一种可注射生物活性水凝胶及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种可注射生物活性水凝胶及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。制备方法为：向富血小板血浆中添加含有Ca2+的溶液和/或凝血酶溶液，使富血小板血浆活化，得到活化的富血小板血浆；将粘土颗粒分散在含有焦磷酸盐或非离子表面活性剂的超纯水中，得到粘土分散液；将活化的富血小板血浆和粘土分散液充分混匀，即得到生物活性水凝胶。本发明提供的可注射生物活性水凝胶中的粘土颗粒具备独特的荷电特性，通过静电作用吸附PRP中的生长因子等生物活性物质，从而解决常规PRP凝胶中生物活性生长因子释放过快的关键问题；另外，本发明水凝胶具备剪切变稀和自愈合的特性，通过注射器注射到缺损部位，并恢复凝胶态，从而完全填充不规则缺损。

权利要求

1.一种可注射生物活性水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2+

(1)向富血小板血浆中添加含有Ca 的溶液和/或凝血酶溶液，使富血小板血浆活化，得到活化的富血小板血浆；将粘土颗粒分散在含有焦磷酸盐或非离子表面活性剂的超纯水中，得到粘土分散液；

(2)将步骤(1)得到的活化的富血小板血浆和粘土分散液充分混匀，使富血小板血浆和粘土通过静电相互作用以及氢键进行物理交联，得到富血小板血浆和粘土的复合水凝胶，即为生物活性水凝胶。

2.如权利要求1所述的可注射生物活性水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述粘土分散液的浓度为8wt％‑12wt％，所述活化的富血小板血浆和粘土分散液的体积比为

2:1～1:3。

3.如权利要求1所述的可注射生物活性水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，添

2+

加含有Ca 的溶液和/或凝血酶溶液之前，还包括向富血小板血浆中加入额外的生物活性成分。

4.如权利要求1所述的可注射生物活性水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，还包括向所述粘土分散液中加入额外的生物活性成分。

5.如权利要求3或4所述的可注射生物活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述额外的生物活性成分为干细胞、小分子药物、多肽类药物和蛋白类药物中至少一种。

6.如权利要求1所述的可注射生物活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述粘土为膨润土、蒙脱石、高岭石、锂蒙脱石和埃洛石中的至少一种。

7.如权利要求1‑6任一项方法制备得到的可注射生物活性水凝胶。

8.如权利要求7所述的可注射生物活性水凝胶用于制备组织再生药物和/或缓释药物中的应用。

说明书

一种可注射生物活性水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种可注射生物活性水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 皮肤是人体最重要的器官之一，是人体温度调节器，同时作为保护屏障抵御各种外部因素，在维持体内平衡和预防微生物入侵中起到了重要的作用。由于创伤、烧伤、代谢或遗传疾病等引起的皮肤损伤，会导致机体出现一系列问题，比如感染、水分和蛋白流失、内分泌以及免疫功能失调等，严重影响患者的生活质量，甚至危及生命。尤其是一些慢性难愈合性创面(糖尿病慢性创面)已成为降低人们生活质量以及加重社会和家庭负担的重要因素。皮肤损伤后，通常需要采取医用敷料保护伤口，防止创面感染以及机体脱水，促进创面修复。然而传统敷料如纱布、棉垫等疗效不佳，且频繁更换时可能因为和伤口粘合导致二次损伤。水凝胶作为新型的伤口敷料，可以提供湿润的环境，防止脱水，帮助伤口愈合；此外作为保护屏障，还可以防止微生物感染。

[0003] 由创伤，感染，肿瘤切除和先天性畸形等原因造成的骨缺损，可以引起严重的患者肢体畸形和功能障碍，降低生活质量。骨移植是目前治疗骨缺损的主要治疗手段，然而其失败率高达13％。主要原因在于移植物供体有限，且会产生疼痛、感染以及排异反应等问题。多种因素的限制导致了传统骨移植的艰难发展。水凝胶因为高的含水量以及其高分子三维网络结构，跟细胞外基质具有相似的结构和性能，可为细胞的增殖分化提供良好的生存环境。因此，利用水凝胶对骨组织进行修复一直以来都是研究的热点。

[0004] 富血小板血浆(Platelet rich plasma,PRP)是血液经分离浓缩产生的血小板浓2+
缩物，富血小板血浆中含有大量的纤维蛋白及凝结因子，能够被Ca / 凝血酶激活，形成一定形态的纤维状凝胶。因为其富含血小板来源的生长因子、细胞因子和细胞外基质调节物质等，具备促进多种组织修复的潜力，在多种再生领域包括创伤修复、骨关节炎治疗、颌面部修复、毛发再生以及整形美容等领域被广泛应用。

[0005] 限制PRP临床效果的一个关键因素是生物活性生长因子的不可控/快速释放。无论2+
是直接应用PRP液体制剂或是通过添加Ca /凝血酶活化形成的 PRP凝胶制剂，都不能控制其中的生物活性生长因子的释放，快速释放的生长因子会被体内的酶快速降解清除，持续时间短，不能充分发挥作用。除此之外，直接活化形成的PRP凝胶制剂不具备剪切变稀的特性，因此不能通过注射填充不规则伤口。因此，对PRP进行改进，构建基于PRP的生物活性可注射凝胶制剂，以完全填充不规则缺损，同时实现其生长因子的缓慢释放，使其发挥长期治疗效果对于减小给药频次增强治疗效果极为重要。

发明内容

[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可注射生物活性水凝胶及其制备方法和应用。该多功能可注射生物活性水凝胶由富血小板血浆和带电的粘土粒子通过静电相互作用以及氢键等物理交联形成，可注射到缺损部位并恢复凝胶形态以完全填充不规则缺损，同时实现富血小板血浆中生物活性生长因子以及额外负载生物活性成分的缓慢释放。该多功能可注射生物活性水凝胶具备剪切变稀和自愈合特点，且不需要任何引发剂和交联剂，安全性更好，可在组织再生领域和缓释药物制备中应用。

[0007] 根据本发明第一方面，提供了一种可注射生物活性水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0008] (1)向富血小板血浆中添加含有Ca2+的溶液和/或凝血酶溶液，使富血小板血浆活化，得到活化的富血小板血浆；将粘土颗粒分散在含有焦磷酸盐或非离子表面活性剂的超纯水中，得到粘土分散液；

[0009] (2)将步骤(1)得到的活化的富血小板血浆和粘土分散液充分混匀，即得到生物活性水凝胶。

[0010] 优选地，步骤(2)中，所述粘土分散液的浓度为8wt％‑12wt％，所述活化的富血小板血浆和粘土分散液的体积比为2:1～1:3。

[0011] 优选地，步骤(1)中，添加含有Ca2+的溶液和/或凝血酶溶液之前，还包括向富血小板血浆中加入额外的生物活性成分。

[0012] 优选地，步骤(1)中，还包括向所述粘土分散液中加入额外的生物活性成分。

[0013] 优选地，所述额外的生物活性成分为干细胞、小分子药物、多肽类药物和蛋白类药物中至少一种。

[0014] 优选地，所述粘土为膨润土、蒙脱石、高岭石、锂蒙脱石和埃洛石中的至少一种。

[0015] 根据本发明另一方面，提供了任一所述方法制备得到的可注射生物活性水凝胶，所述可注射生物活性水凝胶为富血小板血浆和粘土的复合水凝胶，其中富血小板血浆和粘土以非共价键交联。

[0016] 优选地，所述非共价键为氢键和静电相互作用。

[0017] 根据本发明另一方面，提供了所述的可注射生物活性水凝胶用于制备组织再生药物和/或缓释药物中的应用。

[0018] 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

[0019] (1)本发明提供的多功能可注射生物活性水凝胶由PRP和粘土复合形成。粘土颗粒具备独特的荷电特性，可以通过静电作用吸附PRP中的生长因子等生物活性物质，从而有效解决常规PRP凝胶中生物活性生长因子释放过快的关键问题。

[0020] (2)本发明提供的多功能可注射生物活性水凝胶基于PRP和粘土之间的物理相互作用构建而成，因此具备剪切变稀和自愈合的特性，可以通过注射器注射到缺损部位，并恢复凝胶态，从而完全填充不规则缺损，有效解决常规PRP凝胶不可注射的局限。

[0021] (3)本发明提供的多功能可注射生物活性水凝胶的制备不需要额外的催化剂、引发剂和交联剂等，避免了毒性物质引入，具备更好的生物相容性；制备过程简单，仅需简单的混合涡旋，不需要紫外或辐射等手段，条件易控，易于大规模生产。

[0022] (4)本发明提供的多功能可注射生物活性水凝胶最大载药率高，可以负载不同的类型的生物活性成分，包括细胞、小分子药物和多肽类药物以及大分子蛋白类药物。且制备过程中不涉及有机溶剂的引入，可以更好地维持细胞、多肽以及蛋白类药物的活性。

[0023] (5)本发明提供的多功能可注射生物活性水凝胶可以实现药物的局部递送并缓慢释放，减小药物的全身毒副作用，并提高药物的局部疗效。

[0024] (6)本发明优选的粘土为纳米硅酸锂镁Laponite，一种独特的圆盘形纳米粒，其化+ ‑ + + 2+学组成为Na0.7[(Mg5.5Li0.3)Si8O20(OH)4]0.7，在体内可降解为 Na ,Li ,Mg ,Si(OH)4,可被
2+
生物吸收并发挥生物学效应，比如Mg 可以改善炎症，刺激细胞增殖和促进愈合；Si(OH)4可促进I型胶原蛋白的合成。该纳米粘土已被广泛用于成骨诱导剂、药物输送载体、组织工程等研究领域。本发明创新性地将PRP与Laponite相结合，简单制备出一种可注射生物活性水凝胶，同时还可以协同起效，增加PRP的组织再生能力，在促进伤口愈合中展现出明显优势。

附图说明

[0025] 图1为实施例2得到的多功能可注射生物活性水凝胶的可注射性能和自愈性能展示。

[0026] 图2为实施例2得到的可注射生物活性水凝胶的黏附性能展示。

[0027] 图3‑4为实施例2得到的多功能可注射生物活性水凝胶的流变学；其中图3为凝胶的剪切变稀性能，图4为凝胶的自愈合性能。

[0028] 图5为分别按照实施例2和对比例1得到的多功能可注射生物活性水凝胶和常规PRP凝胶的总蛋白释放情况。

[0029] 图6为分别按照实施例6和对比例2得到的含药多功能可注射生物活性水凝胶和含药常规PRP凝胶的甲磺酸去铁胺的释放情况。

[0030] 图7为按照实施例2制备得到不含药物生物活性水凝胶PLG，按照实施例6制备得到含药生物活性水凝胶DPLG，按照对比例2制备得到含药常规PRP水凝胶DPG以及生理盐水在大鼠普通伤口中的促愈合情况。

[0031] 图8为按照实施例2制备得到不含药物生物活性水凝胶PLG，按照实施例6制备得到含药生物活性水凝胶DPLG，按照对比例2制备得到含药常规PRP水凝胶DPG以及生理盐水在糖尿病大鼠慢性愈合创面中的促愈合情况。

具体实施方式

[0032] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

[0033] 本发明可注射生物活性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

[0034] 步骤S1、血液中加入抗凝剂，采用两步离心法提取富血小板血浆；

[0035] 步骤S2、将粘土颗粒分散在含有焦磷酸盐或非离子表面活性剂的超纯水中，得到粘土分散液；

[0036] 步骤S3、向富血小板血浆中添加一定体积比的Ca2+溶液和/和或凝血酶溶液促进富血小板血浆活化；

[0037] 步骤S4、将粘土分散液和活化富血小板血浆以一定体积比混合并短暂涡旋，得到多功能可生物活性注射水凝胶。

[0038] 一些实施例中，活化的富血小板血浆与粘土分散液的体积比为 20:1～1:20，优选为2:1～1:3。

[0039] 一些实施例中，添加含有Ca2+的溶液和/或凝血酶溶液之前，还包括向富血小板血浆中加入生物活性成分。

[0040] 一些实施例中，还包括向所述粘土分散液中加入生物活性成分。

[0041] 一些实施例中，步骤S1中，第一次离心转速为400×g～900×g，离心时间为5min～10min，抽取上层黄色血浆层和中间血小板层，弃除下层红细胞；第二次离心转速为1200×g～1600×g，离心时间为10～15min，去除上层贫血小板血浆，得到富血小板血浆，并置于‑80℃或液氮环境下保存。

[0042] 一些实施例中，步骤S2中，粘土与焦磷酸盐的质量比为10:1，即粘土分散液的质量浓度为10％(wt％)，所述粘土分散液需要添加焦磷酸盐(如焦磷酸钠)帮助粘土分散，焦磷酸盐浓度为1％(wt％)。

[0043] 一些实施例中，步骤S3中，Ca2+溶液为2％～10％的CaCl2溶液；凝血酶溶液为1000U/mL凝血酶溶液。

[0044] 一些实施例中，步骤S3中，Ca2+溶液或/和凝血酶溶液与富血小板血浆的体积比为1:5～1:20。

[0045] 一些实施例中，步骤S4中，涡旋时间为5s～30s。

[0046] 本发明可注射生物活性水凝胶，为富血小板血浆/粘土复合水凝胶；所述水凝胶为非共价键交联，具备可注射和自愈特性；所述水凝胶优选地负载生物活性成分。

[0047] 一些实施例中，所述粘土为膨润土、蒙脱石、高岭石、锂蒙脱石和埃洛石中的至少一种，更进一步地，所述黏土为Laponite XLG系列的蒙脱土纳米黏土。

[0048] 一些实施例中，所述水凝胶中包封负载其他生物活性成分，优选为干细胞、小分子药物、多肽类药物和蛋白类药物中至少一种。

[0049] 本发明可注射生物活性水凝胶在组织再生领域、缓释药物制备中的应用。

[0050] 实施例1

[0051] 本实施例对PRP和Laponite的成胶比例进行了优化，具体过程包括：

[0052] 步骤一，取血液50mL，与3.8％(wt％)的柠檬酸钠抗凝剂按体积比 9:1混合，先用900×g重力加速度离心5分钟，取上清备用。再用1500×g 重力加速度离心15分钟，弃去部分上清，保留约7mL，与底部的白色血小板混合均匀，得到富血小板的血浆。

[0053] 步骤二，Laponite分散液的制备：称取一定质量的Laponite粉末，加入到含有1％(wt％)的焦磷酸钠的水溶液中，配置10％(wt％)的Laponite 分散液，一边加入粉末一边涡旋，直至溶液变得澄清。

[0054] 步骤三，向PRP中加入2.58％(wt％)的CaCl2溶液进行活化，得到活化的PRP溶液，其中PRP与CaCl2的体积比为10:1。

[0055] 步骤四，按照表1和表2的体积比将活化PRP和Laponite分散液加入 2mL EP管中混合，涡旋5s，通过倒置EP管观察是否立即形成凝胶。

[0056] 根据表1和表2和结果可以看出，PRP与Laponite的比例在2:1～1:3之间可以形成凝胶，因此PRP与Laponite的成胶比例优选为2:1～1:3。

[0057] 表1不同PRP和Laponite混合比例的成胶情况考察

[0058]

[0059] 表2不同PRP和Laponite混合比例的成胶情况考察

[0060]

[0061] 实施例2

[0062] 按照实施例1中步骤一、步骤二和步骤三制备得到活化PRP溶液和 Laponite分散液。然后将Laponite分散液加入活化PRP溶液中，其中PRP 溶液与Laponite分散液的体积比为1:1，然后涡旋5s，得到多功能可注射生物活性水凝胶(命名为PLG)。取下1mL注射器的针头，将该多功能可注射生物活性水凝胶PLG吸入1mL注射器，再装回注射器针头，然后将该多功能可注射生物活性水凝胶注射到PBS缓冲液中。如图1所示，PRP 与Laponite混合后，立即形成凝胶，注射到PBS缓冲液的过程中，该凝胶以条状的凝胶形态沉入瓶底，表明该多功能可注射生物活性水凝胶具备可注射性能，且在注射后可以恢复凝胶态。

[0063] 实施例3

[0064] 按照实施例2制备得到多功能可注射生物活性水凝胶PLG。取下1mL 注射器的针头，将该多功能可注射生物活性水凝胶PLG吸入1mL注射器，再装回注射器针头，然后将PLG通过针头注射到黑色卡纸上，然后将黑色竖立，结果如图2所示，PLG经注射后在黑色卡纸上恢复凝胶形态，并具备一定黏附性。

[0065] 实施例4

[0066] 按照实施例2制备多功能可注射生物活性水凝胶PLG，并用变距流变仪测试其流变学行为。如图3所示，随着剪切速率增加，该多功能可注射生物活性水凝胶的粘度逐渐下降，证实该多功能可注生物活性射水凝胶具备剪切变稀的特性。如图4所示，在阶段性应变测试中，在1％的低应变的条件下，该多功能可注射生物活性水凝胶的储能模量G’大于损耗模量G”，此时为凝胶态；在100％的高应变条件下，该多功能可注射生物活性水凝胶的储能模量G’小于损耗模量G”，此时由凝胶态变成了溶液态；而后在1％的低应变的条件下，该多功能可注射生物活性水凝胶再次恢复为储能模量G’大于损耗模量G”的凝胶状态，证实该多功能可注生物活性射水凝胶具备自愈合的特性。

[0067] 实施例5

[0068] 按照实施例2制备多功能可注射生物活性水凝胶PLG，考察其对PRP 中的蛋白成分的控缓释行为。为了与常规方法制备的PRP凝胶进行蛋白缓释行为对比，同时还需制备常规PRP凝胶(命名为PG)，其制备方法如对比例1中所示。

[0069] 将1000μL多功能可注射生物活性水凝胶PLG和500μL按照对比例1 中制备的常规PRP凝胶PG(保证PRP的含量一致)加入PBS缓冲液中，通过BCA试剂盒检测PBS缓冲液中蛋白含量的变化。如图5所示，与PG 相比，PLG有效避免了蛋白成分的早期爆发性突释，明显减缓了PRP中蛋白成分的释放。

[0070] 实施例6

[0071] 按照实施例1中的步骤一制备PRP溶液，然后称取一定量药物(甲磺酸去铁胺DFO)粉末，加入PRP溶液中溶解，再按照实施例1中的步骤三制备含甲磺酸去铁胺的活化PRP溶液，再将该含药物的活化PRP溶液与按照实施例1中步骤二制备的Laponite分散液以体积比1:1混合，并涡旋10s，得到含药(DFO)多功能可注射生物活性水凝胶(命名为DPLG)。

[0072] 实施例7

[0073] 按照实施例6制备含药多功能可注射水凝胶DPLG，考察其对DFO的控缓释行为。为了与常规方法制备的PRP凝胶进行对药物的控缓释行为对比，同时还需制备含药常规PRP凝胶(命名为DPG)，其制备方法如对比例2中所示。

[0074] 将含药多功能可注射水凝胶DPLG和对比例2中制备的含药常规PRP 凝胶DPG加入PBS缓冲液中，通过高效液相色谱法检测PBS缓冲液中甲磺酸去铁胺DFO的含量变化。如图6所示，与DPG相比，DPLG明显减缓了甲磺酸去铁胺DFO的释放。

[0075] 实施例8

[0076] 普通创面修复试验

[0077] 按照实施例2制备得到不含药物生物活性水凝胶PLG，按照实施例6 制备得到含药(甲磺酸去铁胺)生物活性水凝胶DPLG，按照对比例2制备得到含药(甲磺酸去铁胺)常规PRP水凝胶DPG。选取8周龄雄性SD大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉大鼠，剃毛暴露背部皮肤，用皮肤活检打孔器(直径8mm)在每只大鼠背部造4个伤口。每只大鼠的4个伤口随机接受以下四组处理(保证PRP含量一致)：100μl生理盐水(作为阴性对照组Control)、50μL DPG、100μL PLG和100μL DPLG。伤口用 Tegaderm薄膜覆盖。创面治疗期间每2天更换一次水凝胶敷料，记录创面面积。通过ImageJ软件测量剩余的伤口面积，并通过以下公式计算伤口闭合率：伤口闭合率(％)＝[A0‑At]/A0×100。其中A0是第0天时的伤口面积，At是第t天时的伤口面积。结果如图7所示，DPLG对大鼠的普通创面具有更好的愈合效果。

[0078] 实施例9

[0079] 糖尿病慢性创面修复试验

[0080] 链脲佐菌素诱导1型糖尿病模型：选取8周龄雄性SD大鼠，禁食16h，然后以65mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素。每3天监测一次大鼠血糖水平，血糖水平连续14天维持在16.7mM以上，表明糖尿病模型建立成功。

[0081] 按照实施例2制备得到不含药物生物活性水凝胶PLG，按照实施例6 制备得到含药(甲磺酸去铁按)生物活性水凝胶DPLG，按照对比例2制备得到含药(甲磺酸去铁按)常规PRP水凝胶DPG。腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉糖尿病大鼠，剃毛暴露背部皮肤，用皮肤活检打孔器(直径8mm) 在每只大鼠背部造4个伤口。每只大鼠的4个伤口随机接受以下四组处理 (保证PRP含量一致)：100μL生理盐水(作为阴性对照组Control)、50μL DPG、100μL PLG和100μL DPLG。伤口用Tegaderm薄膜覆盖。创面治疗期间每3天更换一次水凝胶敷料，记录创面面积。通过ImageJ软件测量剩余的伤口面积，并通过以下公式计算相对伤口面积：相对伤口面积(％)＝ At/A0×100。其中A0是第0天的伤口面积，At是第t天的伤口面积。结果如图8所示，DPLG对糖尿病大鼠的慢性创面具有明显更好的愈合效果。在第 15天时，DPLG组的相对伤口面积缩小至6.8％，明显优于Control组的61.3％。因此本发明中的多功能可注射生物活性水凝胶具备很高的应用价值和推广价值，尤其是作为药物递送平台，制备缓释药物制剂，可进一步增加其治疗效果。

[0082] 对比例1

[0083] 按照实施例1中的步骤一和步骤三制备活化PRP溶液，然后将该活化的PRP溶液静置30分钟以上，可形成常规PRP凝胶(PG)。

[0084] 对比例2

[0085] 按照实施例1中的步骤一制备PRP溶液，然后称取一定量药物(甲磺酸去铁胺)粉末，加入PRP溶液中溶解，再按照实施例1中的步骤三制备含甲磺酸去铁胺的活化PRP溶液，然后将该活化的PRP溶液静置30分钟以上，可形成含药(甲磺酸去铁胺)常规PRP凝胶(DPG)。

[0086] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。