肽可以大量生产，并且具有高的收率，并且可以纯化出纯度较高的类蛇毒三肽，可以大大降低生产成本。

[0017] 本发明的类蛇毒三肽的液相合成总路线如下所示：

[0018] 。

[0019] 优选地，化合物3的制备中，将化合物1和HOBT衍生物加入DMF中，然后加入化合物2和NMM，搅拌溶解，加入EDCI，在20‑40℃的温度搅拌下处理8h以上，TLC监测反应，反应完成后，加入大量去离子水，析出固体并弃去上层清液，去离子水洗涤固体，然后加入DCM溶解固体，溶解后分层，除去水相，DCM层干燥，过滤，滤液经旋蒸除去DCM得到化合物3。反应完成后去离子水达到分离析出固体的效果，DCM的使用达到溶解效果，其量的变化对实验结果无影响，因而不限定去离子水及DCM的使用量。

[0020] 更优选地，化合物3的制备中，化合物1的使用量为DMF的0.5‑2wt%。

[0021] 更优选地，化合物3的制备中，HOBT衍生物的使用量为化合物1的35‑45wt%。

[0022] 更优选地，化合物3的制备中，化合物2的使用量为化合物1的20‑30wt%。

[0023] 更优选地，化合物3的制备中，NMM的使用量为化合物1的25‑35wt%。

[0024] 更优选地，化合物3的制备中，EDCI的使用量为化合物1的500‑600wt%。

[0025] 优选地，化合物4的制备中，将化合物3加入PIP‑DCM溶液中，搅拌反应1‑4h，反应完成后，加入去离子水，萃取分液取有机相，去离子水洗涤分液，有机相干燥，过滤，滤液经旋蒸除去溶剂得到固体，固体采用石油醚‑乙酸乙酯溶液打浆洗涤分液，过滤得到化合物4。反应完成后去离子水达到分离的效果，石油醚‑乙酸乙酯溶液的使用为达到打浆洗涤分液的效果，其量的变化对实验结果无影响，因而不限定去离子水及石油醚‑乙酸乙酯溶液的使用量。

[0026] 更优选地，化合物4的制备中，PIP‑DCM溶液中由PIP与DCM混合而成，PIP‑DCM溶液中含有10‑30wt%的PIP。

[0027] 更优选地，化合物4的制备中，化合物3的使用量为PIP‑DCM溶液的4‑12wt%。

[0028] 更优选地，化合物4的制备中，石油醚‑乙酸乙酯溶液由石油醚和乙酸乙酯混合而成，石油醚‑乙酸乙酯溶液中含有20‑80wt%的石油醚。

[0029] 优选地，化合物7的制备中，将化合物5、化合物6、HOBT衍生物加入DCM中，加入NMM，然后再加入EDCI，在20‑40℃的温度搅拌下处理8h以上，TLC监测反应，反应完成后，加入大量去离子水，分层分离出有机相，有机相依次采用碳酸氢钠水溶液、盐酸水溶液、去离子水洗涤分液，有机相干燥，过滤，滤液旋蒸除去溶剂得到化合物7。反应完成后对化合物7的分离中使用的各试剂的量的变化对实验结果无影响，因而不限定其使用量。碳酸氢钠溶液的质量分数为2‑10wt%，盐酸溶液的浓度为0.5‑2M。

[0030] 更优选地，化合物7的制备中，化合物5的使用量为DCM的0.4‑1.2wt%。

[0031] 更优选地，化合物7的制备中，化合物6的使用量为化合物5的500‑1500wt%。

[0032] 更优选地，化合物7的制备中，HOBT衍生物的使用量为化合物5的500‑1000wt%。

[0033] 更优选地，化合物7的制备中，NMM的使用量为化合物5的50‑70wt%。

[0034] 更优选地，化合物7的制备中，EDCI的使用量为化合物5的90‑150wt%。

[0035] 优选地，化合物8的制备中，将化合物7加入甲醇中，搅拌溶解，加入碱性溶液，在20‑40℃的温度搅拌反应1‑4h，TLC监测反应，反应完成后，浓缩，加入石油醚‑乙酸乙酯溶液，搅拌混合，静置分层收集水相，水相调pH至3‑4，然后采用DCM萃取分液，收集有机相，有机相采用饱和氯化钠洗涤分液，有机相经干燥，过滤，滤液经旋蒸除去DCM，得到化合物8。反应完成后对化合物8的分离中使用的各试剂的量的变化对实验结果无影响，因而不限定其使用量。

[0036] 更优选地，化合物8的制备中，化合物7的使用量为甲醇的100‑150wt%。

[0037] 更优选地，化合物8的制备中，碱性溶液为氢氧化钠溶液，碱性溶液中含有2‑6wt%的氢氧化钠。

[0038] 更优选地，化合物8的制备中，碱性溶液的使用量使氢氧化钠为化合物7的15‑20wt%。

[0039] 更优选地，化合物8的制备中，石油醚‑乙酸乙酯溶液由石油醚和乙酸乙酯混合而成，石油醚‑乙酸乙酯溶液中含有40‑60wt%的石油醚。

[0040] 优选地，化合物9的制备中，将化合物8加入DMF中搅拌溶解得到化合物8溶液，将化合物4加入DMF中搅拌溶解得到化合物4溶液，将化合物8溶液与化合物4溶液混合，然后加入HOBT衍生物，加入EDCI，在20‑40℃的温度下反应2‑6h，TLC监测反应，反应完成后，加入去离子水‑乙酸乙酯溶液萃取分液，有机相依次采用碳酸钠溶液、盐酸溶液、去离子水和饱和氯化钠溶液进行洗涤，干燥，过滤，滤液经旋蒸除去乙酸乙酯，得到化合物9。

[0041] 更优选地，化合物9的制备中，化合物8溶液中含有10‑30wt%的化合物8。

[0042] 更优选地，化合物9的制备中，化合物4溶液中含有10‑30wt%的化合物4。

[0043] 更优选地，化合物9的制备中，化合物8溶液与化合物4溶液的混合中使化合物4的量为化合物8的80‑100wt%。

[0044] 更优选地，化合物9的制备中，HOBT衍生物的使用量为化合物8的40‑60wt%。

[0045] 更优选地，化合物9的制备中，EDCI的使用量为化合物8的500‑1000wt%。

[0046] 更优选地，化合物9的制备中，去离子水‑乙酸乙酯溶液由去离子水和乙酸乙酯混合而成，去离子水‑乙酸乙酯溶液中含有30‑70wt%的去离子水。

[0047] 更优选地，化合物9的制备中，碳酸钠溶液的质量分数为2‑10wt%，盐酸溶液的浓度为0.5‑2M。

[0048] 优选地，类蛇毒三肽的制备中，将化合物9加入盐酸水溶液中，在20‑40℃的温度下搅拌反应2‑6h，旋蒸除去水，纯化反相制备得到类蛇毒三肽。

[0049] 更优选地，类蛇毒三肽的制备中，盐酸水溶液的浓度为4‑8mol/L，化合物9的使用量为盐酸水溶液的10‑40wt%。

[0050] 优选地，苄胺的使用量为Fmoc‑Dab(Boc)‑OH的20‑30wt%。

[0051] 优选地，H‑Pro‑OMe.HCl的使用量为Boc‑β‑Ala‑OH的500‑1500wt%。

[0052] 优选地，酸性试剂为硫酸、盐酸、醋酸、甲磺酸、对甲基苯磺酸、三氟乙酸中至少一种。

[0053] 优选地，添加剂包括NMM、EDCI、PIP。

[0054] 本发明公开了上述的HOBT衍生物在制备多肽中的用途。

[0055] 本发明由于采用了以Fmoc‑Dab(Boc)‑OH、苄胺、Boc‑β‑Ala‑OH、H‑Pro‑OMe.HCl为反应原料，在添加剂作用下合成多肽H‑β‑Ala‑Pro‑Dab(Boc)‑NHBzl，最后在酸性试剂作用下脱除保护基Boc，纯化得到类蛇毒三肽，因而具有如下有益效果：本发明制备得到的HOBT衍生物可以用于合成类蛇毒三肽，并具有较高的产率和纯度。因此，本发明是一种一种产率高、纯度高的类蛇毒三肽的液相合成方法。

附图说明

[0056] 图1为HOBT衍生物的红外光谱图；

[0057] 图2为类蛇毒三肽的HPLC图。

具体实施方式

[0058] 以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：

[0059] 实施例1：

[0060] 一种类蛇毒三肽的液相合成方法，

[0061] HOBT衍生物的制备：将3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯加入正庚醇中，加入水合肼溶液，在回流温度下反应6h，反应完成后，冷却至60℃，加入碱性溶液，搅拌处理30min，蒸馏回收水合肼和正庚醇，反应液中加入大量去离子水，调节pH至3.5，析出沉淀，过滤，冰水洗涤，得到HOBT衍生物。3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯的使用量为正庚醇的80wt%，水合肼溶液的质量分数为60%，水合肼溶液的使用量为3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯的360wt%，碱性溶液为氢氧化钠溶液，碱性溶液中含有40wt%的氢氧化钠，碱性溶液的使用量使氢氧化钠为3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯的20wt%。

[0062] 化合物3的制备：将化合物1和HOBT衍生物加入DMF中，然后加入化合物2和NMM，搅拌溶解，加入EDCI，在30℃的温度搅拌下处理12h，TLC监测反应，反应完成后，加入大量去离子水，析出固体并弃去上层清液，去离子水洗涤固体，然后加入DCM溶解固体，溶解后分层，除去水相，DCM层干燥，过滤，滤液经旋蒸除去DCM得到化合物3。化合物1的使用量为DMF的1wt%，HOBT衍生物的使用量为化合物1的40wt%，化合物2的使用量为化合物1的25wt%，NMM的使用量为化合物1的30wt%，EDCI的使用量为化合物1的550wt%。反应完成后去离子水达到分离析出固体的效果，DCM的使用达到溶解效果，其量的变化对实验结果无影响，因而不限定去离子水及DCM的使用量。

[0063] 化合物4的制备：将化合物3加入PIP‑DCM溶液中，搅拌反应3h，反应完成后，加入去离子水，萃取分液取有机相，去离子水洗涤分液，有机相干燥，过滤，滤液经旋蒸除去溶剂得到固体，固体采用石油醚‑乙酸乙酯溶液打浆洗涤分液，过滤得到化合物4。PIP‑DCM溶液中由PIP与DCM混合而成，PIP‑DCM溶液中含有20wt%的PIP，化合物3的使用量为PIP‑DCM溶液的8wt%，石油醚‑乙酸乙酯溶液由石油醚和乙酸乙酯混合而成，石油醚‑乙酸乙酯溶液中含有
50wt%的石油醚。反应完成后去离子水达到分离的效果，石油醚‑乙酸乙酯溶液的使用为达到打浆洗涤分液的效果，其量的变化对实验结果无影响，因而不限定去离子水及石油醚‑乙酸乙酯溶液的使用量。

[0064] 化合物7的制备：将化合物5、化合物6、HOBT衍生物加入DCM中，加入NMM，然后再加入EDCI，在30℃的温度搅拌下处理12h，TLC监测反应，反应完成后，加入大量去离子水，分层分离出有机相，有机相依次采用碳酸氢钠水溶液、盐酸水溶液、去离子水洗涤分液，有机相干燥，过滤，滤液旋蒸除去溶剂得到化合物7。化合物5的使用量为DCM的0.8wt%，化合物6的使用量为化合物5的1000wt%，HOBT衍生物的使用量为化合物5的800wt%，NMM的使用量为化合物5的60wt%，EDCI的使用量为化合物5的120wt%。反应完成后对化合物7的分离中使用的各试剂的量的变化对实验结果无影响，因而不限定其使用量。碳酸氢钠溶液的质量分数为6wt%，盐酸溶液的浓度为1M。

[0065] 化合物8的制备：将化合物7加入甲醇中，搅拌溶解，加入碱性溶液，在30℃的温度搅拌反应3h，TLC监测反应，反应完成后，浓缩，加入石油醚‑乙酸乙酯溶液，搅拌混合，静置分层收集水相，水相调pH至3，然后采用DCM萃取分液，收集有机相，有机相采用饱和氯化钠洗涤分液，有机相经干燥，过滤，滤液经旋蒸除去DCM，得到化合物8。化合物7的使用量为甲醇的120wt%，碱性溶液为氢氧化钠溶液，碱性溶液中含有4wt%的氢氧化钠，碱性溶液的使用量使氢氧化钠为化合物7的20wt%，石油醚‑乙酸乙酯溶液由石油醚和乙酸乙酯混合而成，石油醚‑乙酸乙酯溶液中含有50wt%的石油醚。反应完成后对化合物8的分离中使用的各试剂的量的变化对实验结果无影响，因而不限定其使用量。

[0066] 化合物9的制备：将化合物8加入DMF中搅拌溶解得到化合物8溶液，将化合物4加入DMF中搅拌溶解得到化合物4溶液，将化合物8溶液与化合物4溶液混合，然后加入HOBT衍生物，加入EDCI，在30℃的温度下反应4h，TLC监测反应，反应完成后，加入去离子水‑乙酸乙酯溶液萃取分液，有机相依次采用碳酸钠溶液、盐酸溶液、去离子水和饱和氯化钠溶液进行洗涤，干燥，过滤，滤液经旋蒸除去乙酸乙酯，得到化合物9。化合物8溶液中含有20wt%的化合物8，化合物4溶液中含有20wt%的化合物4，化合物8溶液与化合物4溶液的混合中使化合物4的量为化合物8的90wt%，HOBT衍生物的使用量为化合物8的50wt%，EDCI的使用量为化合物8的800wt%，去离子水‑乙酸乙酯溶液由去离子水和乙酸乙酯混合而成，去离子水‑乙酸乙酯溶液中含有50wt%的去离子水。碳酸钠溶液的质量分数为6wt%，盐酸溶液的浓度为1M。

[0067] 类蛇毒三肽的制备：将化合物9加入盐酸水溶液中，在30℃的温度下搅拌反应4h，旋蒸除去水，纯化反相制备得到类蛇毒三肽。盐酸水溶液的浓度为6mol/L，化合物9的使用量为盐酸水溶液的30wt%。

[0068] 实施例2：

[0069] 一种类蛇毒三肽的液相合成方法，

[0070] 化合物3的制备中可以加入氰尿酸，氰尿酸的使用量为化合物1的2‑8wt%。在使用氰尿酸时，需要将氰尿酸与HOBT衍生物连用，而如果将氰尿酸与HOBT共同使用则对最终得到的类蛇毒三肽的收率基本没有提高效果。

[0071] HOBT衍生物的制备：将3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯加入正庚醇中，加入水合肼溶液，在回流温度下反应6h，反应完成后，冷却至60℃，加入碱性溶液，搅拌处理30min，蒸馏回收水合肼和正庚醇，反应液中加入大量去离子水，调节pH至3.5，析出沉淀，过滤，冰水洗涤，得到HOBT衍生物。3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯的使用量为正庚醇的80wt%，水合肼溶液的质量分数为60%，水合肼溶液的使用量为3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯的360wt%，碱性溶液为氢氧化钠溶液，碱性溶液中含有40wt%的氢氧化钠，碱性溶液的使用量使氢氧化钠为3‑氯‑4‑硝基苯甲酸甲酯的20wt%。

[0072] 化合物3的制备：将化合物1和HOBT衍生物加入DMF中，然后加入化合物2和NMM、氰尿酸，搅拌溶解，加入EDCI，在30℃的温度搅拌下处理12h，TLC监测反应，反应完成后，加入大量去离子水，析出固体并弃去上层清液，去离子水洗涤固体，然后加入DCM溶解固体，溶解后分层，除去水相，DCM层干燥，过滤，滤液经旋蒸除去DCM得到化合物3。化合物1的使用量为DMF的1wt%，HOBT衍生物的使用量为化合物1的40wt%，化合物2的使用量为化合物1的25wt%，NMM的使用量为化合物1的30wt%，氰尿酸的使用量为化合物1的4wt%，EDCI的使用量为化合物1的550wt%。反应完成后去离子水达到分离析出固体的效果，DCM的使用达到溶解效果，其量的变化对实验结果无影响，因而不限定去离子水及DCM的使用量。

[0073] 化合物4的制备：将化合物3加入PIP‑DCM溶液中，搅拌反应3h，反应完成后，加入去离子水，萃取分液取有机相，去离子水洗涤分液，有机相干燥，过滤，滤液经旋蒸除去溶剂得到固体，固体采用石油醚‑乙酸乙酯溶液打浆洗涤分液，过滤得到化合物4。PIP‑DCM溶液中由PIP与DCM混合而成，PIP‑DCM溶液中含有20wt%的PIP，化合物3的使用量为PIP‑DCM溶液的8wt%，石油醚‑乙酸乙酯溶液由石油醚和乙酸乙酯混合而成，石油醚‑乙酸乙酯溶液中含有
50wt%的石油醚。反应完成后去离子水达到分离的效果，石油醚‑乙酸乙酯溶液的使用为达到打浆洗涤分液的效果，其量的变化对实验结果无影响，因而不限定去离子水及石油醚‑乙酸乙酯溶液的使用量。

[0074] 化合物7的制备：将化合物5、化合物6、HOBT衍生物加入DCM中，加入NMM，然后再加入EDCI，在30℃的温度搅拌下处理12h，TLC监测反应，反应完成后，加入大量去离子水，分层分离出有机相，有机相依次采用碳酸氢钠水溶液、盐酸水溶液、去离子水洗涤分液，有机相干燥，过滤，滤液旋蒸除去溶剂得到化合物7。化合物5的使用量为DCM的0.8wt%，化合物6的使用量为化合物5的1000wt%，HOBT衍生物的使用量为化合物5的800wt%，NMM的使用量为化合物5的60wt%，EDCI的使用量为化合物5的120wt%。反应完成后对化合物7的分离中使用的各试剂的量的变化对实验结果无影响，因而不限定其使用量。碳酸氢钠溶液的质量分数为6wt%，盐酸溶液的浓度为1M。

[0075] 化合物8的制备：将化合物7加入甲醇中，搅拌溶解，加入碱性溶液，在30℃的温度搅拌反应3h，TLC监测反应，反应完成后，浓缩，加入石油醚‑乙酸乙酯溶液，搅拌混合，静置分层收集水相，水相调pH至3，然后采用DCM萃取分液，收集有机相，有机相采用饱和氯化钠洗涤分液，有机相经干燥，过滤，滤液经旋蒸除去DCM，得到化合物8。化合物7的使用量为甲醇的120wt%，碱性溶液为氢氧化钠溶液，碱性溶液中含有4wt%的氢氧化钠，碱性溶液的使用量使氢氧化钠为化合物7的20wt%，石油醚‑乙酸乙酯溶液由石油醚和乙酸乙酯混合而成，石油醚‑乙酸乙酯溶液中含有50wt%的石油醚。反应完成后对化合物8的分离中使用的各试剂的量的变化对实验结果无影响，因而不限定其使用量。

[0076] 化合物9的制备：将化合物8加入DMF中搅拌溶解得到化合物8溶液，将化合物4加入DMF中搅拌溶解得到化合物4溶液，将化合物8溶液与化合物4溶液混合，然后加入HOBT衍生物，加入EDCI，在30℃的温度下反应4h，TLC监测反应，反应完成后，加入去离子水‑乙酸乙酯溶液萃取分液，有机相依次采用碳酸钠溶液、盐酸溶液、去离子水和饱和氯化钠溶液进行洗涤，干燥，过滤，滤液经旋蒸除去乙酸乙酯，得到化合物9。化合物8溶液中含有20wt%的化合物8，化合物4溶液中含有20wt%的化合物4，化合物8溶液与化合物4溶液的混合中使化合物4的量为化合物8的90wt%，HOBT衍生物的使用量为化合物8的50wt%，EDCI的使用量为化合物8的800wt%，去离子水‑乙酸乙酯溶液由去离子水和乙酸乙酯混合而成，去离子水‑乙酸乙酯溶液中含有50wt%的去离子水。碳酸钠溶液的质量分数为6wt%，盐酸溶液的浓度为1M。

[0077] 类蛇毒三肽的制备：将化合物9加入盐酸水溶液中，在30℃的温度下搅拌反应4h，旋蒸除去水，纯化反相制备得到类蛇毒三肽。盐酸水溶液的浓度为6mol/L，化合物9的使用量为盐酸水溶液的30wt%。

[0078] 对比例1：

[0079] 本对比例与实施例1相比，不同之处仅在于，将HOBT衍生物替换为HOBT。

[0080] 对比例2：

[0081] 本对比例与实施例2相比，不同之处仅在于，将HOBT衍生物替换为HOBT。

[0082] 试验例：

[0083] 1.红外光谱表征

[0084] 测试样品：实施例1中制备得到的HOBT衍生物。

[0085] 本发明制备得到的HOBT衍生物的红外表征结果如图1所示，其中，在3102cm‑1处为‑1 ‑1羟基的红外吸收峰，在2945cm 处为甲基的红外吸收峰，在1708cm 处为羰基的红外吸收‑1
峰，在1618cm 处为氮氮双键的红外吸收峰，表明得到HOBT衍生物。

[0086] 2.类蛇毒多肽的HPLC液相检测

[0087] 液相检测中，流动相A为含有0.1wt%TFA的水，流动相B为含有0.1wt%TFA的乙腈；梯度洗涤，流动相B在20min的时间内从体积占比为10%提高到20%。

[0088] HPLC液相检测结果如图2所示，出峰时间为10.069min，且基本无杂质峰，表明经本发方法制备得到的类蛇毒多肽的纯度高，基本没有杂质。本发明实施例1制备得到的类蛇毒多肽的纯度为99.8124%。

[0089] 3.类蛇毒多肽的总收率

[0090] 本发明实施例1的方法制造得到的类蛇毒多肽从初始反应物计量的总收率为29.49%，对比例1的方法制造得到的类蛇毒多肽从初始反应物计量的总收率为27.20%，实施例1与对比例1相比，表明本发明制备得到的HOBT衍生物同样具有催化多肽合成的效果，并且总收率更高；实施例2的方法制造得到的类蛇毒多肽从初始反应物计量的总收率为
30.19，对比例2的方法制造得到的类蛇毒多肽从初始反应物计量的总收率为27.55%，实施例2与实施例1、对比例1‑2相比，区别在于在实施例1制备化合物3中未使用氰尿酸，对比例1的方法将HOBT衍生物替换为HOBT，对比例2制备化合物3中使用了氰尿酸但将所有步骤中的HOBT衍生物替换为HOBT，表明氰尿酸的使用在本发明方法中，在HOBT衍生物存在下，可以提高类蛇毒多肽的总收率。

[0091] 以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。