人卵巢癌耐尼拉帕利细胞株及用途转让专利
申请号 : CN202210758044.5
文献号 : CN115074311B
文献日 : 2023-05-02
发明人 : 吕卫国 , 林卉 , 沈聿青 , 许君芬
申请人 : 浙江大学医学院附属妇产科医院
摘要 :
本发明提供了一种人卵巢癌耐尼拉帕利细胞株及用途，本发明是选择人卵巢癌A2780细胞株作为亲代细胞，从2μM逐步增加PARP抑制剂尼拉帕利(Niraparib)浓度至40μM，建立的A2780‑NiraR(保藏编号为CCTCC NO:C202299)耐药细胞株。A2780‑NiraR对尼拉帕利的耐药指数为8.274，除对尼拉帕利耐药外，对紫杉醇有交叉耐药，且耐药细胞株建株完成后撤药培养3个月及液氮冻存半年后复苏细胞复测其耐药性，A2780‑NiraR细胞株的耐药性为原来的90％以上，耐药稳定性极好。可用于研究肿瘤耐药机制，分析化疗药物敏感性及筛选和评估化疗药物，开发肿瘤耐药逆转药物，研究更有效的肿瘤治疗方法等。
权利要求 :
1.一种人卵巢癌耐尼拉帕利细胞株，该细胞株名为A2780‑NiraR，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202299。
2.根据权利要求1所述的细胞株，其特征在于，A2780‑NiraR细胞株对尼拉帕利的耐药指数为8.274。
3.根据权利要求1所述的细胞株，其特征在于，A2780‑NiraR细胞株建株完成后撤药培养3个月，液氮冻存半年后复苏细胞，耐药性为原来的91.7％。
4.权利要求1‑3任一项所述的人卵巢癌耐尼拉帕利细胞株的子代细胞。
5.权利要求1‑3任一项所述人卵巢癌耐尼拉帕利细胞株的用途，其特征在于，包括：(1)体外研究肿瘤耐药机制；
(2)体外分析化疗药物敏感性；
(3)制备肿瘤细胞模型或制备肿瘤动物模型；
(4)体外筛选和评估化疗药物；
(5)体外开发肿瘤耐药逆转药物。
说明书 :
人卵巢癌耐尼拉帕利细胞株及用途
技术领域
[0001] 本发明涉及尼拉帕利诱导的人卵巢癌耐药细胞株及用途。
背景技术
[0002] 卵巢癌(ovarian caner)是女性生殖器官常见的三大恶性肿瘤之一，致死率位居妇科癌症的首位，每年全球大约有31万新发病例和20万死亡病例。在中国，卵巢癌的年新发病例为52100例，占全球新发卵巢癌病例的15％以上；年死亡病例达22500例，死亡率位于女性恶性肿瘤的第7位，且逐年增加，是严重威胁女性健康的恶性肿瘤。由于其症状隐匿，70％‑80％的卵巢癌病人确诊时已是晚期。近数十年来，尽管诊断技术及治疗手段有所提高，但晚期上皮性卵巢癌的五年生存率始终徘徊在30％‑40％。
[0003] 近年来，PARP抑制剂在临床应用上的普及使得卵巢癌的治疗方案发生了革命性变化，维持治疗出现极大的进展。目前，获得美国FDA批准用于铂类敏感型复发性卵巢癌维持治疗的PARP抑制剂包括尼拉帕利(Niraparib)、奥拉帕利(Olaparib)和卢卡帕利(Rucaparib)。乳腺癌易感基因(Breast cancer susceptibility gene，BRCA)突变或同源重组缺陷(Homologous recombination deficiency，HRD)是目前PARP抑制剂应用中常用的生物标志物。基于已经获取的临床研究证据，美国FDA批准奥拉帕利和卢卡帕利用于携带胚系或体系BRCA1/2基因突变的初始化疗获得临床完全缓解和部分缓解的卵巢癌患者的一线维持治疗；而尼拉帕利单药维持治疗则不受BRCA1/2突变或HRD阳性的限制，相比于其他两种PARP抑制剂，拥有更为广泛的适用人群。
[0004] 由于高级别浆液性卵巢癌有独特的基因组突变及拷贝数变化，50％的高级别浆液性卵巢癌表现为HRD，这使得它对协同致死方式非常敏感。然而，尽管最初对PARP抑制剂敏感，卵巢癌患者不可避免地会出现药物获得性耐药，许多患者用尽了治疗方案最终仍因卵巢癌死亡。因此，克服药物耐药性是治愈卵巢癌的关键。建立卵巢癌耐尼拉帕利细胞株能够为肿瘤耐药相关研究提供必要的研究模型，具有实用价值。
[0005] A2780细胞是卵巢腺癌细胞株，来源于未接受任何治疗的卵巢癌患者的肿瘤组织，是研究卵巢癌很常用的一种细胞株。目前主要的体外诱导耐药的方式有两种：间歇刺激法与梯度递增法。但这两种方法各有优劣，间歇刺激法是一种大剂量间断给药的方式，这种方式虽然更能反映临床实况，但最终建立的耐药株的耐药性却不高，同时还存在另一个问题，在诱导过程中因大剂量的给药方式，诱导失败率较高。梯度递增法是目前应用较为广泛的方法，能有效的建立稳定和高度耐药的模型，但却有着诱导周期长，筛选效率低的缺点。体外阶段式浓度梯度递增诱导法在诱导周期上是阶段性的，在给药强度上是大跨度的，以形成阶段性的耐药性单克隆群落为特点，从而降低了损失率，提高了筛选效率，实现了间歇刺激法与梯度递增法两种传统诱导耐药方法的整合。因此本发明采用体外阶段式浓度梯度递增诱导法来诱导耐药细胞的产生。
发明内容
[0006] 本发明的目的是建立人卵巢癌耐尼拉帕利细胞株A2780‑NiraR，为以下相关研究提供耐药肿瘤细胞模型：研究耐药肿瘤细胞形态及生物学特点、研究肿瘤多药耐药机制、分析化疗药物敏感性及筛选化疗药物、研究更有效的肿瘤治疗方法等。
[0007] 本发明采用如下技术方案：
[0008] 一种人卵巢癌耐尼拉帕利细胞株，于2022年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202299。分类名为：人卵巢癌耐尼拉帕利细胞株A2780‑NiraR，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。
[0009] 进一步地，A2780‑NiraR细胞株耐尼拉帕利的指数为8.274。
[0010] 进一步地：A2780‑NiraR细胞株建株完成后撤药培养3个月，液氮冻存半年后复苏细胞，耐药性为原来的91.7％。
[0011] 本发明还提供了一种人卵巢癌耐尼拉帕利细胞株的用途，包括如下中的一种或多种：
[0012] (1)体外研究肿瘤耐药机制；
[0013] (2)体外分析化疗药物敏感性；
[0014] (3)制备肿瘤细胞模型或制备肿瘤动物模型；其中，肿瘤细胞模型包括在本细胞株建立起来的子代细胞或在本细胞株建立起来的子代细胞通过转染带荧光标记的基因建立起来的细胞。动物肿瘤模型包括通过皮下荷瘤或尾静脉注射建模的方法，建立的人卵巢癌的动物模型。
[0015] (4)体外筛选和评估化疗药物；筛选肿瘤化疗药物的方法可以为：通过向所述人卵巢癌耐尼拉帕利细胞株培养基中添加不同化疗药物，观察药物细胞毒性，获得初步有效的候选药物。然后，将候选药物施药于所述细胞，计算筛选出来的有效药物的半数抑制浓度(IC50)，选择IC50最低的药物进一步作用于动物模型，与未施药组动物的存活期、肿瘤大小、转移情况等进行比较，筛选获得潜在的治疗人卵巢癌的药物。
[0016] (5)体外开发肿瘤耐药逆转药物。开发肿瘤耐药逆转药物的方法可以为：通过向所述人卵巢癌耐尼拉帕利细胞株培养基中添加耐药逆转药物和尼拉帕利/紫杉醇，观察药物细胞毒性，获得初步有效的候选药物。然后，将候选药物施药于所述细胞，计算筛选出来的有效药物的IC50，选择IC50最低的药物进一步作用于动物模型，与未施药组动物的存活期、肿瘤大小、转移情况等进行比较，筛选获得潜在的耐药逆转药物。
[0017] 本发明的有益效果为：A2780‑NiraR细胞能在0.05μM尼拉帕利中稳定生长、传代、复苏，对尼拉帕利的耐药指数为8.274，除对尼拉帕利耐药外，对紫杉醇有交叉耐药。且耐药细胞株建株完成后撤药培养3个月及液氮冻存半年后复苏细胞复测其耐药性，耐药细胞株的耐药性为原来的90％以上，耐药稳定性极好。本发明为研究肿瘤耐药机制、分析化疗药物敏感性及筛选和评估化疗药物、开发肿瘤耐药逆转药物、研究更有效的肿瘤治疗方法等提供了细胞模型。
附图说明
[0018] 图1为对数生长期的A2780、A2780‑NiraR细胞形态图；
[0019] 图2为A2780、A2780‑NiraR细胞生长曲线图；
[0020] 图3为尼拉帕利(A)、紫杉醇(B)对A2780、A2780‑NiraR细胞毒性实验结果图。
具体实施方式
[0021] 本发明的耐药细胞株建立步骤如下：
[0022] (1)人卵巢癌A2780细胞株购自美国Sigma‑Aldrich公司，复苏后用DMEM高糖培养基(含10wt％胎牛血清)于5vol％CO2、37℃的培养箱中常规培养；
[0023] (2)取对数生长期的A2780细胞，换新鲜培养基，加入尼拉帕利，作用浓度为2μM，在5vol％CO2、37℃的培养箱中常规培养，作用48h后，大部分亲本细胞死亡，停止给药诱导，换用不含尼拉帕利的培养基培养一周以上，直到单克隆耐药群落形成且发生融合，细胞恢复稳定生长；
[0024] (3)重复同样的给药诱导和停药培养过程1‑2次，细胞状态良好，再行下一浓度的尼拉帕利诱导，并增加药物浓度，给药浓度分别为5μM、10μM、20μM和40μM；
[0025] (4)历时8个月建立了能在0.05μM的尼拉帕利中稳定生长、传代及复苏的A2780‑NiraR细胞株。
[0026] 对建立的A2780‑NiraR细胞进行形态学观察及生物学特性鉴定：
[0027] 1.形态学观察倒置显微镜观察活细胞形态
[0028] 使用倒置相差显微镜(Leica DMI4000B，德国徕卡公司)观察处于对数生长期的细胞形态，并拍照。如图1所示，A2780亲本细胞形态以短梭形为主；A2780‑NiraR细胞以圆形为主，与原始株相比较，形态变圆、体积偏大、分化较差。
[0029] 2.CCK‑8法测定细胞生长曲线
[0030] 细胞增殖实验使用上海碧云天生物技术有限公司CCK‑8试剂盒。收集对数期细胞，4
调整细胞悬液浓度为2×10个/ml，在96孔板中每孔加入100μl细胞悬液，铺板使待测细胞密度为2000个/孔，并设置3个复孔。于37℃、5vol％CO2培养箱中培养过夜，至细胞单层贴壁。分别于24h、48h、72h、96h测定OD值。向每孔加入10μl的CCK‑8溶液。将96孔板置于细胞培养箱内继续避光孵育2h后，使用酶标仪在450nm测定吸光度。每组实验重复3次，绘制细胞的生长曲线图，如图2所示，可以看出A2780‑NiraR细胞增殖速度变慢，倍增时间增长。
调整细胞悬液浓度为2×10个/ml，在96孔板中每孔加入100μl细胞悬液，铺板使待测细胞密度为2000个/孔，并设置3个复孔。于37℃、5vol％CO2培养箱中培养过夜，至细胞单层贴壁。分别于24h、48h、72h、96h测定OD值。向每孔加入10μl的CCK‑8溶液。将96孔板置于细胞培养箱内继续避光孵育2h后，使用酶标仪在450nm测定吸光度。每组实验重复3次，绘制细胞的生长曲线图，如图2所示，可以看出A2780‑NiraR细胞增殖速度变慢，倍增时间增长。
[0031] 3、耐药指数测定
[0032] 细胞毒性实验使用上海碧云天生物技术有限公司活细胞计数试剂盒‑8(Cell 4
count kit‑8，CCK‑8)试剂盒(C0038)。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为5×10个/ml，在96孔板中每孔加入100μl细胞悬液，铺板使待测细胞密度为5000个/孔。于37℃、5vol％‑3
CO2培养箱中培养过夜，至细胞单层贴壁后，分别加入浓度为1×10 ‑100μM的药物，每一浓度设置3个复孔。于加药处理72h后测定OD值。每孔加入10μl CCK‑8溶液。在细胞培养箱内继续孵育2h后，使用酶标仪(Bio‑Rad，Model 680)在450nm测定吸光度，如图3所示。计算药物的IC50。
count kit‑8，CCK‑8)试剂盒(C0038)。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为5×10个/ml，在96孔板中每孔加入100μl细胞悬液，铺板使待测细胞密度为5000个/孔。于37℃、5vol％‑3
CO2培养箱中培养过夜，至细胞单层贴壁后，分别加入浓度为1×10 ‑100μM的药物，每一浓度设置3个复孔。于加药处理72h后测定OD值。每孔加入10μl CCK‑8溶液。在细胞培养箱内继续孵育2h后，使用酶标仪(Bio‑Rad，Model 680)在450nm测定吸光度，如图3所示。计算药物的IC50。
[0033] 耐药指数(Resistance index，RI)＝耐药细胞IC50/亲本细胞IC50
[0034] 分析表明A2780‑NiraR细胞对尼拉帕利的耐药指数(RI)为8.274，属于高度耐药，对Taxol(紫杉醇)的耐药指数(RI)为31.02。详见表1。
[0035] 表1
[0036]
[0037] 4、耐药细胞稳定性检测
[0038] A2780‑NiraR细胞建株完成后撤药培养3个月及液氮冻存半年后复苏细胞复测其耐药性。操作步骤同3耐药指数测定，结果显示A2780‑NiraR对尼拉帕利的半数抑制浓度(IC50)为24.02μM，稳定性为91.7％。
[0039] 综上，本发明的A2780‑NiraR细胞形态变圆、体积偏大；增殖速度显著变慢，倍增时间增长明显；对尼拉帕利的耐药指数为8.274。除对尼拉帕利耐药外，对紫杉醇有交叉耐药。且A2780‑NiraR细胞建株完成后撤药培养3个月及液氮冻存半年后复苏细胞复测其耐药性为原来90％以上，说明该细胞株的耐药稳定性极好。可以为研究卵巢癌的耐药机制，分析化疗药物敏感性及筛选化疗药物，研究更有效的肿瘤治疗方法等提供细胞模型。