一种蒜头果再生体系的建立方法

摘要

本发明公开了一种蒜头果再生体系的建立方法，属于组织培养技术领域。所述建立方法包括(1)将蒜头果叶片外植体接种至愈伤组织诱导培养基中，进行诱导培养，得到愈伤组织；(2)将所述愈伤组织转至愈伤组织增殖培养基，进行增殖培养，得到增殖的愈伤组织；(3)将所述增殖的愈伤组织接种至芽分化诱导培养基，进行芽分化诱导，得到分化芽；(4)将所述分化芽接种至生根培养基，进行生根诱导，得到再生苗。本发明建立了一套稳定成熟的蒜头果组织培养再生体系的方法，为蒜头果高效工厂化育苗提供良好的技术支撑，对于濒危植物种群扩大及定向遗传改良奠定基础。

权利要求

1.一种蒜头果再生体系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将蒜头果叶片外植体接种至愈伤组织诱导培养基中，进行诱导培养，得到愈伤组‑1织；所述愈伤组织诱导培养基为以下浓度的组分：MS+2,4‑D 1.5～2.5mg·L +6‑BA 0.5～‑1

1.5mg·L ；

(2)将所述愈伤组织转至愈伤组织增殖培养基，进行增殖培养，得到增殖的愈伤组织；

‑1

所述愈伤组织增殖培养基为以下浓度的组分：MS+NAA 1.0～2.5mg·L +6‑BA 0.5～‑1

1.5mg·L ；

(3)将所述增殖的愈伤组织接种至芽分化诱导培养基，进行芽分化诱导，得到分化芽；

‑1

所述芽分化诱导培养基为以下浓度的组分：MS+NAA 0.2～0.5mg·L +6‑BA 2.0mg·L‑1；

(4)将所述分化芽接种至生根培养基，进行生根诱导，得到再生苗；所述生根培养基为‑1 ‑1以下浓度的组分：1/2MS+NAA 0.05mg·L +IBA 1.5mg·L 。

2.如权利要求1所述的蒜头果再生体系的建立方法，其特征在于，步骤(1)‑步骤(4)中，2

培养条件均为：光周期为14h光照/10h黑暗，光照强度为39～49μE/m/s，光照条件下温度为24～28℃，黑暗条件下温度为16～20℃。

3.如权利要求1所述的蒜头果再生体系的建立方法，其特征在于，步骤(2)中，在进行增殖培养时，每两周继代一次，连续继代2‑4次。

4.如权利要求1所述的蒜头果再生体系的建立方法，其特征在于，还包括：将步骤(4)中所得的再生苗移栽自然条件中培养，得到蒜头果移栽苗。

5.如权利要求4所述的蒜头果再生体系的建立方法，其特征在于，自然条件培养具体为：白天温度为26～28℃，黑夜的温度为18～22℃，相对空气湿度为70～80％。

说明书

一种蒜头果再生体系的建立方法

技术领域

[0001] 本发明涉及组织培养技术领域，特别是涉及一种蒜头果再生体系的建立方法。

背景技术

[0002] 蒜头果(Malania oleifera Chun et S.Lee ex S.Lee)为铁青树科蒜头果属常绿乔木，是我国特有的单种属珍稀濒危国家二级重点保护植物，分布于中国广西西部龙州、大新和右江流域各县及云南东部广南、富宁等地。蒜头果种仁油脂中富含高达60％以上的神经酸，具有恢复神经末梢活性、促进神经细胞再生、修复受损神经、改善记忆、预防老年痴呆等特殊功效，在医药界具有很高的开发利用前景。蒜头果树干笔直，其木材与楠木类似，纹理清晰且具有光泽，是优质的用材树种，具有高经济开发价值。国内目前主要是从蒜头果的育苗技术和保护、营林特性、种质资源和濒危机制及蒜头果油的开发利用等方面研究的比较多。

[0003] 目前，蒜头果的繁殖主要采用实生苗繁殖，但是繁殖效率较低，不能进行规模化高效生产种苗，无法满足市场需求，严重限制了蒜头果推广应用。目前我国尚无有关以蒜头果叶片为外植体开展离体再生体系的报道，更未有适合蒜头果愈伤组织诱导的培养基。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种蒜头果再生体系的建立方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法能够快速得到蒜头果再生苗，且繁殖率高，能够进行规模化高效生产种苗，满足市场对蒜头果种苗的需求。

[0005] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0006] 本发明提供一种蒜头果再生体系的建立方法，包括如下步骤：

[0007] (1)将蒜头果叶片外植体接种至愈伤组织诱导培养基中，进行诱导培养，得到愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基包括以下组分：MS+2,4‑D+6‑BA；

[0008] (2)将所述愈伤组织转至愈伤组织增殖培养基，进行增殖培养，得到增殖的愈伤组织；所述愈伤组织增殖培养基包括以下组分：MS+NAA+6‑BA；

[0009] (3)将所述增殖的愈伤组织接种芽分化诱导培养基，进行芽分化诱导，得到分化芽；所述芽分化诱导培养基包括以下组分：MS+NAA+6‑BA；

[0010] (4)将所述分化芽接种生根培养基，进行生根诱导，得到再生苗；所述生根培养基包括以下组分：1/2MS+NAA+IBA。

[0011] 优选的是，步骤(1)中，所述愈伤组织诱导培养基包括以下浓度的组分：MS+2,4‑D ‑1 ‑11.5～2.8mg·L +6‑BA 0.2～1.5mg·L 。

[0012] 优选的是，步骤(2)中，所述愈伤组织增殖培养基包括以下浓度的组分：MS+NAA1.0‑1 ‑1～2.5mg·L +6‑BA 0.5～1.5mg·L 。

[0013] 优选的是，步骤(3)中，所述芽分化诱导培养基包括以下浓度的组分：MS+NAA0.2～‑1 ‑11.0mg·L +6‑BA 0.5～2.0mg·L 。

[0014] 优选的是，步骤(4)中，所述生根培养基包括以下浓度的组分：1/2MS+NAA 0.01～‑1 ‑10.05mg·L +IBA 0.5～3.0mg·L 。

[0015] 优选的是，步骤(1)‑步骤(4)中，培养条件均为：光周期为14h光照/10h黑暗，光照2
强度为39～49μE/m/s，光照条件下温度为24～28℃，黑暗条件下温度为16～20℃。

[0016] 优选的是，步骤(2)中，在进行增殖培养时，每两周继代一次，连续继代2‑4次。

[0017] 优选的是，还包括：将步骤(4)中所得的再生苗移栽自然条件中培养，得到蒜头果移栽苗。

[0018] 优选的是，自然条件培养具体为：白天温度为26～28℃，黑夜的温度为18～22℃，相对空气湿度为70～80％。

[0019] 本发明公开了以下技术效果：

[0020] 本发明通过优化愈伤组织诱导培养基、增殖培养基以及生根培养基的组分和含量，建立了一套稳定成熟的蒜头果组织培养再生体系的方法，以蒜头果的一年生功能叶片为外植体诱导愈伤组织，其基因型一致，而且再生率高，为蒜头果高效工厂化育苗提供良好的技术支撑，对于濒危植物种群扩大及定向遗传改良奠定基础。

附图说明

[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0022] 图1为蒜头果叶片外植体诱导培养的愈伤组织；

[0023] 图2为蒜头果叶片外植体诱导愈伤组织继代增殖培养结果；

[0024] 图3为蒜头果不定芽生根成苗；

[0025] 图4为蒜头果无性克隆苗田间移栽成活苗。

具体实施方式

[0026] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0027] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0028] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0029] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

[0030] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0031] 以下实施例中愈伤组织诱导、愈伤组织增殖、芽分化以及生根诱导过程中所用的培养都是以MS培养基为基础培养基，向其中添加不同的植物激素进行培养。

[0032] 在构建蒜头果再生体系之前，先为各阶段的培养基组分进行优化：

[0033] 将一年生蒜头果叶片外植体接种不同激素含量的蒜头果愈伤组织诱导培养基(如表1)上进行诱导培养，得到愈伤组织。

[0034] 表1蒜头果叶片愈伤组织的形成

[0035]

[0036]

[0037] 注：+++愈伤组织多；++愈伤组织较多；+有愈伤组织；—无愈伤组织。具不同字母表示差异显著(p＜0.05)。

[0038] 蒜头果叶片愈伤组织诱导。叶片接种10～15d后，除A1号培养基外，其他培养基上的叶片外植体四周出现白色、淡黄或浅绿色膨大物，愈伤组织形成。随着培养时间延长，不同植物激素组合的培养基上叶片外植体诱导产生的愈伤组织其生长状态不同，其中A7培养基上的叶片外植体形成淡黄绿色愈伤组织，质地疏松，生长量最大，出愈率达100％(表1)。

[0039] 蒜头果叶片愈伤组织继代培养。将(A7)培养基诱导形成的愈伤组织切割后，接入不同的分化培养基上培养。15d时后，愈伤组织块明显增大，呈淡黄色，结构疏松。说明NAA与BA的不同浓度组合对愈伤组织增长起到了一定诱导作用，其中NAA的浓度范围为1.0～‑1 ‑12.5mg·L ；6‑BA的浓度范围为0.2～1.5mg·L (表2)。

[0040] 表2蒜头果葱愈伤组织继代培养

[0041]

[0042]

[0043] 注：+++愈伤组织多；++愈伤组织较多；具不同字母表示差异显著(p＜0.05)。

[0044] 将(B6)培养基继代培养的愈伤组织切割，接种至分化培养基上培养。25d后，愈伤组织分化出绿色芽点。40d时，不同分化培养基上愈伤组织分化情况见表3。在适宜生长素浓‑1度范围内，随着6‑BA浓度的增大，愈伤组织分化率增高，如NAA为0.2mg·L 时，6‑BA ‑1 ‑1 ‑1 ‑1
2.0mg·L 比6‑BA 0.5mg·L 的分化率高38.66％；NAA为1.0mg·L 时，6‑BA2.0 mg·L 比‑1
6‑BA 0.5mg·L 的分化率高13.04％。但是，当6‑BA浓度增大到一定高值时，愈伤组织分化‑1 ‑1 ‑1
率降低，如NAA为0.5mg·L 时，6‑BA2.5 mg·L 比6‑BA 2.0mg·L 的分化率低32.16％；
‑1 ‑1 ‑1
NAA为1.0mg·L 时，6‑BA2.5 mg·L 比6‑BA 2.0mg·L 的分化率低23.7％。这说明高浓度
6‑BA不利于愈伤组织分化。综合比较，蒜头果愈伤组织分化最佳培养基为MS+NAA 0.5mg·‑1 ‑1
L +6‑BA 2.0mg·L 。

[0045] 表3蒜头果叶片愈伤组织的分化

[0046]

[0047] 注：具不同字母表示差异显著(p＜0.05)。

[0048] 将不定芽接种到不同激素配比的生根培养基上，诱导生根，25d后观察生根情况(表4)。不定芽在5种培养基上均可生根，但是，根的发生和植株长势存在着极大的差异。生根率最高可达100％(D3、D4)；最低仅为25.67％(D5)。从生根率及根的形态综合考察，D4培养基最佳。

[0049] 表4蒜头果不定芽在生根培养基上生根

[0050]

[0051] 注：具不同字母表示差异显著(p﹤0.05)

[0052] 将根系发达、生长健壮的试管苗于18℃室温下低温炼苗一周。从培养瓶中取出，洗净根系附着的琼脂，移植到5×5cm营养钵中，移植基质为2/3草炭土、1/3腐殖质。浇足水后置于温室中管理，植株能很好地适应外界环境条件，生长势强，成活率为100％(图4)。

[0053] 实施例1蒜头果再生体系的建立方法，包括如下步骤：

[0054] (1)将一年生蒜头果叶片外植体接种至愈伤组织诱导培养基中，进行诱导培养，培2
养条件为：光周期为14h光照/10h黑暗，光照强度为39μE/m/s，光照条件下温度为24℃，黑暗条件下温度为16℃，得到愈伤组织；上述愈伤组织诱导培养基包括以下组分：MS+2,4‑D ‑1 ‑1
2.5mg·L +6‑BA 1.5mg·L 。

[0055] (2)将愈伤组织转至愈伤组织增殖培养基，进行增殖培养，培养条件为：光周期为2
14h光照/10h黑暗，光照强度为39μE/m /s，光照条件下温度为24℃，黑暗条件下温度为16‑1
℃，得到增殖的愈伤组织；上述愈伤组织增殖培养基包括以下组分：MS+NAA 1.5mg·L +6‑‑1
BA 1.5mg·L 。

[0056] (3)将增殖的愈伤组织接种芽分化诱导培养基，进行芽分化诱导，培养条件为：光2
周期为14h光照/10h黑暗，光照强度为39μE/m/s，光照条件下温度为24℃，黑暗条件下温度‑1
为16℃，得到分化芽；上述芽分化诱导培养基包括以下组分：MS+NAA 0.5mg·L +6‑BA ‑1
2.0mg·L 。

[0057] (4)将分化芽接种生根培养基，进行生根诱导，得到再生苗；上述生根培养基包括‑1 ‑1以下组分：1/2MS+NAA0.01 mg·L +IBA 0.5mg·L 。

[0058] (5)将再生苗移栽至日光温室中培养，培养条件为：日光温室的温度为26℃，黑夜的温度为18℃，相对空气湿度为70％，得到蒜头果移栽苗。

[0059] 实施例2

[0060] (1)将一年生蒜头果叶片外植体接种至愈伤组织诱导培养基中，进行诱导培养，培2
养条件为：光周期为14h光照/10h黑暗，光照强度为49μE/m/s，光照条件下温度为28℃，黑暗条件下温度为20℃，得到愈伤组织；上述愈伤组织诱导培养基包括以下组分：MS+2,4‑D ‑1 ‑1
3.0mg·L +6‑BA 1.5mg·L 。

[0061] (2)将愈伤组织转至愈伤组织增殖培养基，进行增殖培养，培养条件为：光周期为2
14h光照/10h黑暗，光照强度为49μE/m /s，光照条件下温度为28℃，黑暗条件下温度为20‑1
℃，得到增殖的愈伤组织；上述愈伤组织增殖培养基包括以下组分：MS+NAA 2.5mg·L +6‑‑1
BA 1.5mg·L 。

[0062] (3)将增殖的愈伤组织接种芽分化诱导培养基，进行芽分化诱导，培养条件为：光2
周期为14h光照/10h黑暗，光照强度为49μE/m/s，光照条件下温度为28℃，黑暗条件下温度‑1
为20℃，得到分化芽；上述芽分化诱导培养基包括以下组分：MS+NAA 1.0mg·L +6‑BA ‑1
2.0mg·L 。

[0063] (4)将分化芽接种生根培养基，进行生根诱导，得到再生苗；上述生根培养基包括‑1 ‑1以下组分：1/2MS+NAA0.05 mg·L +IBA 3.0mg·L 。

[0064] (5)将再生苗移栽至日光温室中培养，培养条件为：日光温室的温度为28℃，黑夜的温度为22℃，相对空气湿度为80％，得到蒜头果移栽苗。

[0065] 实施例3蒜头果再生体系的建立方法，包括如下步骤：

[0066] (1)将一年生蒜头果叶片外植体接种至愈伤组织诱导培养基中，进行诱导培养，培2
养条件为：光周期为14h光照/10h黑暗，光照强度为45μE/m/s，光照条件下温度为26℃，黑暗条件下温度为18℃，得到愈伤组织(见图1)；上述愈伤组织诱导培养基包括以下组分：MS+‑1 ‑1
2,4‑D 2.5mg·L +6‑BA 1.5mg·L 。

[0067] (2)将愈伤组织转至愈伤组织增殖培养基，进行增殖培养，培养条件为：光周期为2
14h光照/10h黑暗，光照强度为45μE/m /s，光照条件下温度为26℃，黑暗条件下温度为18℃，得到增殖的愈伤组织(见图2)；上述愈伤组织增殖培养基包括以下组分：MS+NAA ‑1 ‑1 ‑1
2.5mg·L +6‑BA 1.5mg·L (当愈伤组织增值培养基为MS+NAA 1.5mg·L +6‑BA 2.5mg·‑1
L ，可以实现相同的技术效果)。

[0068] (3)将增殖的愈伤组织接种芽分化诱导培养基，进行芽分化诱导，培养条件为：光2
周期为14h光照/10h黑暗，光照强度为45μE/m/s，光照条件下温度为26℃，黑暗条件下温度‑1
为18℃，得到分化芽；上述芽分化诱导培养基包括以下组分：MS+NAA 0.5mg·L +6‑BA ‑1
1.0mg·L 。

[0069] (4)将分化芽接种生根培养基，进行生根诱导，得到再生苗(见图3)；上述生根培养‑1 ‑1基包括以下组分：1/2MS+NAA0.05 mg·L +IBA 1.5mg·L 。

[0070] (5)将再生苗移栽至日光温室中培养，培养条件为：日光温室的温度为28℃，黑夜的温度为20℃，相对空气湿度为78％，得到蒜头果移栽苗(见图4)。

[0071] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。