猪神经元及其分离培养方法和应用

摘要

本发明涉及一种猪神经元及其分离培养方法和应用。该猪神经元的分离培养方法包括以下步骤：将猪大脑消化，制备分散的神经元；及将神经元接种于改良培养基中培养，其中，改良培养基包括神经细胞基础培养基、质量百分含量为1％～3％的添加剂、1mM～3mM的L‑谷氨酰胺和15μg/mL～25μg/mL的抗生素，添加剂为B‑27添加剂或无氧化剂的B‑27添加剂。上述的分离培养方法能够分离猪神经元且在培养过程中可见神经突起的生长，能够用于人类的神经退行性疾病研究。

权利要求

1.一种用于研究神经退行性疾病的猪神经元的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将猪大脑消化，制备分散的神经元；

所述制备分散的猪神经元的步骤包括：在将所述猪大脑消化后，将含有猪神经元的混合液过滤和/或离心以去除未完全消化的组织块的操作；及在将所述分散的猪神经元接种于改良培养基中培养4天，有明显突触生长时，采用含有P301L P301L表达tau突变蛋白元件Tau 的腺相关病毒AAV‑Tau 感染所述的猪神经元，并采用改良培养基继续培养感染了所述腺相关病毒的猪神经元至第12天，制备用于研究神经退行性疾病的猪神经元；

所述改良培养基包括神经细胞基础培养基、质量百分含量为2%的B‑27添加剂、2mM的L‑谷氨酰胺和20μg/mL的青霉素‑链霉素。

2.权利要求1所述的用于研究神经退行性疾病的猪神经元的制备方法制得的猪神经元。

3.一种筛选或鉴定治疗神经退行性疾病的药物的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求2所述的猪神经元，筛选或鉴定治疗神经退行性疾病的药物。

说明书

猪神经元及其分离培养方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种猪神经元及其分离培养方法和应用。

背景技术

[0002] 神经退行性疾病是一类因神经元结构或功能逐渐丧失甚至死亡而引起神经系统功能障碍的疾病，由于神经元或其髓鞘的丧失，神经退行性疾病随着时间的推移而恶化，最终导致神经功能障碍。常见的神经退行性疾病包括阿尔茨海默症、帕金森症、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩侧索硬化症、额颞叶痴呆等。除了少数家族性神经退行性疾病有明确的致病基因外，大多数神经退行性疾病的发病机制尚不清楚，也缺乏有效的治疗手段。神经退行性疾病共有的病理特征是神经元的损伤和丢失及细胞内蛋白聚集。因此，建立这类疾病的神经细胞模型将为探索该类疾病的致病机理、治疗策略等奠定牢固的基础。

[0003] 在神经退行性疾病的发生发展中扮演重要角色的微管相关蛋白tau(microtubule‑associated protein tau，简称tau蛋白)，是成熟神经元的主要微管相关蛋白。Tau蛋白是一种含有磷酸基的蛋白，但是当该蛋白出现过度磷酸化时，就会丧失其生物活性，进而产生各种神经病理现象。与tau蛋白异常相关的神经退行性疾病包括阿尔茨海默症、额颞叶痴呆、皮质基底节综合征、帕金森综合征、伴步态冻结的纯性运动障碍、以及罕见的运动神经元症状或小脑共济失调。

[0004] 最常见的神经退行性疾病动物模型是小鼠模型，但啮齿动物和灵长类动物之间存在相当大的差异。例如，纹状体是亨廷顿疾病中受影响最严重的区域，而灵长类动物和大动物(例如猪)的纹状体由尾状核和壳核组成，啮齿动物(例如小鼠)的纹状体的尾状核和壳核是无法区分的；又例如，在脑结构和体积中，小鼠大脑没有沟回且体积与人类大脑相差甚远。而且，有研究表明，在各种神经退行性疾病中，小鼠模型难以很好的模拟与该疾病患者类似的表型和病理特征。例如亨廷顿舞蹈症患者脑内会出现大量神经元的丢失与死亡，但在小鼠模型中看不到明显的神经元的死亡现象。此外，很多在小鼠实验中验证有疗效的药物，在临床实验中发现对病人没有疗效，这说明啮齿动物和人类大脑之间神经病理学的差异，也体现了对更接近人类的大型哺乳动物的研究需求。

[0005] 在大动物猪模型中，其大脑与人类大脑结构相似，都有大量的沟回，且其体积也与人脑体积更为接近。其中猪亨廷顿疾病模型不仅可以表现出与病人相似的舞蹈样运动障碍，而且出现了与患者相似的选择性神经元死亡以及纹状体萎缩现象。并且，猪的心血管系统、消化系统、皮肤、营养需要、骨骼发育以及矿物质代谢等都与人的情况极其相似。此外，猪的体型大小和驯服习性允许进行反复采样和进行各种外科手术。所以更多科学家开始把目光转移到猪身上，尤其是小型猪。

[0006] 目前，分离及培养啮齿类动物如小鼠的神经元已经非常成熟，但对于猪神经元，虽然能够成功分离，但还不能满足神经退行性疾病研究的需求。

发明内容

[0007] 基于此，有必要提供一种猪神经元的分离培养方法，以弥补没有可用于神经退行性疾病研究的猪神经元的分离培养方法的缺陷。

[0008] 一种猪神经元的分离培养方法，包括以下步骤：

[0009] 将猪大脑消化，制备分散的神经元；及

[0010] 将所述神经元接种于改良培养基中培养，其中，所述改良培养基包括神经细胞基础培养基、质量百分含量为1％～3％的B‑27添加剂、1mM～3mM的L‑谷氨酰胺和15μg/mL～25μg/mL的抗生素。

[0011] 上述猪神经元的分离培养方法通过采用含有1％～3％的B‑27添加剂、1mM～3mM的L‑谷氨酰胺和15～25μg/mL的抗生素的神经细胞基础培养基培养来自大脑皮层的神经元，培养时间可达到12天以上，并且培养过程中可见神经突起的生长，能够用于神经退行性疾病研究。

[0012] 在其中一个实施例中，所述改良培养基包括神经细胞基础培养基、质量百分含量为5％～2％的B‑27添加剂、5mM～2.5mM的L‑谷氨酰胺和15～20μg/mL的抗生素。

[0013] 在其中一个实施例中，所述抗生素包括青霉素、链霉素、两性霉素B和庆大霉素中一种或多种。

[0014] 在其中一个实施例中，所述制备分散的神经元的步骤包括：在将所述猪大脑消化后，将含有细胞的混合液过滤和/或离心以去除未完全消化的组织块的操作。

[0015] 上述的猪神经元的分离培养方法培养得到的猪神经元。

[0016] 一种用于研究神经退行性疾病的细胞的制备方法，包括以下步骤：

[0017] 采用含有表达tau突变蛋白元件的腺相关病毒感染上述的猪神经元的分离培养方法培养得到的猪神经元，并采用所述改良培养基继续培养感染了所述腺相关病毒的猪神经元，制备用于研究神经退行性疾病的细胞。

[0018] 在其中一个实施例中，所述tau突变蛋白包括tauP301L、tauP301S、tauV377M、tauR406W和G272Vtau 中的至少一种。

[0019] 在其中一个实施例中，所述腺相关病毒为AAV9。

[0020] 上述的用于研究神经退行性疾病的细胞的制备方法制得的细胞。

[0021] 一种筛选或鉴定治疗神经退行性疾病的药物的方法，所述方法使用上述的猪神经元的分离培养方法制得的猪神经元或上述的用于研究神经退行性疾病的细胞的制备方法制得的细胞，筛选或鉴定治疗神经退行性疾病的药物。

附图说明

[0022] 图1为实施例1的分离得到的神经元培养2天、5天、8天和12天的形态；

[0023] 图2为实施例1的分离得到的神经元培养8天的β‑tubulin3免疫荧光染色结果；

[0024] 图3为实施例1中感染AAV‑Tau(P301L)病毒后的神经元的免疫荧光染色结果；

[0025] 图4为实施例2的分离得到的神经元培养2天、5天、8天和12天的形态；

[0026] 图5为实施例3的分离得到的神经元培养2天、5天、8天和12天的形态。

具体实施方式

[0027] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

[0028] 术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。术语“可选地”表示举例说明。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

[0029] 术语“神经元”即神经元细胞，是神经系统最基本的结构和功能单位。神经元分为细胞体和突起两部分。细胞体由细胞核、细胞膜、细胞质组成，具有联络和整合输入信息并传出信息的作用。突起有树突和轴突两种。树突短而分枝多，直接由细胞体扩张突出，形成树枝状，其作用是接受其他神经元轴突传来的冲动并传给细胞体。轴突长而分枝少，为粗细均匀的细长突起，常起于轴丘，其作用是接受外来刺激后，经整合信息并由细胞决定传出信号的特性再由细胞体至轴突传出。轴突除分出侧枝外，其末端形成树枝样的神经末梢。末梢分布于某些组织器官内，形成各种神经末梢装置。感觉神经末梢形成各种感受器；运动神经末梢分布于骨骼肌肉，形成运动终极。

[0030] 术语“突触”指一个神经元的冲动传到另一个神经元或传到另一细胞间的相互接触的结构。突触是神经元之间在功能上发生联系的部位，也是信息传递的关键部位。在光学显微镜下，可以看到一个神经元的轴突末梢经过多次分支，最后每一小支的末端膨大呈杯状或球状，叫做突触小体。这些突触小体可以与多个神经元的细胞体或树突相接触，形成突触。从电子显微镜下观察，可以看到，这种突触是由突触前膜、突触间隙和突触后膜三部分构成。

[0031] 本申请一实施方式提供了一种猪神经元的分离培养方法，该分离培养方法包括步骤S10和步骤S20。具体地：

[0032] S10：将猪大脑消化，制备分散的神经元。

[0033] 具体地，消化是为了将猪大脑分散。可选地，被消化的猪大脑可以是猪大脑皮层组织、猪纹状体、海马体及小脑中的至少一种。在一个可选地具体示例中，被消化的猪大脑是猪大脑皮层组织。在其中一个实施例中，消化采用的试剂为0.25％的胰酶。可以理解的是，在其他实施例中，消化采用的试剂不限于0.25％的胰酶，还可以是其他试剂。进一步地，将3 3
猪大脑剪碎为0.5mm～1.5mm大小的组织块进行消化；消化的时间为12min～20min。

[0034] 可选地，猪大脑来自猪胚胎。在一些实施例中，上述的猪神经元的分离培养方法还包括获取猪大脑的步骤。可选地，获取猪大脑的步骤包括：在孕猪怀孕50天左右，将孕猪麻醉后取子宫，剖开子宫取出胚胎；然后剖出胚胎的全脑后切取一小块皮层；将取得的一小块皮层置于含有冷的无菌PBS的细胞培养皿中后，去掉脑膜；将去脑膜后的皮层转移至新的含有冷的PBS的细胞培养皿中，并将残余脑膜清洗，获得干净的猪大脑。

[0035] 进一步地，制备分散的神经元的步骤包括：在将猪大脑消化后，将含有细胞的混合液过滤和/或离心以去除未完全消化的组织块的操作。

[0036] 在一些实施例中，采用组织细胞过滤器去除消化后的含有细胞的混合液中未完全消化的组织块。更进一步地，组织细胞过滤器的孔径为40μm～70μm。可选地，先采用70μm孔径的组织细胞过滤器过滤后，取滤液采用40μm孔径的组织细胞过滤器过滤。先采用孔径较大的组织细胞过滤器过滤较大的组织块，后采用孔径较小的组织细胞过滤器进一步过滤，进一步减少未完全消化的组织块。

[0037] 在另一些实施例中，采用离心的方式去除消化后的含有细胞的混合液中的未完全消化的组织块。可选地，离心的转速为1000rpm～1400rpm，离心时间为3min～5min。

[0038] 在另一些实施例中，先采用70μm孔径的组织细胞过滤器过滤后，将滤液采用40μm孔径的组织细胞过滤器过滤，最后将滤液经1200rpm离心3min～5min。

[0039] S20：将神经元接种于改良培养基中培养。

[0040] 具体地，改良培养基包括神经细胞基础培养基、质量百分含量为1％～3％的添加剂、1mM～3mM的L‑谷氨酰胺和15～25μg/mL的抗生素，添加剂为B‑27添加剂或无氧化剂的B‑27添加剂。传统培养猪神经元的方法虽然能够分离猪神经元，但无法长时间培养且无突起生长，难以满足神经退行性疾病研究。而经本申请发明人研究发现，猪神经元无法长时间培养的原因可能是分离后的猪神经元能量不足而神经元的突起无法生长，进而很快死亡。因此，上述的猪神经元的分离培养方法对培养离体后的神经元的培养基进行改良，在神经细胞基础培养基的基础上引入添加剂(B‑27添加剂或无氧化剂的B‑27添加剂)和L‑谷氨酰胺，通过添加剂和L‑谷氨酰胺的配合，改善神经突起生长和延长神经元培养时间。

[0041] 神经细胞基础培养基用于为神经元的生长提供必要的营养。具体地，神经细胞基础培养基为市售的可用于培养神经细胞的培养基。在其中一个实施例中，神经细胞基础培养基为Gibco的Neurolbasel，货号为21103049。

[0042] 添加剂用于维持神经元生长和活性。在一些实施例中，添加剂为B‑27添加剂。B‑27添加剂是一种无血清添加剂。在其中一个实施例中，B‑27添加剂为Gibco的17504‑044。在另一个实施例中，添加剂为无抗氧化剂的B‑27添加剂。无抗氧化剂的B‑27添加剂是B‑27添加剂在去除五种抗氧化剂(维生素E、乙酸维生素E、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽)后的添加剂，专为研究自由基在老化、毒性、凋亡和慢性神经系统疾病中的作用而设计。

[0043] 抗生素用于防止细菌和/或真菌等微生物污染而导致神经元无法生长。可选地，抗生素包括青霉素、链霉素、两性霉素B和庆大霉素中一种或多种。在其中一个实施例中，抗生素为青霉素和链霉素。可以理解的是，在其他实施例中，抗生素不限于上述。

[0044] 进一步地，改良培养基包括神经细胞基础培养基、质量百分含量为1.5％～2％的B‑27添加剂、1.5mM～2.5mM的L‑谷氨酰胺和15μg/mL～20μg/mL的抗生素。在一个可选地具体示例中，改良培养基包括神经细胞基础培养基、质量百分含量为2％的B‑27添加剂、2mM的L‑谷氨酰胺和20μg/mL的抗生素。更进一步地，改良培养基包括神经细胞基础培养基、质量百分含量为1.8％～2％的B‑27添加剂、1.5mM～2mM的L‑谷氨酰胺和18μg/mL～20μg/mL的抗生素。

[0045] 具体地，将接种好的神经元细胞于37℃细胞培养箱进行培养，前三天每天进行半换液，之后每两天换一次液。为了使细胞更为洁净，每次换液前可轻轻拍打培养皿四周，使细胞杂质、组织碎片等从培养皿壁上脱落下来。

[0046] 具体地，用于培养神经元细胞的培养皿是经D‑多聚赖氨酸包被的细胞培养皿。在其中一个实施例中，经D‑多聚赖氨酸包被的细胞培养皿的制备方法包括以下步骤：包被液为含有终浓度100ug/ml的D‑多聚赖氨酸，每个培养皿加入对应体积的包被液，10cm培养皿中加入大概10ml左右包被液，六孔板中大概加入2ml/孔的包被液，十二孔板大概加入1ml/孔的包被液。37℃培养箱过夜。在使用包被后的培养皿之前，回收包被液，并用无钙镁离子的PBS将培养皿润洗三遍，洗干净残留包被液。

[0047] 可以理解的是，上述步骤S10中的过滤的次数不限于一次，还可以是多次。多次过滤可以进一步减少细胞悬浮液中未完全消化的组织块。此外，在过滤时，还可以用培养基冲洗滤网，以使得滤液中有更多的细胞。当然，此处的培养基可以是改良培养基，也可以是神经细胞基础培养基。

[0048] 上述猪神经元的分离培养方法能够成功分离猪神经元并进行原代培养，培养时间可以达到12天以上，并在3～4天左右突触已经开始很好的生长，在8天左右轴突生长极为明显，并且神经元之间相互联系。

[0049] 此外，本申请一实施方式还提供了一种离体的猪神经元，该猪神经元由上述任一实施例的猪神经元的分离培养方法培养得到。

[0050] 另外，本申请一实施方式还提供了一种用于研究神经退行性疾病的细胞的制备方法，该制备方法包括：

[0051] S100：采用含有表达tau突变蛋白元件的腺相关病毒感染上述任一实施例的猪神经元的分离培养方法培养得到的猪神经元。

[0052] tau蛋白是一种微管相关蛋白。正常脑中tau蛋白的细胞功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管。tau蛋白为含磷酸基蛋白，正常人脑中tau蛋白每分子含2～3个磷酸基，而阿尔茨海默症患者脑的tau蛋白则异常过度磷酸化，每分子tau蛋白可含5～9个磷酸基，P301L P301S V377M R406W并丧失正常生物功能。可选地，tau突变蛋白包括tau 、tau 、tau 、tau 和G272V P301L
tau 中的至少一种。需要说明的是，tau 是指人tau蛋白的从N端开始第301位的P(脯P301S
氨酸)突变为L(亮氨酸)；tau 指人tau蛋白的从N端开始第301位的P(脯氨酸)突变为S(丝氨酸)；其余tau突变蛋白依次类推。

[0053] 腺相关病毒(Adreno‑Associated Virus，AAV)是一个常见的人细小病毒，自然缺陷、无包被和无致病原性。AAV感染小鼠神经元时，但是感染效率低，并且感染后神经元出现大量死亡。而上述任一实施例的猪神经元的分离培养方法制得的猪神经元的细胞状态佳，可以抵抗病毒自身的毒性作用。进一步地，腺相关病毒为AAV9。AAV9对神经元具有特异的感染效率，效率高。可表达tau突变蛋白的空载体不限于AAV，还可以是腺病毒，或者其他病毒载体。其他病毒载体包括但不限制于：甲病毒载体、疱疹病毒载体、麻疹病毒载体、痘病毒载体、疱疹性口炎病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。

[0054] 更具体地，含有表达tau突变蛋白元件的腺相关病毒的制备方法为本领域常规的方法。例如将装载有表达tau突变蛋白元件与腺相关病毒包装相关的载体孵育后获得。

[0055] 在一些实施例中，在有明显突触生长时，采用含有表达tau突变蛋白元件的腺相关病毒感染猪神经元。在有明显突触生长时，神经元生长趋于稳定，有一定的承受病毒的能力，不会因为病毒的感染而死亡。另外，当神经元培养至轴突稳定时，此时细胞的代谢会减慢，容易导致感染效率低。

[0056] S200：培养感染腺相关病毒的猪神经元，制备用于研究神经退行性疾病的细胞。

[0057] 具体地，继续使用上述的改良培养基培养感染后的猪神经元，并观察细胞状态及细胞形态变化。

[0058] 经验证，上述的用于研究神经退行性疾病的细胞的制备方法制得细胞有明显的轴突断裂，很好的模拟了人类神经元的病理死亡特征。

[0059] 另外，本申请一实施方式还提供了一种用于研究神经退行性疾病的细胞，该细胞有明显的轴突断裂现象，可以很好的模拟了人类神经元的病理死亡特征。具体地，该细胞由上述任一实施例的用于研究神经退行性疾病的细胞的制备方法制得。

[0060] 此外，本申请一实施方式还提供了一种上述用于研究神经退行性疾病的细胞或者上述任一实施例的猪神经元的分离培养方法培养的猪神经元的用途，该用途为筛选或鉴定用于治疗神经退行性疾病的药物。进一步地，本申请一实施方式还提供了一种筛选或鉴定治疗神经退行性疾病的药物的方法，该方法使用上述的猪神经元的分离培养方法培养得到的猪神经元或上述的用于研究神经退行性疾病的细胞的制备方法制得的细胞，筛选或鉴定治疗神经退行性疾病的药物。

[0061] 具体实施例

[0062] 以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

[0063] 实施例1

[0064] 1、实验前一天准备下述材料：

[0065] (1)D‑多聚赖氨酸包被的细胞培养皿：包被液为含有终浓度为100μg/mL D‑多聚赖氨酸的灭菌蒸馏水；每个培养皿加入对应体积的包被液，10cm培养皿中加入大概10mL左右包被液，六孔板中加入2mL/孔的包被液，十二孔板加入1mL/孔的包被液，37℃培养箱过夜。

[0066] (2)改良培养基：含有2％B‑27(Gibco，17504044)、2mM L‑Glutamine(Gibco，25030‑081)和20μg/mL青霉素‑链霉素(Gibco，15140‑122)的Neurolbasel(Gibco，
21103049)培养基。

[0067] (3)含有20μg/mL青霉素‑链霉素双抗的无钙镁离子的PBS；

[0068] (4)高压灭菌后的尖镊、直镊、弯镊和剪刀各两把。

[0069] 2、手术当天进行如下手术前准备：

[0070] (1)将手术刀、手术剪和镊子浸泡于75％酒精中；

[0071] (2)准备麻药；

[0072] (3)回收包被液，使用无钙镁离子的PBS将包被的细胞培养皿润洗三次，洗干净残留包被液；

[0073] (4)准备10cm细胞培养皿，加入30mL无钙镁离子的PBS，再准备6cm细胞培养皿，加入10mL无钙镁离子的PBS，并将上述细胞培养皿置于冰上。

[0074] 完成上述准备工作之后，进行手术取材及细胞的分离和培养，具体步骤如下：

[0075] S1：在孕猪怀孕50天，将孕猪麻醉后取出子宫，剖开子宫取出胚胎。然后剖出胚胎全脑后切取一小块大脑皮层，并将其置于含有冷的无菌PBS的10cm细胞培养皿中，去掉脑膜；然后将去脑膜后的皮层转移至新的含有冷的PBS的细胞培养皿中，将残余脑膜清洗干净3
后转移至新的无PBS的细胞培养皿中，然后用剪刀将干净的皮层剪碎为1mm的碎块。

[0076] S2：向步骤S1获得的大脑皮层碎块中加入0.25％的胰酶，吹打均匀，于37℃细胞培养箱消化15分钟。

[0077] S3：加入1倍准备好的改良培养基终止消化。

[0078] S4：将70μm的组织细胞过滤器置于50mL离心管，先用改良培养基润湿，然后将消化好的组织置于该滤器进行过滤，最后用改良培养基冲洗一次滤网，以获得更多的细胞。

[0079] S5：将40μm的组织细胞过滤器置于50mL离心管，先用改良培养基润湿，然后将步骤S4中得到的滤液置于该过滤器进行过滤，进一步减少未完全消化的组织块。

[0080] S6：将50mL离心管中的滤液经过1200rpm离心5min。

[0081] S7：弃上清，收集细胞沉淀。然后向沉淀中加入改良培养基重悬细胞，于显微镜下4 2
计数，再将细胞按合适的浓度1×10/cm接种于经过D‑多聚赖氨酸包被的细胞培养皿中。

[0082] S8：将种好的细胞于37℃细胞培养箱进行培养，前三天每天进行半换液。之后每两天换一次液。为了使细胞更为洁净，每次换液前轻轻拍打培养皿四周，使细胞杂质，组织碎片等，从培养皿壁上脱落下来，培养过程中的部分细胞形态如图1所示。由图1可知，细胞培养的第8天有清晰可见的神经元，细胞体和轴突明显。

[0083] 为了验证我们分离的细胞是否真的是神经元，我们对神经元的标志蛋白β‑tubulin3进行染色，染色结果如图2所示。

[0084] S9：在细胞培养4天，有明显突触生长的时候，感染AAV‑Tau(P301L)病毒，病毒感染后每天观察细胞状态及细胞形态变化。其中，AAV‑Tau(P301L)病毒是含有tau突变蛋白P301Ltau 表达元件的AAV，购自广州派真生物技术有限公司。

[0085] S10：在细胞培养第12天，取感染病毒的细胞进行免疫荧光染色鉴定，用P‑tau标记感染的神经元，用β‑tubulin3标记所有神经元，结果如图3所示。图3中，“WT”是未感染病毒的神经元对照组，“AAV‑Tau”是感染病毒后的神经元组(最下面的两排为平行样，均是感染病毒后的神经元组)。

[0086] 由图3可知，tau突变蛋白有表达，AAV‑Tau(P301L)病毒有很高的感染效率，并且发现有转染了AAV‑Tau(P301L)病毒的神经元明显的轴突断裂(图3的箭头处)，很好的模拟了人类神经元的病理死亡特征，说明用于研究神经性退行疾病的细胞构建成功。这也说明采用上述方法仅用12天就可以成功建立了tau疾病的细胞模型，大大缩短了神经退行性疾病细胞的病理发病时间，进而极大的缩短实验周期。

[0087] 实施例2

[0088] 本实施例的神经元的分离培养方法大致与实施例1相同，其不同在于，本实施例的改良培养基中不含B‑27添加剂，其他组成与实施例1的改良培养基相同。

[0089] 本实施例培养的神经元的部分细胞形态如图4所示。由图4可以看出，神经元突起无法很好的生长，并且在12天时，细胞就已经老化，突起萎缩。

[0090] 实施例3

[0091] 本实施例的神经元的分离培养方法大致与实施例1相同，其不同在于，本实施例的改良培养基中不含L‑谷氨酰胺，其他组成与实施例1的改良培养基相同。

[0092] 本实施例培养的神经元的部分细胞形态如图5所示。由图5可以看出，神经元突起生长缓慢，并且细胞表现出营养不良的老化现象。

[0093] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0094] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。