一种超高效液相色谱测定叶酸杂质的方法

摘要

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱分离检测叶酸杂质的方法，该方法是采用Waters超高效液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相以缓冲溶液和甲醇的体积比为90：10为流动相A，以缓冲溶液和甲醇的体积比为70：30，进行梯度洗脱，该方法不仅能同时完全分离检测叶酸各药典中收载的9个已知杂质，且利用本发明的方法还能分离检测叶酸的其他杂质，特别是6‑甲酰基蝶呤及蝶呤‑6羧酸，能更简便，高效，准确的确保叶酸的质量可控，并最终确定产品的安全。

权利要求

1.超高效液相色谱测定叶酸杂质的方法，其特征在于，采用超高效液相色谱法，DAD检测器或紫外检测器，色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相以缓冲溶液和甲醇的体积比为90：10为流动相A，以缓冲溶液和甲醇的体积比为70：30为流动相B，检测波长为278‑282nm，柱温20‑30℃，流速为0.28‑0.32ml/min，进样量为0.5‑2μl，进行梯度洗脱；

所述缓冲溶液为浓度为0.018‑0.022mol/L醋酸铵水溶液，冰醋酸调节pH为4.6‑5.0，所述梯度洗脱方法为：0分钟至15分钟，流动相A为100％，流动相B为0％；15分钟至20分钟，流动相A线性减少至0％，流动相B线性增加至100％；20分钟至25分钟，流动相A维持0％，流动相B维持100％；25钟至28分钟，流动相A线性增加至100％，流动相B线性减少至0％；28分钟至35分钟，流动相A维持100％，流动相B维持0％；

所述杂质为：

2.根据权利要求1所述的超高效液相色谱测定叶酸杂质的方法，其特征在于，色谱柱填充剂的颗粒粒径为1.7μm，色谱柱柱长为150mm，内径为2.1mm。

3.根据权利要求1‑2任一项所述的超高效液相色谱测定叶酸杂质的方法，其特征在于，色谱柱为Waters ACQUITY  CSH C18色谱柱。

4.根据权利要求2所述的超高效液相色谱测定叶酸杂质的方法，其特征在于，醋酸铵水溶液，冰醋酸调节pH为4.8。

5.根据权利要求4所述的超高效液相色谱测定叶酸杂质的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1，溶剂的配制：2.86％碳酸钠为溶剂A，以体积比为90:10的0.02mol/L醋酸铵水溶液和甲醇的混合溶液为溶剂B；

步骤2，系统适用液的配制：分别取上述10种杂质对照品约5mg，精密称定，置25ml量瓶中，加溶剂A适量使溶解，用溶剂B定容至刻度，摇匀，作为杂质贮备液，上述各杂质贮备液分别量取0.5ml～1.0ml置10ml量瓶中，加叶酸供试品溶液2ml，用溶剂B稀释至刻度，摇匀，作为系统适用液；

步骤3，杂质I鉴别溶液的配制：取EP杂质I2mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂A适量使溶解，并用溶剂B定容至刻度；

步骤4，供试品溶液的配制：取叶酸供试品约50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加2.5ml溶剂A溶解，用溶剂B稀释至刻度；

步骤5，精密量取叶酸供试品溶液1ml置200ml量瓶中，加溶剂B稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

6.根据权利要求5所述的超高效液相色谱测定叶酸杂质的方法，其特征在于，流动相的流速为0.3ml/min。

7.根据权利要求6所述的超高效液相色谱测定叶酸杂质的方法，其特征在于，检测波长为280nm。

说明书

一种超高效液相色谱测定叶酸杂质的方法

技术领域

[0001] 本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱分离检测叶酸杂质的方法。

背景技术

[0002] 叶酸(Folic Acid)是一种水溶性纤维素，化学名为N‑[4‑[(2‑氨基‑4‑氧代‑1，4‑二氢‑6‑喋啶)甲氨基]苯甲酰基]‑L‑谷氨酸，其分子式为C19H19N7O6，分子量为441.40，CAS号为59‑30‑3，其结构式见下式(a)化合物。

[0003]

[0004] 叶酸在酸性溶液中易破坏，对热也不稳定，在室温中很易损失，见光极易被破坏。叶酸在蛋白质合成及细胞分裂与生长过程中具有重要作用，对正常红细胞的形成有促进作用，缺乏时可致红细胞中血红蛋白生成减少、细胞成熟受阻，导致巨幼红细胞性贫血，尤其适用于孕妇及婴儿巨幼红细胞性贫血。在叶酸制备过程中，会出现多种相关的工艺杂质或降解杂质杂质，这些杂质可能会由于去除不完全而影响叶酸的纯度和质量，目前叶酸的药典质量标准中涉及的工艺及降解杂质共9个，在实验过程中发现2个较大的降解杂质，故需将这11个杂质在叶酸及制剂中进行质量控制，因此，实现叶酸及制剂中杂质的分离和测定对叶酸及制剂的生产和贮存具有重要的意义，10个杂质的结构式如下：

[0005]

[0006]

[0007] 杂质I：EP标准中注明为未知结构。

[0008] 目前，叶酸有关物质的分析检测方法在中国药典，美国药典，欧洲药典及英国药典中均有收载，均采用高效液相色谱法。其中，中国药典采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐缓冲液(pH5.0)(取磷酸二氢钾2.0g，加水约650mL溶解，加0.5mol/L四丁基氢氧化铵的甲醇溶液15mL、1mol/L磷酸溶液7ml与甲醇270ml，放冷，用1mol/L磷酸溶液或氨试液调节pH值至5.0，用水稀释至1000ml)为流动相进行等度洗脱，流速为1.2ml/min，检测波长为280nm，进样体积为10μl，检测时间为主峰保留时间的3倍，采用自身对照法进行杂质的检测,中国药典能检测到6‑甲酰基蝶呤。美国药典检测方法与中国药典相近。欧洲药典与英国药典相同，均采用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇：磷酸盐(11.16g/L磷酸二氢钾和5.50g/L磷酸氢二钾)＝12：88为流动相进行等度洗脱，流速为0.6ml/min，检测波长为280nm，进样体积为5μl，检测时间为主峰保留时间的3.3倍，杂质A、D以外标法检测，其他杂质按自身对照法检测，欧洲药典不能检测到6‑甲酰基蝶呤。以上方法均不能同时将上述描述的11个杂质同时分离并检出。叶酸中杂质6‑甲酰蝶呤含量的测定方法(申请号：
202110435473.4)中采用HPLC法，对6‑甲酰蝶呤和蝶呤‑6羧酸同时进行检测，但未提及是否能同时检出其它杂质。

发明内容

[0009] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种超高效液相色谱测定叶酸杂质的方法，该方法除了能同时检测到欧洲药典提到的9种杂质和中国药典提到的杂质D，还能检测到降解杂质6‑甲酰基蝶呤及蝶呤‑6羧酸，大大提高工作的效率，节约时间成本。

[0010] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：

[0011] 一种超高效液相色谱测定叶酸杂质的方法，所述超高效液相色谱分析过程中采用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相以缓冲溶液和甲醇的体积比为90：10为流动相A，以缓冲溶液和甲醇的体积比为70：30为流动相B进行洗脱，所述梯度洗脱方法为：

[0012] 0分钟至15分钟，流动相A为100％，流动相B为0％；15分钟至20分钟，流动相A线性减少至0％，流动相B线性增加至100％；20分钟至25分钟，流动相A维持0％，流动相B维持100％；25钟至28分钟，流动相A线性增加至100％，流动相B线性减少至0％；28分钟至35分钟，流动相A维持100％，流动相B维持0％。

[0013] 本发明所述的方法适用于上述的11种杂质的分离和检测，可用于单独检测某一种杂质，也可同时分离和检测这11种杂质，与现有技术相比，本发明的方法更快捷，提高了效率，具有显著的进步性。

[0014] 本发明所述的超高效液相色谱法为反相液相色谱法，采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述的十八烷基硅烷键合硅胶颗粒粒径为1.7μm，色谱柱柱长为150mm，内径为2.1mm，优选Waters ACQUITY CSH C18色谱柱。采用所述的色谱柱进行分离时，色谱柱适用的柱温范围为20‑30℃，优选25℃。

[0015] 上述的方法中，所述的缓冲溶液为醋酸铵，冰醋酸调节pH为4.6‑5.0，优选4.8。

[0016] 上述的方法中，所述的铵盐为醋酸铵，磷酸二氢铵，和磷酸氢二铵中的一种或多种，优选为醋酸铵。

[0017] 上述的方法中，所述混合缓冲溶液中磷酸盐的浓度为0.018‑0.022mol/L，优选为0.02mol/L。

[0018] 上述的方法中，本发明所述的一种超高效液相色谱测定叶酸杂质的方法，当采用所述的超高效液相色谱，所述的流动相进行洗脱时，流动相的流速为0.28‑0.32ml/min，优选为0.3ml/min。

[0019] 上述方法中，进样量为0.5‑2μl，优选1μl。

[0020] 洗脱后采用DAD检测器进行检测，紫外检测器也适用，检测波长为278‑282nm，优选280nm。

[0021] 本发明的具体步骤为：分别配制系统适用液，对照溶液和叶酸供试品溶液并进样，通过自身对照法计算供试品中各杂质的含量。

[0022] 上述系统适用液为：分别取上述10种杂质对照品约5mg，精密称定，置25ml量瓶中，加溶剂A适量使溶解，用溶剂B定容至刻度，摇匀，作为杂质贮备液，上述各杂质贮备液分别量取0.5ml～1.0ml置10ml量瓶中，加叶酸供试品溶液2ml，用溶剂B稀释至刻度，摇匀，作为系统适用液。

[0023] 上述杂质I为：取EP杂质I2mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂A适量使溶解，并用溶剂B定容至刻度，摇匀，作为杂质I鉴别溶液。

[0024] 上述溶剂为：2.86％碳酸钠为溶剂A，0.02mol/L醋酸铵(冰醋酸调节pH为4.8)和甲醇的体积比为90:10为溶剂B。

[0025] 上述叶酸供试品溶液为：取叶酸供试品约50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加2.5ml溶剂A溶解，用溶剂B稀释至刻度。

[0026] 上述对照溶液为：精密量取叶酸供试品溶液1ml置200ml量瓶中，加溶剂B稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

附图说明

[0027] 图1为系统适用液色谱图

[0028] 图2为杂质I鉴别溶液色谱图

[0029] 图3为原料供试品溶液色谱图

[0030] 图4为对照溶液色谱图

[0031] 图5为溶剂色谱图

具体实施方式

[0032] 所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

[0033] 实施例1

[0034] 采用的仪器及色谱条件如下：

[0035] (1)超高效液相色谱仪：Waters UPLC H‑class

[0036] 检测器：PDA

[0037] 色谱工作站：Empower

[0038] (2)色谱柱：Waters ACQUITY CSH C18色谱柱(1.7μm，2.1mm×150mm)

[0039] (3)流动相A相：0.02mol/L醋酸铵(冰醋酸调节pH为4.8)和甲醇的体积比为90：10。流动相B相：0.02mol/L醋酸铵(冰醋酸调节pH为4.8)和甲醇的体积比为70：30。

[0040] (4)检测条件

[0041] 流动相A相和B相按照下述梯度比例进行洗脱；

[0042] 流动相流速：0.3ml/min；

[0043] 色谱柱温度：25℃

[0044] 检测波长：280nm

[0045] 进样量：1μl

[0046] 梯度表：0分钟至15分钟，流动相A为100％，流动相B为0％；15分钟至20分钟，流动相A线性减少至0％，流动相B线性增加至100％；20分钟至25分钟，流动相A维持0％，流动相B维持100％；25钟至28分钟，流动相A线性增加至100％，流动相B线性减少至0％；28分钟至35分钟，流动相A维持100％，流动相B维持0％。

[0047] 供试液的配制

[0048] 溶剂：2.86％碳酸钠为溶剂A，0.02mol/L醋酸铵(冰醋酸调节pH为4.8)和甲醇的体积比为90:10为溶剂B。

[0049] 分别取上述10种杂质对照品约5mg，精密称定，置25ml量瓶中，加溶剂A适量使溶解，用溶剂B定容至刻度，摇匀，作为杂质贮备液，上述各杂质贮备液分别量取0.5ml～1.0ml置10ml量瓶中，加叶酸供试品溶液2ml，用溶剂B稀释至刻度，摇匀，作为系统适用液。

[0050] 取EP杂质I2mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂A适量使溶解，并定容至刻度，摇匀，作为杂质I鉴别溶液。

[0051] 取叶酸供试品约50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加2.5ml溶剂A溶解，用溶剂B稀释至刻度。

[0052] 精密量取叶酸供试品溶液1ml置200ml量瓶中，加溶剂B稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

[0053] 操作步骤

[0054] 分别取溶剂，系统适用液，杂质I鉴别溶液，叶酸供试品溶液，对照溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图1‑图4。按照自身对照计算供试品中各杂质的含量，小于对照溶液主峰面积的峰忽略不计。

[0055] 计算公式如下：

[0056] 杂质含量(％)＝Ax/As×100％

[0057] 式中：Ax：供试品溶液中杂质的峰面积

[0058] As：对照溶液的峰面积

[0059] 典型图谱见图1‑图5。

[0060] 实施例2

[0061] 采用的仪器及色谱条件如下：

[0062] (1)超高效液相色谱仪：Waters UPLC H‑class

[0063] 检测器：PDA

[0064] 色谱工作站：Empower

[0065] (2)色谱柱：Waters ACQUITY CSH C18色谱柱(1.7μm，2.1mm×150mm)

[0066] (3)流动相A相：0.018mol/L醋酸铵(冰醋酸调节pH为4.6)和甲醇的体积比为90：10。流动相B相：0.018mol/L醋酸铵(冰醋酸调节pH为4.6)和甲醇的体积比为70：30。

[0067] (4)检测条件

[0068] 流动相A相和B相按照下述梯度比例进行洗脱；

[0069] 流动相流速：0.28ml/min；

[0070] 色谱柱温度：20℃

[0071] 检测波长：278nm

[0072] 进样量：0.5μl

[0073] 梯度表：0分钟至15分钟，流动相A为100％，流动相B为0％；15分钟至20分钟，流动相A线性减少至0％，流动相B线性增加至100％；20分钟至25分钟，流动相A维持0％，流动相B维持100％；25钟至28分钟，流动相A线性增加至100％，流动相B线性减少至0％；28分钟至35分钟，流动相A维持100％，流动相B维持0％。

[0074] 供试液的配制同实施例1

[0075] 操作步骤同实施例1

[0076] 计算公式同实施例1

[0077] 实施例3

[0078] 采用的仪器及色谱条件如下：

[0079] (1)超高效液相色谱仪：Waters UPLC H‑class

[0080] 检测器：PDA

[0081] 色谱工作站：Empower

[0082] (2)色谱柱：Waters ACQUITY CSH C18色谱柱(1.7μm，2.1mm×150mm)

[0083] (3)流动相A相：0.022mol/L醋酸铵(冰醋酸调节pH为5.0)和甲醇的体积比为90：10。流动相B相：0.022mol/L醋酸铵(冰醋酸调节pH为5.0)和甲醇的体积比为70：30。

[0084] (4)检测条件

[0085] 流动相A相和B相按照下述梯度比例进行洗脱；

[0086] 流动相流速：0.32ml/min；

[0087] 色谱柱温度：30℃

[0088] 检测波长：282nm

[0089] 进样量：2μl

[0090] 梯度表：0分钟至15分钟，流动相A为100％，流动相B为0％；15分钟至20分钟，流动相A线性减少至0％，流动相B线性增加至100％；20分钟至25分钟，流动相A维持0％，流动相B维持100％；25钟至28分钟，流动相A线性增加至100％，流动相B线性减少至0％；28分钟至35分钟，流动相A维持100％，流动相B维持0％。

[0091] 供试液的配制同实施例1

[0092] 操作步骤同实施例1

[0093] 实施例4

[0094] 用试验过程中用到的空白溶剂对本发明进行了研究，发现空白溶剂对本发明没有干扰。

[0095] 对叶酸和各杂质的线性，检测限，定量限，进行检测，结果表明叶酸和各杂质的线性方程相关系数≥0.999。

[0096] 表1叶酸和各杂质的检测限，定量限试验结果

[0097]

[0098] 由表1可以看出，本发明叶酸和各杂质检测灵敏度均较高。

[0099] 配制原料供试品溶液，分别于配制后24h内进样并记录图谱，统计并计算各杂质的含量，计算得到供试品中蝶呤‑6‑羧酸，杂质A，6‑甲酰基蝶呤，杂质C，杂质E，杂质G，杂质H，未知杂质和杂质D含量的相对标准偏差RSD均小于5％，并统计新生杂质个数为0。

[0100] 结果表明，供试品溶液在24h内稳定。

[0101] 分别对叶酸杂质进行进行重复性、中间精密度试验，结果显示叶酸的重复性及中间精密度均符合要求，重复性及中间精密度均良好。

[0102] 取系统适用液进样并记录色谱图，叶酸与各杂质及各杂质之间分离度均能符合要求。

[0103] 取杂质I鉴别溶液进样并记录色谱图，叶酸及各杂质均不影响杂质I的检测。

[0104] 取叶酸供试品溶液，进样并记录色谱图，按自身对照法计算供试品中11个杂质的含量，结果见表2。

[0105] 表2叶酸中各杂质的含量测定结果

[0106]    第一批 第二批 第三批
  蝶呤‑6‑羧酸 0.03％ 0.01％ 0.02％
  杂质A 0.38％ 0.19％ 0.37％
  6‑甲酰基蝶呤 0.17％ 0.09％ 0.18％
  杂质C 0.09％ 0.09％ 0.08％
  杂质E 0.13％ 0.14％ 0.11％
  杂质G 0.12％ 0.12％ 0.11％
  杂质H 0.13％ 0.11％ 0.12％
  未知杂质 0.09％ 0.05％ 0.08％
  杂质D 0.08％ 0.07％ 0.05％
  总杂质 1.22％ 0.87％ 1.01％

[0107] 由上表2结果可以看出，叶酸供试品中含有已知杂质蝶呤‑6‑羧酸，A，6‑甲酰基蝶呤，C，E，G，H，D，含有一个未知杂质。

[0108] 本发明能快速，有效，准确的监控叶酸中的杂质；本发明具有良好的专属性，各杂质峰之间，叶酸峰与相邻杂质之间均能达到分离，叶酸峰的理论塔板数大于10000；本发明叶酸及11个杂质检测限，定量限均较小；本发明的灵敏度高；本发明的重复性，中间精密度均良好；本发明中叶酸及11个杂质在较宽浓度范围内线性关系良好。