油榄仁组织培养方法及其培养基

摘要

本发明涉及一种用于油榄仁组织培养的培养基，包括种子萌发培养基、增殖培养基、壮苗及整齐化培养基以及生根培养基中的一种或者多种；种子萌发培养基以MS培养基为基础培养基，且每1L种子萌发培养基包含6‑BA1mg～2mg、GA3 0.1mg～0.5mg、蔗糖25g～35g、琼脂5.6g～6.2g；种子萌发培养基的pH值为5.8～6.0；增殖培养基以改良MS培养基为基础培养基，且每1L增殖培养基包含6‑BA 1mg～2mg、IBA 0.1mg～0.2mg、蔗糖25g～35g、琼脂5.6g～6.2g。利用该培养基进行组织培养可建立一种兼具多种优势的较为完善的油榄仁的组织培养方法。

权利要求

1.一种用于油榄仁组织培养的培养基，其特征在于，由种子萌发培养基、增殖培养基、壮苗及整齐化培养基以及生根培养基组成；

每1L所述种子萌发培养基由MS培养基、6‑BA 1mg、GA3 0.1mg~0.5mg、蔗糖25g~35g、琼脂

5.6g 6.2g组成；所述种子萌发培养基的pH值为5.8 6.0；

~ ~

每1L所述增殖培养基由改良MS培养基、6‑BA 1mg、IBA 0.1mg、蔗糖25g 35g、琼脂5.6g~ ~

6.2g组成；

每1L所述壮苗及整齐化培养基由改良MS培养基、硅酸钾1.5mmol 2mmol、6‑BA 1mg、IBA ~

0.1mg、蔗糖25g 35g、琼脂5.6g 6.2g组成；

~ ~

每1L所述生根培养基由WPM培养基、NAA 0.1mg 0.2mg、蔗糖18g 25g、琼脂5.6g 6.2g组~ ~ ~成；

每1L所述改良MS培养基中NH4NO3 1320mg~2457mg、KH2PO4 170mg~340mg以及MgSO4·

7H2O 555mg。

2.一种油榄仁的组织培养方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的用于油榄仁组织培养的培养基对油榄仁进行组织培养；

所述组织培养由初代培养、增殖培养、壮苗及整齐化培养以及生根培养组成；所述初代培养、所述增殖培养、所述壮苗及整齐化培养以及所述生根培养采用的培养基分别为所述种子萌发培养基、所述增殖培养基、所述壮苗及整齐化培养基以及所述生根培养基；

所述组织培养方法包括如下步骤：

将经外植体消毒后的油榄仁种子接种至所述种子萌发培养基中进行所述初代培养使所述油榄仁种子萌发，获得无菌苗；

将所述无菌苗接种至所述增殖培养基中进行所述增殖培养，形成增殖苗；

将所述增殖苗接种至所述壮苗及整齐化培养基中进行所述壮苗及整齐化培养；

将经所述壮苗及整齐化培养后的增殖苗接种至所述生根培养基中进行所述生根培养，形成油榄仁生根苗；

对所述油榄仁种子进行外植体消毒的消毒条件为：选取饱满的油榄仁种子，浓硫酸浸泡5h 7h，种子破壳后用体积分数为75%的酒精灭菌30 50s，用质量分数为0.1%的升汞溶液~ ~浸泡6min 8min，无菌水漂洗5次 6次。

~ ~

3.根据权利要求2所述的油榄仁的组织培养方法，其特征在于，所述初代培养的培养条件为：温度22℃ 25℃，光照强度2000lx 2500lx，光照时间10h/d 14h/d，培养天数20d 50d。

~ ~ ~ ~

4.根据权利要求2所述的油榄仁的组织培养方法，其特征在于，所述增殖培养的培养条件为：温度22℃ 25℃，光照强度2000lx 2500lx，光照时间10h/d 14h/d，培养天数25d 40d。

~ ~ ~ ~

5.根据权利要求2所述的油榄仁的组织培养方法，其特征在于，所述壮苗及整齐化培养的培养条件为：温度22℃ 25℃，光照强度2000lx 2500lx，光照时间10h/d 14h/d，培养天数~ ~ ~

25d 40d。

~

6.根据权利要求2所述的油榄仁的组织培养方法，其特征在于，所述生根培养的培养条件为：温度22℃ 25℃，光照强度2000lx 2500lx，光照时间10h/d 14h/d，培养天数20d 40d。

~ ~ ~ ~

7.根据权利要求2 6任一项所述的油榄仁的组织培养方法，其特征在于，所述组织培养~方法还包括如下步骤：

将所述油榄仁生根苗闭瓶炼苗10d 15d。

~

说明书

油榄仁组织培养方法及其培养基

技术领域

[0001] 本发明属于植物组织培养技术领域，特别是涉及一种油榄仁组织培养方法及其培养基。

背景技术

[0002] 油榄仁(Terminalia bellirica Roxb.)为使君子科(Combretaceae)诃子属高大乔木，学名毗黎勒。油榄仁树干通直，其木材具有良好加工性能，并且抗虫耐腐，深受群众喜爱。同时，油榄仁是优良的观叶树种，其叶片于春夏之交和深秋季节呈红色，形成优美的季相景观，适合作为园林绿化树种推广应用。此外，油榄仁的果实可药用，据《唐本草》记载，其果可用于治疗发热、咳嗽、腹泻、痢疾和皮肤病等多种疾病。

[0003] 由于油榄仁兼具观赏和药用价值，在经济利益的驱动下，野生油榄仁资源被过度开发，使其资源逐渐变少，加上天然更新差，导致油榄仁资源较为匮乏。传统的油榄仁繁殖方法以种子繁殖为主，由于其种皮较厚且十分坚硬，这种繁殖方法不仅繁殖系数低，生产周期长，而且苗木质量参差不齐，再加上季节限制、病虫害侵袭等影响导致种苗生产规模难以满足市场需求。因此建立一套完善的油榄仁快速繁殖体系，提高油榄仁苗木质量，扩大油榄仁优质苗木的生产规模，将有助于推动油榄仁产业化发展。

[0004] 和其他植物类似，油榄仁也可以利用培养基进行组织培养从而实现快速繁殖。组织培养过程通常包括种子萌发、增殖培养、壮苗及整齐化培养、生根培养等步骤，目前并没有成熟完善的油榄仁组织培养方法，参考其他植物培养方法：

[0005] 例如国内授权专利CN107360756B记载了一种促进金丝李种子萌发且多批次发芽的方法，通过综合地控制金丝李种子萌发的各因素条件，打破种子休眠，提高种子的萌发速度、整齐度和萌发率，可快速促进种子萌发；针对其同批种子多次萌发的特性进行多批次育苗，相对缩短育苗周期，提高种子的利用率和产苗率，降低育苗成本，但是需要多次播种，操作繁琐；随着催芽次数增加，幼苗的长势也逐渐变弱，且育苗周期仍然较长。

[0006] 又例如国内授权专利CN104177183B一种提高甘薯薯苗整齐度的化学制剂，该化学制剂由烯效唑10份、富马酸二甲酯3‑6份、乙一胺四乙酸二钠10‑15份、硫酸铵5‑10份、磷酸二氢钾10‑20份、硫酸锌5‑10份、硫酸镁5‑15份、硫酸亚铁5‑10份配置而成，烯效唑、富马酸二甲酯和乙一胺四乙酸二钠配合使用，能起到促进后出、弱势薯苗快速生长的作用，从而缩小薯苗之间的品质差距，提高薯苗的合格率，但是该方法中所用化学制剂成分复杂，配制工艺繁琐，实际应用成本较高。

[0007] 又例如国内授权专利CN10124876B记载了一种牡丹组织培养方法及改良的基本培养基，该方法中的基本培养基PM是在MS培养基的基础上，改变了MS 培养基中的大量元素的组成和含量，减少了基本培养基中盐分的总摩尔数，提高了外植体的增殖率，同时降低了牡丹培养物的褐变，也避免了高盐培养基对植株生长的抑制，但是该方法将培养基中的大量元素的种类由传统的5种增加为7种，化学成分更加复杂，且该方法仅能保证提高牡丹增殖系数，无法保证提高瓶苗高度和叶绿素含量。

[0008] 可见，目前其他植物的培养方法也难以为油榄仁提供有效借鉴，亟需研发出一种可同时兼具生长周期短、外植体利用效率高、操作简单、繁殖系数高、整齐度高等多种优势的完善的油榄仁组织培养方法。

发明内容

[0009] 基于此，本发明提供了一种用于油榄仁组织培养的培养基，利用这些培养基可建立一种能够兼具生长周期短、外植体利用效率高、操作简单、繁殖系数高、整齐度高等多种优势的较为完善的油榄仁的组织培养方法。

[0010] 本发明提供一种用于油榄仁组织培养的培养基，包括种子萌发培养基、增殖培养基、壮苗及整齐化培养基以及生根培养基中的一种或者多种；

[0011] 所述种子萌发培养基以MS培养基为基础培养基，且每1L所述种子萌发培养基包含6‑BA 1mg～2mg、GA3 0.1mg～0.5mg、蔗糖25g～35g、琼脂5.6g～6.2g；所述种子萌发培养基的pH值为5.8～6.0；

[0012] 所述增殖培养基以改良MS培养基为基础培养基，且每1L所述增殖培养基包含6‑BA1mg～2mg、IBA 0.1mg～0.2mg、蔗糖25g～35g、琼脂5.6g～6.2g；

[0013] 所述壮苗及整齐化培养基以所述改良MS培养基为基础培养基，且每1L所述壮苗及整齐化培养基包含硅酸钾1.5mmol～2mmol、6‑BA 1mg～2mg、IBA 0.1mg～0.2mg、蔗糖25g～35g、琼脂5.6g～6.2g；

[0014] 所述生根培养基以WPM培养基为基础培养基，且每1L所述生根培养基包含NAA0.1mg～0.2mg、蔗糖18g～25g、琼脂5.6g～6.2g。

[0015] 在其中一个实施例中，每1L所述改良MS培养基包含NH4NO3 1320mg～2457mg、KH2PO4 170mg～340mg以及MgSO4·7H2O 450mg～600mg。

[0016] 在其中一个实施例中，所述组织培养的培养基包括所述种子萌发培养基、所述增殖培养基、所述壮苗及整齐化培养基以及所述生根培养基中的至少两种。

[0017] 本发明还提供一种油榄仁的组织培养方法，使用如上述任一实施例中所述的用于油榄仁组织培养的培养基对油榄仁进行组织培养。

[0018] 在其中一个实施例中，所述组织培养包括初代培养、增殖培养、壮苗及整齐化培养以及生根培养中的一种或者多种；所述初代培养、所述增殖培养、所述壮苗及整齐化培养以及所述生根培养采用的培养基分别为所述种子萌发培养基、所述增殖培养基、所述壮苗及整齐化培养基以及所述生根培养基。

[0019] 在其中一个实施例中，所述组织培养包括所述初代培养、所述增殖培养、所述壮苗及整齐化培养以及所述生根培养，且所述组织培养方法包括如下步骤：

[0020] 将经外植体消毒后的油榄仁种子接种至所述种子萌发培养基中进行所述初代培养使所述油榄仁种子萌发，获得无菌苗；

[0021] 将所述无菌苗接种至所述增殖培养基中进行所述增殖培养，形成增殖苗；

[0022] 将所述增殖苗接种至所述壮苗及整齐化培养基中进行所述壮苗及生根培养；

[0023] 将经所述壮苗及整齐化培养后的增殖苗接种至所述生根培养基中进行所述生根培养，形成油榄仁生根苗。

[0024] 在其中一个实施例中，对所述油榄仁种子进行外植体消毒的消毒条件为：浓硫酸浸泡5h～7h，种子破壳后用体积分数为75％的酒精灭菌30～50s，用质量分数为0.1％的升汞溶液浸泡6min～8min，无菌水漂洗5次～6次。

[0025] 在其中一个实施例中，所述初代培养的培养条件为：温度22℃～25℃，光照强度2000lx～2500lx，光照时间10h/d～14h/d，培养天数20d～50d；和/或

[0026] 所述增殖培养的培养条件为：温度22℃～25℃，光照强度2000lx～2500lx，光照时间10h/d～14h/d，培养天数25d～40d。

[0027] 在其中一个实施例中，所述壮苗及整齐化培养的培养条件为：温度22℃～25℃，光照强度2000lx～2500lx，光照时间10h/d～14h/d，培养天数25d～40d；和/或[0028] 所述生根培养的培养条件为：温度22℃～25℃，光照强度2000lx～2500lx，光照时间10h/d～14h/d，培养天数20d～40d。

[0029] 在其中一个实施例中，所述组织培养方法还包括如下步骤：

[0030] 将所述油榄仁生根苗闭瓶炼苗10d～15d。

[0031] 上述用于油榄仁组织培养的培养基，采用种子萌发培养基对油榄仁种子进行初代培养，可使种胚多次萌芽、出苗率高；采用增殖培养基进行增殖培养时在无需增加大量元素种类的情况下即可获得苗高、叶绿素含量以及增殖系数均较优的增殖苗；壮苗及整齐化培养基仅在增殖培养基的基础上增加了硅酸钾，配制方法简单，该培养基可大大提高增殖苗的整齐度；将经壮苗和整齐化培养后的高度整齐的增殖苗接种至生根培养基中可一次性生根并出苗，大大降低育苗周期。利用该组织培养的培养基可建立一种能够兼具生长周期短、外植体利用效率高、操作简单、繁殖系数高、整齐度高等多种优势的较为完善的油榄仁的组织培养方法。

附图说明

[0032] 图1为一实施方式中选取的饱满的油榄仁种子的形貌图；

[0033] 图2为一实施方式中增殖培养后油榄仁增殖苗的生长状态形貌图；

[0034] 图3为一实施方式采用添加了硅酸钾的壮苗及整齐化培养基进行培养后的油榄仁增殖苗生长状态形貌图；

[0035] 图4为一实施方式中进行生根培养11天后的生根情况图；

[0036] 图5为一实施方式中进行生根培养30天后的生长情况图；

[0037] 图6为一实施方式中进行生根培养30天后的生根情况图；

[0038] 图7为一实施方式中将油榄仁进行移栽后的生长状态图。

具体实施方式

[0039] 为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

[0040] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例，而不是限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

[0041] 本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

[0042] 本发明提供一种用于油榄仁的组织培养的培养基，利用该组织培养的培养基可建立一种能够兼具生长周期短、外植体利用效率高、操作简单、繁殖系数高、整齐度高等多种优势的较为完善的油榄仁的组织培养方法。

[0043] 进一步地，用于油榄仁组织培养的培养基包括种子萌发培养基、增殖培养基、壮苗及整齐化培养基以及生根培养基中的一种或者多种。

[0044] 其中，种子萌发培养基以MS培养基为基础培养基，且每1L种子萌发培养基包含6‑BA 1mg～2mg、GA3 0.1mg～0.5mg、蔗糖25g～35g、琼脂5.6g～6.2g。近一步地，种子萌发培养基的pH值为5.8～6.0。

[0045] 增殖培养基以改良MS培养基为基础培养基，且每1L增殖培养基包含6‑BA 1mg～2mg、IBA 0.1mg～0.2mg、蔗糖25g～35g、琼脂5.6g～6.2g。

[0046] 进一步地，每1L改良MS培养基包含NH4NO3 1320mg～2457mg、KH2PO4 170mg～340mg以及MgSO4·7H2O 450mg～600mg。

[0047] 壮苗及整齐化培养基以改良MS培养基为基础培养基，且每1L壮苗及整齐化培养基包含硅酸钾1.5mmol～2mmol、6‑BA 1mg～2mg、IBA 0.1mg～0.2mg、蔗糖25g～35g、琼脂5.6g～6.2g。可以理解地，这里的改良MS培养基与增殖培养基中包含的改良MS培养基相同。

[0048] 生根培养基以WPM培养基为基础培养基，且每1L生根培养基包含NAA 0.1mg～0.2mg、蔗糖18g～25g、琼脂5.6g～6.2g。

[0049] 在一个具体的示例中，组织培养的培养基包括种子萌发培养基、增殖培养基、壮苗及整齐化培养基以及生根培养基中的至少两种。

[0050] 可以理解地，油榄仁的组织培养通常包括初代培养、增殖培养、壮苗及整齐化培养以及生根培养中的一种或者多种。在本发明一实施方式中，可以使用上述任一示例中的用于油榄仁组织培养的培养基对油榄仁进行组织培养，初代培养、增殖培养、壮苗及整齐化培养以及生根培养采用的培养基分别为种子萌发培养基、增殖培养基、壮苗及整齐化培养基以及生根培养基。

[0051] 进一步地，当组织培养同时包括初代培养、增殖培养、壮苗及整齐化培养以及生根培养这几个环节时，本发明一实施方式还提供了一种使用如上述任一示例中的培养基对油榄仁进行组织培养的方法，包括如下步骤S110～步骤S150。

[0052] 步骤S110：外植体消毒：选取饱满的油榄仁种子作为外植体进行消毒。

[0053] 进一步地，消毒条件为：浓硫酸浸泡5h～7h，种子破壳后用体积分数为75％的酒精灭菌30～50s，用质量分数为0.1％的升汞溶液浸泡6min～8min，无菌水漂洗5次～6次。

[0054] 图1示出了一实施方式中选取的饱满的油榄仁种子的形貌图，可以理解地，图1仅为示例，油榄仁种子的形貌不限于此。

[0055] 步骤S120：初代培养：将经外植体消毒后的油榄仁种子接种至种子萌发培养基中进行萌发，获得无菌苗。

[0056] 进一步地，培养条件为：温度22℃～25℃，光照强度2000lx～2500lx，光照时间10h/d～14h/d，培养天数20d～50d。

[0057] 采用种子萌发培养基进行初代培养，采用常用的MS培养基作为基础培养基，并在培养基中添加一定含量的赤霉素即可使油榄仁种胚实现多次萌芽，且出苗效率从传统的一颗种子出一株苗提高到一颗种子可出多株苗，可以大大减少播种次数，降低育苗成本。

[0058] 在一个具体的示例中，经步骤S120初代培养后形成的无菌苗，每颗种子出苗量可达3株～8株，平均苗高为2cm～3cm，存活率不低于75％，从基部剪断使切口下部至少保留一个节以便继续萌芽，萌芽次数可达2次～4次。

[0059] 步骤S130：增殖培养：将无菌苗接种至增殖培养基中进行增殖培养，形成增殖苗。

[0060] 进一步地，培养条件为：温度22℃～25℃，光照强度2000lx～2500lx，光照时间10h/d～14h/d，培养天数25d～40d。

[0061] 采用增殖培养基对无菌苗进行增殖培养，增殖培养基中的基础培养基为改良MS培养基，改良MS培养基无需增加大量元素的种类，仅对改良MS培养基中的NH4NO3、KH2PO4以及MgSO4·7H2O等大量元素的浓度进行适当调整，经培养后即可获得苗高、叶绿素含量以及增殖系数均表现较为优良的增殖苗。

[0062] 图2示出了一实施方式中使用增殖培养基进行增殖培养后油榄仁增殖苗的生长状态形貌图，可见，经步骤S130增殖培养后形成的增殖苗，油榄仁植株健壮，叶色浓绿。可以理解地，图2仅为一示例，增殖培养后油榄仁增殖苗的生长状态形貌不限于此。

[0063] 在一个具体的示例中，增殖培养后形成的增殖苗的增殖系数为5～6，平均苗高为‑1 ‑13cm～4cm，叶绿素含量为2mg·g FW～2.5mg·g FW。

[0064] 步骤S140：壮苗及整齐化培养：将增殖苗接种至壮苗及整齐化培养基中进行培养。

[0065] 进一步地，培养条件为：温度22℃～25℃，光照强度2000lx～2500lx，光照时间10h/d～14h/d，培养天数25d～40d。

[0066] 在本实施方式中，壮苗及整齐化培养基是在增殖培养基的基础上添加了 1.5mM～2mM的硅酸钾配制而成，配制方法简单且成本低，该壮苗及整齐化培养基可以改善增殖苗的质量，促进苗高生长的同时还可以提升增殖苗的整齐度。

[0067] 图3示出了一实施方式在壮苗及整齐化培养基的配方中添加了特定浓度的硅酸钾后增殖苗的生长状态形貌图，可见，采用添加了硅酸钾的壮苗及整齐化培养基培养的增殖苗茎段更为粗壮，且整齐度高。可以理解地，图3仅为示例，壮苗及整齐化培养后油榄仁增殖苗的生长状态形貌不限于此。

[0068] 在一个具体的示例中，经步骤S140壮苗及整齐化培养后的增殖苗，平均苗高可达到4.8cm～5.2cm，且油榄仁植株健壮，叶色浓绿，节间明显。

[0069] 步骤S150：生根培养：将经壮苗及整齐化培养后的增殖苗接种至生根培养基中进行培养，形成油榄仁生根苗。

[0070] 进一步地，培养条件为：温度22℃～25℃，光照强度2000lx～2500lx，光照时间10h/d～14h/d，培养天数20d～40d。

[0071] 经过壮苗和整齐度培养的增殖苗茎段粗壮、整齐度高，可一次性经步骤S150 进行生根获得油榄仁生根苗，有利于大幅减少育苗成本和育苗周期。

[0072] 在一个具体的示例中，油榄仁的生根率不低于82％，平均生根数为4根～6 根，平均根长为4.5cm～5.5cm。

[0073] 图4示出了一实施方式中进行生根培养11天后的生根情况图，图5和图6 分别示出了一实施方式中进行生根培养30天后的生长和生根情况图，可见，生根较快，根须多且粗壮。可以理解地，图4至图6仅为示例，生根培养后油榄仁的生根状态形貌不限于此。

[0074] 在一个具体的实例中，油榄仁的组织培养方法还包括如下步骤S160。

[0075] 步骤S160：将油榄仁生根苗闭瓶炼苗10d～15d。

[0076] 可以理解地，炼苗后可进行移栽。

[0077] 进一步地，移栽的步骤包括：将炼苗后的油榄仁进行移栽，覆膜保湿，移栽1周～2周后逐渐打开覆膜材料通风降湿，待叶片不再萎蔫时完全除去覆膜材料。

[0078] 在一个具体的示例中，移栽成活率不低于96％。

[0079] 图7示出了一实施方式中移栽后的生长状态图，可见，幼苗生长状态良好。可以理解地，图7仅为一示例，移栽后油榄仁的生长状态形貌不限于此。

[0080] 可以理解地，本实施方式提供的油榄仁的组织培养方法可直接用于油榄仁苗木规模化生产。

[0081] 以下为具体实施例。

[0082] 第一部分关于外植体消毒方法研究

[0083] 实施例1

[0084] 外植体消毒：选取饱满的油榄仁种子，浓硫酸浸泡7h，种子破壳后用体积分数为75％的酒精灭菌30s，用质量分数为0.1％的升汞溶液浸泡8min，无菌水漂洗6次。

[0085] 实施例2

[0086] 实施例2与实施例1的步骤基本相同，区别在于：实施例2使用质量分数为0.1％的升汞溶液浸泡的时间为7min。

[0087] 实施例3

[0088] 实施例3与实施例1的步骤基本相同，区别在于：实施例3使用质量分数 0.1％的升汞溶液浸泡的时间为6min。

[0089] 对比例1

[0090] 对比例1与实施例1的步骤基本相同，区别在于：对比例1将实施例1中质量分数为0.1％的升汞溶液替换为质量分数为5％的NaClO溶液。

[0091] 对比例2

[0092] 对比例2与实施例1的步骤基本相同，区别在于：对比例2使用浓硫酸浸泡的时间为8h。

[0093] 分别按照实施例1～实施例3、以及对比例1～对比例2对油榄仁种子进行消毒，将消毒后的种子接种至种子萌发培养基中进行培养，种子萌发培养基以MS 培养基为基础培养基，且每升种子萌发培养基包含6‑BA 1mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g、琼脂5.8g，种子萌发培养基的pH值为5.8。培养条件：温度24℃，光照强度2000lx，光照时间14h/d，培养20d。经培养后的油榄仁种子的存活情况如下表1。

[0094] 表1不同消毒方法对油榄仁种子存活情况的影响

[0095]

[0096]

[0097] 从表1可以看出，相比于对比例1～对比例2，采用实施例1～实施例3的消毒方法对作为外植体的油榄仁种子进行消毒后，其种子的存活情况更加良好。

[0098] 第二部分关于初代培养种子萌芽次数与激素种类及浓度关系的研究

[0099] 实施例4

[0100] (1)外植体消毒：选取饱满的油榄仁种子，浓硫酸浸泡7h，种子破壳后用体积分数为75％的酒精灭菌30s，用质量分数为0.1％的升汞溶液浸泡8min，无菌水漂洗6次。

[0101] (2)初代培养：将步骤(1)消毒后的种子接种至种子萌发培养基进行萌发，获得无菌苗。种子萌发培养基以MS培养基为基础培养基，且每升种子萌发培养基包含6‑BA 1mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g、琼脂5.8g，种子萌发培养基的 pH值为5.8。培养条件：温度24℃，光照强度2000lx，光照时间14h/d，培养 50d。

[0102] 实施例5

[0103] 实施例5与实施例4的步骤基本相同，区别在于：种子萌发培养基中GA3浓度与实施例1的不同，实施例5中每升种子萌发培养基包含GA3 0.3mg。

[0104] 实施例6

[0105] 实施例6与实施例4的步骤基本相同，区别在于：种子萌发培养基中GA3浓度与实施例1的不同，实施例6中每升种子萌发培养基包含GA3 0.1mg。

[0106] 对比例3

[0107] 对比例3与实施例4的步骤基本相同，区别在于：种子萌发培养基中不含激素6‑BA和GA3。

[0108] 对比例4

[0109] 对比例4与实施例1的步骤基本相同，区别在于：种子萌发培养基中不含激素GA3。

[0110] 分别按照实施例4～实施例6、对比例3～对比例4的方法对油榄仁种子进行平行培养，培养50d天后种子萌芽情况如下表2所示。

[0111] 表2不同培养基对油榄仁种子萌发的影响

[0112]

[0113] 由表2可见，采用实施例4～实施例6的种子萌发培养基对油榄仁种子进行初代培养，培养50d后每颗种子萌发次数均在2次以上，平均每颗种子的萌芽数可达3株以上，萌发效果明显优于采用对比例3～对比例4的方法培养萌发效果。尤其是实施例4和实施例5，每颗种子的萌芽次数达到4次，平均萌芽数达到7株及以上。对比例3～对比例4由于萌芽次数少且第1次萌芽时种子母体营养丰富，平均苗高可达到2.8cm～2.9cm；而实施例1～实施例3经历多次萌芽后的平均苗高与对比例3～对比例4仅萌芽1次的高度颇为接近。

[0114] 第三部分关于增殖培养基中大量元素配比、激素浓度对油榄仁增殖与生长的影响研究

[0115] 实施例7：

[0116] (1)外植体消毒：选取饱满的油榄仁种子，浓硫酸浸泡7h，种子破壳后用体积分数为75％的酒精灭菌30s，用质量分数为0.1％的升汞溶液浸泡8min，无菌水漂洗6次。

[0117] (2)初代培养：将步骤(1)消毒后的种子接种至种子萌发培养基进行萌发，获得无菌苗。种子萌发培养基以MS培养基为基础培养基，且每升种子萌发培养基包含6‑BA 1mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g、琼脂5.8g，种子萌发培养基 pH值为5.8。培养条件：温度24℃，光照强度2000lx，光照时间14h/d，培养 50d。

[0118] (3)增殖培养：将步骤(2)经初代培养长出的无菌苗接种至增殖培养基中进行增殖形成增殖苗。增殖培养基以改良MS培养基为基础培养基，且每升增殖培养基包含6‑BA 1mg、IBA 0.1mg、蔗糖30g、琼脂5.8g，每升改良MS培养基包含NH4NO3 1320mg、KH2PO4 340mg、MgSO4·7H2O 555mg。培养条件：温度24℃，光照强度2000lx，光照时间14h/d，培养30d。

[0119] 实施例8

[0120] 实施例8与实施例7的步骤基本相同，区别在于：改良MS培养基中NH4NO3和KH2PO4的含量与实施例7的不同，实施例8中每升改良MS培养基包含 NH4NO3 1650mg、KH2PO4 255mg。

[0121] 实施例9

[0122] 实施例9与实施例7的步骤基本相同，区别在于：改良MS培养基中NH4NO3和KH2PO4的含量与实施例7的不同，实施例9中每升改良MS培养基包含 NH4NO3 2475mg、KH2PO4 170mg。

[0123] 对比例5

[0124] 对比例5与实施例7的步骤基本相同，区别在于：改良MS培养基中NH4NO3、 KH2PO4以及MgSO4·7H2O的含量与实施例7的不同，对比例5每升改良MS培养基包含NH4NO3 1650mg、KH2PO4 170mg、MgSO4·7H2O 370mg。

[0125] 对比例6

[0126] 对比例6与实施例7的步骤基本相同，区别在于：改良MS培养基中NH4NO3、KH2PO4以及MgSO4·7H2O的含量与实施例7的不同，对比例6每升改良MS培养基包含NH4NO3 2475mg、KH2PO4 255mg、MgSO4·7H2O 296mg。

[0127] 对比例7

[0128] 对比例7与实施例7的方法步骤基本相同，区别在于：增殖培养基中6‑BA 浓度以及改良MS培养基中NH4NO3、KH2PO4以及MgSO4·7H2O的含量与实施例7的不同，对比例7中每升增殖培养基包含6‑BA 2mg，每升改良MS培养基包含NH4NO3 1650mg、KH2PO4 170mg、MgSO4·7H2O 370mg。

[0129] 对比例8

[0130] 对比例8与实施例7的步骤基本相同，区别在于：增殖培养基中6‑BA、IBA 浓度以及改良MS培养基中NH4NO3、KH2PO4以及MgSO4·7H2O的含量与实施例7的不同，对比例8中每升增殖培养基包含6‑BA 2mg、IBA 0.2mg，每升改良MS培养基包含NH4NO3 1650mg、KH2PO4 170mg、MgSO4·7H2O 370mg。

[0131] 对比例9

[0132] 对比例9与实施例7的步骤基本相同，区别在于：增殖培养基中IBA浓度以及改良MS培养基中NH4NO3、KH2PO4以及MgSO4·7H2O的含量与实施例7 的不同，对比例9中每升增殖培养基包含IBA 0.2mg，每升改良MS培养基包含 NH4NO3 1650mg、KH2PO4 170mg、MgSO4·7H2O 370mg。

[0133] 分别按照实施例7～实施例9、对比例5～对比例9的方法对油榄仁种子进行平行培养，培养30d天后增殖与生长结果如下表3所示。

[0134] 表3大量元素配比及激素对油榄仁增殖与生长的影响

[0135]

[0136]

[0137] 从表3可以看出，采用实施例7～实施例9的方法对无菌苗进行增殖培养，培养30d‑1后苗高达3.15cm以上，叶绿素含量达2mg·g FW以上，植株长势均明显优于对比例5～对比例9。

[0138] 第四部分关于硅酸钾含量对壮苗及整齐化培养的影响研究

[0139] 实施例10

[0140] (1)外植体消毒：选取饱满的油榄仁种子，浓硫酸浸泡7h，种子破壳后用体积分数为75％的酒精灭菌30s，用质量分数为0.1％的升汞溶液浸泡8min，无菌水漂洗6次。

[0141] (2)初代培养：将步骤(1)消毒后的种子接种至种子萌发培养基进行萌发，获得无菌苗。种子萌发培养基以MS培养基为基础培养基，且每升种子萌发培养基包含6‑BA 1mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g、琼脂5.8g，种子萌发培养基 pH值为5.8。培养条件：温度24℃，光照强度2000lx，光照时间14h/d，培养 50d。

[0142] (3)增殖培养：将步骤(2)经初代培养长出的无菌苗接种至增殖培养基中进行增殖，形成增殖苗。增殖培养基以改良MS培养基为基础培养基，且每升增殖培养基包含6‑BA 1mg、IBA 0.1mg、蔗糖30g、琼脂5.8g，每升改良MS 培养基包含NH4NO3 1320mg、KH2PO4 
340mg、MgSO4·7H2O 555mg。培养条件：温度24℃，光照强度2000lx，光照时间14h/d，培养
30d。

[0143] (4)壮苗及整齐化培养：将步骤(3)增殖培养后形成的增殖苗接种至壮苗及整齐化培养基中进行培养。壮苗及整齐化培养基以改良MS培养基为基础培养基，且每升壮苗及整齐化培养基包含硅酸钾1.5mmol、6‑BA 1mg、IBA 0.1mg、蔗糖30g、琼脂5.8g，每升改良MS培养基包含NH4NO3 1320mg、KH2PO4 340mg、 MgSO4·7H2O 555mg。培养条件：温度24℃，光照强度2000lx，光照时间14h/d，培养30d。

[0144] 实施例11

[0145] 实施例11与实施例10的步骤基本相同，区别在于：壮苗及整齐化培养基中的硅酸钾的浓度与实施例10不同，实施例11中每升壮苗及整齐化培养基包含硅酸钾2mmol。

[0146] 对比例10

[0147] 对比例10与实施例10的步骤基本相同，区别在于：壮苗及整齐化培养基中的硅酸钾的浓度与实施例10不同，对比例10中每升壮苗及整齐化培养基包含硅酸钾0.5mmol。

[0148] 对比例11

[0149] 对比例11与实施例10的步骤基本相同，区别在于：壮苗及整齐化培养基中的硅酸钾的浓度与实施例10不同，对比例11中每升壮苗及整齐化培养基包含硅酸钾1mmol。

[0150] 对比例12

[0151] 对比例12与实施例10的步骤基本相同，区别在于：壮苗及整齐化培养基中的不含硅酸钾。

[0152] 分别按照实施例10～实施例11以及对比例10～对比例12的方法对增殖苗进行壮苗及整齐化培养，培养30d后培养基中的硅酸钾对油榄仁苗高和整齐度的影响如下表4所示。

[0153] 表4硅酸钾含量对油榄仁苗高和整齐度的影响

[0154]

[0155] 从表4可以看出，采用实施例10～实施例11的方法对增殖苗进行壮苗及整齐度培养，培养30d后苗高达4.86cm以上，节间明显，整齐度高，植株质量均明显优于对比例10～对比例12。

[0156] 第五部分关于生根培养影响因素研究

[0157] 实施例12

[0158] (1)外植体消毒：选取饱满的油榄仁种子，浓硫酸浸泡7h，种子破壳后用体积分数为75％的酒精灭菌30s，用质量分数为0.1％的升汞溶液浸泡8min，无菌水漂洗6次。

[0159] (2)初代培养：将步骤(1)消毒后的种子接种至种子萌发培养基进行萌发，获得无菌苗。种子萌发培养基以MS培养基为基础培养基，且每升种子萌发培养基包含6‑BA 1mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g、琼脂5.8g，种子萌发培养基 pH值为5.8。培养条件：温度24℃，光照强度2000lx，光照时间14h/d，培养 50d。

[0160] (3)增殖培养：将步骤(2)经初代培养长出的无菌苗接种至增殖培养基中进行增殖，形成增殖苗。增殖培养基以改良MS培养基为基础培养基，且每升增殖培养基包含6‑BA 1mg、IBA 0.1mg、蔗糖30g、琼脂5.8g，每升改良MS 培养基包含NH4NO3 1320mg、KH2PO4 
340mg、MgSO4·7H2O 555mg。培养条件：温度24℃，光照强度2000lx，光照时间14h/d，培养
30d。

[0161] (4)壮苗及整齐化培养：将步骤(3)增殖培养后形成的增殖苗接种至壮苗及整齐化培养基中进行培养。壮苗及整齐化培养基以改良MS培养基为基础培养基，且每升壮苗及整齐化培养基包含硅酸钾1.5mmol、6‑BA 1mg、IBA 0.1mg、蔗糖30g、琼脂5.8g，每升改良MS培养基包含NH4NO3 1320mg、KH2PO4 340mg、 MgSO4·7H2O 555mg。培养条件：温度24℃，光照强度2000lx，光照时间14h/d，培养30d。

[0162] (5)生根培养：将步骤(4)壮苗及整齐化培养后的增殖苗接种至生根培养基中进行生根培养。生根培养基以WPM培养基为基础培养基，且每升生根培养基包含NAA 0.2mg、蔗糖20g、琼脂5.8g。培养条件：温度24℃，光照强度 2000lx，光照时间14h/d，培养30d。

[0163] 实施例13

[0164] 实施例13与实施例12的步骤基本相同，区别在于：生根培养基中NAA的浓度与实施例12不同，实施例13中每升生根培养基包含NAA 0.1mg。

[0165] 对比例13

[0166] 对比例13与实施例12的步骤基本相同，区别在于：生根培养基中的基础培养基由WPM培养基替换为1/2MS培养基。

[0167] 对比例14

[0168] 对比例14与实施例12的步骤基本相同，区别在于：生根培养基中NAA的浓度与实施例12不同，对比例14每升生根培养基包含NAA 0.5mg。

[0169] 对比例15

[0170] 对比例15与实施例12的步骤基本相同，区别在于：生根培养基中的基础培养基由WPM培养基替换为1/4MS培养基。

[0171] 按照实施例12～实施例13以及对比例13～对比例15的方法对油榄仁进行生根培养，培养8d后培养基中的基础培养基及NAA浓度对油榄仁生根的影响如下表5所示。

[0172] 表5基础培养基及NAA浓度对油榄仁生根的影响

[0173]

[0174] 如表5可见，采用实施例12～实施例13的方法对油榄仁进行生根培养后，生根情况明显优于对比例13～对比例15。

[0175] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0176] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。