一种解决植物组织培养中茎尖分生组织扁平化的组培方法

摘要

本发明公开了一种解决植物组织培养中茎尖分生组织扁平化的组培技术，使已经发生茎尖分生组织扁化的植物材料有效恢复再生能力。技术分为四个阶段包括：抑制发生茎尖分生组织扁平化的植物材料的茎尖分生组织细胞过渡增殖、促茎尖分生组织生长分化为芽、芽体复壮、生根四个过程。主要从调整培养基渗透压、植物生长调节剂、基本培养基不同形态氮元素比例几个方面，综合调控植物材料内源激素，促其趋向需要的平衡，恢复再生能力；将解决植物组织培养中茎尖分生组织扁平化的技术应用于解决植物组织培养中，减少植物组织培养工作中因此所致的损失和对难得珍贵材料的补救，促进现代化农业技术的发展。

权利要求

1.一种解决植物组织培养中茎尖分生组织扁平化的组培方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）抑制发生茎尖分生组织扁平化材料的愈伤组织化：将愈伤组织化的分生组织团块培养体切分成小块，切去下部愈伤组织块丢弃，仅切留表面分生组织薄层接种到培养基I，接种后于培养室温度22±1℃、荧光灯光照900‑1200lux、光照12h/d条件下培养，除湿机控制室内相对湿度70%‑75%；培养基I包括如下质量浓度的组分：NH4NO3 0.64g/l、KNO3 2.41g/l、MgSO4· 7H2O 0.25 g/l、CaCl2 0.31g/l、KH2PO3 0.33g/l、盐酸硫胺素10mg/l，盐酸吡哆醇5mg/l，肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l、KI 0.83mg/l、H3BO3 6.2mg/l、MnSO4· 4H2O 22.3mg/l、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/l、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/l、CuSO4· 5H2O 

0.025mg/l、CoCl2· 6H2O 10mg/l、FeSO4· 7H2O 27.8mg/l、Na2‑EDTA 37.3mg/l、白砂糖

35g/l、IAA0.1mg/l、GA30.1mg/l、腺嘌呤30‑50pm、琼脂6g/l、AVG 50ug/l，pH 为6.0；

（2）促茎尖分生组织分为生长为芽：培养基I接种后培养30‑45d后，团块表面有突出芽点群，将细密芽点的团块细分切为小块，接种到培养基II，接种后放置在培养室培养观察，培养条件同步骤（1）；培养基II包括如下质量浓度的组分：NH4NO3 0.64g/l、KNO3 2.41g/l、MgSO4· 7H2O 0.25 g/l、CaCl2 0.31g/l、KH2PO3 0.33g/l、盐酸硫胺素10mg/l，盐酸吡哆醇

5mg/l，肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l、KI 0.83mg/l、H3BO3 6.2mg/l、MnSO4· 

4H2O 22.3mg/l、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/l、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/l、CuSO4· 5H2O 0.025mg/l、CoCl2· 6H2O 10mg/l、FeSO4· 7H2O 27.8mg/l、Na2‑EDTA 37.3mg/l、白砂糖25g/l、IBA0.1mg/l、腺嘌呤30‑50pm、GA30.3mg/l、6‑BA1.5mg/l、AVG 50ug/l、琼脂6g/l，pH 为6.0；

（3）芽复壮：培养基II接种培养30‑50d后，团块上有明显的凸出的细密芽从，继续将团块分切为1‑3个芽/块接种到培养基III，培养条件同步骤（1）；培养基III包括如下质量浓度的组分：KNO3 1.62g/l、NH4NO3 0.8 g/l、MgSO4· 7H2O 0.25‑0.51 g/l、CaCl2· 2H2O 0.3 g/l、KH2PO3 0.29g/l、盐酸硫胺素10mg/l、盐酸吡哆醇5mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l、KI 0.83mg/l、H3BO3 6.2mg/l、MnSO4· 4H2O 22.3mg/l、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/l、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/l、CuSO4· 5H2O 0.025mg/l、CoCl2· 6H2O 0.025mg/l、FeSO4· 

7H2O 27.8mg/l、Na2‑EDTA 37.3mg/l、琼脂6g/l、NAA 0.1mg/l、6‑BA1 mg/l、腺嘌呤10mg/l、GA30.15 mg/l、AVG 50ug/l、白砂糖20 g/l，pH 为6.0；

（4）诱导生根，植物再生：培养基II接种后培养30‑50d后，芽明显生长为健壮的无根苗丛，叶片展开，从基部切下接种到生根培养基Ⅳ，培养室内培养，先暗培养4‑5d后光培养，培养室温度控制26‑28℃，光照12h/d，30‑45d后，出瓶移栽；生根培养基Ⅳ包括如下质量浓度的组分：KNO31.2g/l、NH4NO30.32g/l、MgSO4· 7H2O 0.11g/l、CaCl2· 2H2O 0.15g/l、KH2PO3 0.16g/l、盐酸硫胺素10mg/l，盐酸吡哆醇5mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸

2.0mg/l、KI 0.83mg/l、H3BO3 6.2mg/l、MnSO4· 4H2O 22.3mg/l、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/l、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/l、CuSO4· 5H2O 0.025mg/l、CoCl2· 6H2O 0.025mg/l、FeSO4· 

7H2O 27.8mg/l、Na2‑EDTA 37.3mg/l、NAA 0.1mg/l、IBA 0.3mg/l、复硝酚钠0.2mg/l、白砂糖

25g/l、琼脂6g/l，pH 为6.0。

说明书

一种解决植物组织培养中茎尖分生组织扁平化的组培方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物组织培养技术领域，更具体地说是涉及一种解决植物组织培养中茎尖分生组织扁平化的植物组织培养方法。

背景技术

[0002] 自然植物茎尖分生组织扁平化是由植株基因突变如clavataⅠ(CLVI)基因突变失去功能所致；植物组织培养中则常因使用过高细胞分裂素类植物生长调节剂、或多次继代致培养植物内源细胞分裂素积累过高、使用生长素抑制剂类物质、培养基成分不合适等所致。组织培养中上述不适造成植物茎尖分生组织细胞分裂次数增多细胞体积小，分生组织变小。培养体愈伤组织化，愈伤组织四周围以连续带状分生组织，而不能构成有功能的分生组织，或扩大的SAM做二叉状分裂而形成两个或多个正常重叠的分生组织。多个分生组织之间会以生长素为信号，通过生长素极性运输相互竞争和抑制，表现为分生组织叶原基分化异常，叶序异常，大量幼叶而不能发育出芽、愈伤化分生组织高倍率增殖但发育不出有效苗，严重者造成植株变异，比如花有额外花器官等。

[0003] 植物茎尖分生组织扁平化是一个在植物组培中经常出现而又少被专门研究的问题。不同于组织培养工作中的其他比如褐化、污染等问题解决措施相对直接，茎尖分生组织扁平化问题的形成和解决都是一个多次积累的过程。其解决须通过技术措施来间接调控植物内源激素和相关的基因表达，经过几代培养逐步恢复才可再生。

[0004] 现在组织培养工作中对分生组织扁平化问题多简单归结为外源植物生长调节剂过高，解决措施也常常简单地降低培养基植物生长调节剂浓度。但是影响植物组织内验激素的因素除了外源植物生长调节剂外还有诸多因素例如光照、培养基氮型态比例、温度、培养基渗透压等。一旦发生分生组织扁平化问题，培养材料内源激素互作紊乱，绝非简单地降低外源植物生长调节剂所能解决。最终材培养材料被废弃，很多优良种，尤其是对激素敏感者因此难以扩繁获量。目前对植物分生组织的研究工作多集中在分生组织发育生物学层面上的机理、植物激素信号转导在其中的作用等。对植物分生组织扁平化问题在应用层面上的解决未见有专门的研究报道。

[0005] 因此，如何提供一种解决植物组织培养中茎尖分生组织扁平化的培养基是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种解决植物组织培养中茎尖分生组织扁平化的组培方法。从培养基入手，通过调整培养基渗透压、植物生长调节剂、基本培养基不同形态氮元素比例几个方面，先给予问题培养材料以亚适合的条件培养，适当的逆境培养处理抑制内源激素的紊乱状态(如叶序分化异常) 使其平衡，使被抑制的分生组织得以继续向芽分化。再削弱植物顶端优势所造成的分生组织间的相互竞争抑制，促分生组织群发育成有效丛生群，后再细分芽体，配合以最适条件、培养基成分以重建芽顶端优势发育为茎苗，最后可有效再生。综合调控植物材料内源激素，促其趋向需要的平衡，从而恢复已经发生茎尖分生组织扁平化的植物材料获得再生能力，减少植物组织培养工作中因此所致的损失和对难得珍贵材料的补救，促进了现代化农业技术的发展。

[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 一种解决植物组织培养中茎尖分生组织扁平化的组培技术包括如下步骤：

[0009] (1)抑制发生茎尖分生组织扁平化材料的愈伤组织化：将愈伤组织化的分生组织团块培养体切分成小块，切去下部愈伤组织块丢弃，仅切留表面分生组织薄层接种到培养基I，22±1℃、光照荧光灯900‑1200lux、光照12h/d条件下培养，除湿机控制室内相对湿度70％‑75％；

[0010] (2)促分生组织生长发育：30‑45d后，团块表面有突出芽点群，将细密芽点的团块细分切为小块，接种到培养基II，接种后放置在培养室培养观察，培养条件同步骤(1)[0011] (3)茎芽复壮：30‑50d后，团块上有明显的凸出的细密芽从，继续将团块分切为1‑3个芽/块接种到培养基III，培养条件同步骤(1)

[0012] (4)诱导生根，植物再生：30‑50d后，芽明显生长为健壮的无根苗丛，叶片展开。从基部切下接种到生根培养基Ⅳ，培养室内培养，先暗培养4‑5d 后光培养，培养室温度控制26‑28℃，光照12h/d，30‑45d后，出瓶移栽。

[0013] 进一步，步骤(1)中所述抑制发生茎尖分生组织扁平化材料细胞过渡增殖的培养基I包括如下质量浓度的组分：NH4NO30.64g/l、KNO32.41g/l、 MgSO4· 7H2O 0.25g/l、CaCl20.31g/l、KH2PO30.33g/l、盐酸硫胺素10mg/l，盐酸吡哆醇5mg/l，肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l、KI 0.83mg/l、 H3BO36.2mg/l、MnSO4· 4H2O 22.3mg/l、ZnSO4·
7H2O 8.6mg/l、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/l、CuSO4· 5H2O 0.025mg/l、CoCl2· 6H2O 10mg/l、FeSO4· 7H2O 27.8mg/l、 Na2‑EDTA 37.3mg/l、白砂糖35g/l、IAA0.1mg/l、GA30.1mg/l、腺嘌呤30‑50pm、琼脂6g/l、AVG：50ug/l；pH ：6.0

[0014] 进一步，步骤(2)中所述促茎尖分生组织分化为芽的培养基II包括如下质量浓度的组分：NH4NO30.64g/l、KNO32.41g/l、MgSO4· 7H2O 0.25g/l、CaCl2 0.31g/l、KH2PO30.33g/l、盐酸硫胺素10mg/l，盐酸吡哆醇5mg/l，肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l、KI0.83mg/l、H3BO36.2mg/l、MnSO4· 4H2O 22.3mg/l、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/l、Na2MoO4· 2H2O
0.25mg/l、CuSO4.· 5H2O 0.025mg/l、CoCl2· 6H2O 10mg/l、FeSO4· 7H2O 27.8mg/l、Na2‑EDTA 37.3mg/l、白砂糖25g/l、IBA0.1mg/l、腺嘌呤30‑50pm、GA30.3mg/l、6‑BA1.5mg/l、AVG： 50ug/l、琼脂6g/l；pH ：6.0

[0015] 进一步，步骤(3)中所述促丛生芽复壮的培养基III包括如下质量浓度的组分：KNO31.62g/l、NH4NO30.8 g/l、MgSO4· 7H2O 0.25‑0.51g/l、CaCl2· 2H2O 0.3g/l、KH2PO30.29g/l、盐酸硫胺素10mg/l、盐酸吡哆醇5mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸
2.0mg/l、KI 0.83mg/l、H3BO36.2mg/l、MnSO4· 4H2O 22.3mg/l、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/l、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/l、CuSO4· 5H2O 0.025mg/l、CoCl2· 6H2O 0.025mg/l、FeSO4·
7H2O 27.8mg/l、Na2‑EDTA 37.3mg/l、琼脂6g/l、NAA 0.1mg/l、6‑BA1 mg/l、腺嘌呤10mg/l、GA30.15 mg/l、AVG50ug/l、白砂糖20g/l；pH ：6.0

[0016] 进一步，步骤(4)中所述促诱导生根，植物再生的培养基Ⅳ包括如下质量浓度的组分：KNO31.2g/l、NH4NO30.32g/l、MgSO4· 7H2O 0.11g/l、CaCl2· 2H2O 0.15g/l、KH2PO30.16g/l、盐酸硫胺素10mg/l，盐酸吡哆醇5mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l、KI 0.83mg/l、H3BO36.2mg/l、MnSO4· 4H2O 22.3mg/l、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/l、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/l、CuSO4· 5H2O 0.025mg/l、CoCl2· 6H2O 0.025mg/l、FeSO4· 
7H2O 27.8mg/l、Na2‑EDTA 37.3mg/l、 NAA 0.1mg/l、IBA 0.3mg/l、复硝酚钠0.2mg/l、白砂糖25g/l、琼脂6g/l。pH ： 6.0。

附图说明

[0017] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

[0018] 图1附图为购买得到的母瓶材料情况图；

[0019] 图2附图为购买得到的母瓶材料情况图；

[0020] 图3附图为培养基I培养后的材料情况图；

[0021] 图4附图为培养基II培养后的材料情况图；

[0022] 图5附图为培养基III培养后的材料情况图；

[0023] 图6附图为培养基III培养后的材料情况图；

[0024] 图7附图为培养基IV培养后的材料情况图；

[0025] 图8附图为培养基IV培养后的材料情况图。

具体实施方式

[0026] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0027] 实施例1粗肋草(Aglaonema Schott)‘帝王红’茎尖分生组织扁平化材料的问题解决和组培再生

[0028] 本发明所需试剂为常规组培试验试剂，采购自市售渠道；未尝提及的试验方法为常规试验方法，在此不再一一赘述。

[0029] 2019年3月份购买粗肋草(Aglaonema Schott)‘帝王红’母瓶，见图1和图2,(对方因为组织培养过程中逐渐致材料茎分生组织扁平化问题无法解决获得再生植株而出售母瓶材料)。天南星科(Araceae Juss.)嵌合体彩叶植物彩叶粗肋草(Aglaonema Schott)‘帝王红’组织培养茎分生组织扁平化的解决。该品种观叶植物中最受欢迎和利润附加值最高的品种。

[0030] 具体步骤如下：

[0031] 步骤1、控制培养体愈伤组织化和茎尖分生组织异常叶原基分化：将愈伤组织化的分生组织团块培养体切分成小块，下部愈伤组织块丢弃，仅切留表面分生组织薄层接种到培养基Ⅰ后放置在培养室温度22±1℃；光照荧光灯 900‑1200lux，光照12h/d光周期；除湿机控制室内相对湿度70％‑75％培养；

[0032] 培养基I包括如下质量浓度的组分：KNO31.2g/l、NH4NO30.32g/l、 MgSO4· 7H2O0.11g/l、CaCl2· 2H2O 0.15g/l、KH2PO30.16g/l、盐酸硫胺素10mg/l，盐酸吡哆醇5mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l、KI 0.83mg/l、 H3BO36.2mg/l、MnSO4· 4H2O
22.3mg/l、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/l、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/l、CuSO4· 5H2O 0.025mg/l、CoCl2· 6H2O 0.025mg/l、FeSO4· 7H2O 27.8mg/l、Na2‑EDTA 37.3mg/l、NAA 0.1mg/l、IBA
0.3mg/l、复硝酚钠0.2mg/l、白砂糖25g/l、琼脂6g/l。pH ：6.0

[0033] 步骤2、促使分生组织生长发育：培养30‑45天，可见分生组织团块愈伤组织化被抑制，见图3，所携带以前发育的幼叶逐步黄萎，此时可见团块表面有突出芽点群，开始第二步转接。将细密芽点的团块细分切为小块，不用管已经黄萎的幼叶，接种到培养基Ⅱ。后放置入培养室，培养条件如上。

[0034] 培养基II包括如下质量浓度的组分：NH4NO30.64g/l、KNO32.41g/l、 MgSO4· 7H2O0.25g/l、CaCl20.31g/l、KH2PO30.33g/l、盐酸硫胺素10mg/l，盐酸吡哆醇5mg/l，肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l、KI 0.83mg/l、 H3BO36.2mg/l、MnSO4· 4H2O 22.3mg/l、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/l、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/l、CuSO4· 5H2O 0.025mg/l、CoCl2· 6H2O
10mg/l、FeSO4· 7H2O 27.8mg/l、Na2‑EDTA 37.3mg/l、白砂糖25g/l、IBA0.1mg/l、腺嘌呤
30‑50pm、GA30.3mg/l、 6‑BA1.5mg/l、AVG：50ug/l、琼脂6g/l。pH ：6.0[0035] 步骤3、茎芽复壮：培养培养30‑50天可见团快上有明显的凸出的细密芽从，见图4；
因为丛生芽分生组织通过生长素极性运输而相互间竞争抑制难以继续伸长生长。继续分切为1‑3个芽/块接种到培养基Ⅲ。接种后放置在培养室培养观察。培养条件同上。

[0036] 培养基III包括如下质量浓度的组分：KNO31.62g/l、NH4NO30.8 g/l、 MgSO4· 7H2O0.25‑0.51g/l、CaCl2· 2H2O 0.3g/l、KH2PO30.29g/l、盐酸硫胺素 10mg/l、盐酸吡哆醇
5mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l、KI 0.83mg/l、H3BO36.2mg/l、MnSO4·
4H2O 22.3mg/l、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/l、 Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/l、CuSO4· 5H2O
0.025mg/l、CoCl2· 6H2O 0.025mg/l、 FeSO4· 7H2O 27.8mg/l、Na2‑EDTA 37.3mg/l、琼脂
6g/l、NAA 0.1mg/l、6‑BA1 mg/l、腺嘌呤10mg/l、GA30.15 mg/l、AVG50ug/l、白砂糖20g/l；
pH ：6.0

[0037] 步骤4、诱导生根，植物再生：培养培养30‑50天待芽伸长。生长并有叶片展开，见图5和图6；达到一定的健壮度，从基部切下接种到诱导发根培养基Ⅳ。培养室内培养，先暗培养4‑5天后开始正常如前光周期培养，培养室温度控制26‑28℃，30‑45天根系良好可出瓶移栽；见图7和图8

[0038] 培养基IV包括如下质量浓度的组分：KNO31.2g/l、NH4NO30.32g/l、 MgSO4· 7H2O0.11g/l、CaCl2· 2H2O 0.15g/l、KH2PO30.16g/l、盐酸硫胺素10mg/l，盐酸吡哆醇5mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l、KI 0.83mg/l、 H3BO36.2mg/l、MnSO4· 4H2O
22.3mg/l、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/l、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/l、CuSO4· 5H2O 0.025mg/l、CoCl2· 6H2O 0.025mg/l、FeSO4· 7H2O 27.8mg/l、Na2‑EDTA 37.3mg/l、NAA 0.1mg/l、IBA
0.3mg/l、复硝酚钠0.2mg/l、白砂糖25g/l、琼脂6g/l。pH ：6.0。

[0039] 实施例2卡特兰(Cattleyahybrida)PLBs分化障碍材料的再生

[0040] 本发明所需试剂为常规组培试验试剂，采购自市售渠道；未尝提及的试验方法为常规试验方法，在此不再一一赘述。

[0041] 2012年2月取材市售红色花卡特兰小杯苗，取其4‑6cm长的侧芽作为组培材料。将侧芽剥掉外叶，超净工作台上用0.1％的升汞，附加3滴吐温‑20，消毒12‑15分钟。用无菌水洗3‑5次，晾干后用手术刀将露出的潜伏芽点切下来接种到培养基，培养室温度25±1℃；光照1200lux，光照12h/d光周期；相对湿度70～75％。PLBs诱导和增殖培养基相同用1/2MS大量元素培养基，具体含有以下质量浓度组分：KNO30.95g/l、NH4NO30.8g/l、MgSO4· 7H2O0.19g/l、 CaCl2· 2H2O 0.22g/l、KH2PO30.09g/l、盐酸硫胺素1mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l、KI 0.83mg/l、H3BO36.2mg/l、 MnSO4· 4H2O
22.3mg/l、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/l、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/l、 CuSO4· 5H2O 0.025mg/l、CoCl2· 6H2O 0.025mg/l、FeSO4· 7H2O 27.8mg/l、 Na2‑EDTA 37.3mg/l。附加：NAA 0.2mg/l、6‑BA 1.5mg/l、白砂糖25g/l、琼脂 6g/l，pH 5.5。45‑60天用同样的培养基周转一代，PLBs增殖系数达到3‑3.5。

[0042] 至2014年2月份发现所增殖PLBs增殖系数很高，且表现出玻璃化的趋势，而难以伸长分化为苗。调节不同的NAA和6‑BA浓度和比例都不见效果。

[0043] 2014年6月份采用本文技术培养。本实例中因为卡特兰生物学特性的关系，培养中没有使用培养基II，而是重复使用培养基I促进PLBs分化苗，后使用培养基III复壮后于培养基IV诱导生根。具体步骤如下：

[0044] 步骤1、切掉玻璃化状的部分，将PLBs切分为0.5cm直径的团块接种到培养基Ⅰ后放置在培养室温度22±1℃；光照荧光灯900‑1200lux，光照12h/d光周期；除湿机控制室内相对湿度70％‑75％培养；

[0045] 培养基I包括如下质量浓度的组分：KNO31.2g/l、NH4NO30.32g/l、 MgSO4· 7H2O0.11g/l、CaCl2· 2H2O 0.15g/l、KH2PO30.16g/l、盐酸硫胺素10mg/l，盐酸吡哆醇5mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l、KI 0.83mg/l、 H3BO36.2mg/l、MnSO4· 4H2O
22.3mg/l、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/l、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/l、CuSO4· 5H2O 0.025mg/l、CoCl2· 6H2O 0.025mg/l、FeSO4· 7H2O 27.8mg/l、Na2‑EDTA 37.3mg/l、NAA 0.1mg/l、IBA
0.3mg/l、复硝酚钠0.2mg/l、白砂糖25g/l、琼脂6g/l。接种后先暗培养3天后再光照以减轻材料褐化。

[0046] 步骤2、培养基I培养50天，可见PLBs团未再出现玻璃化趋势，且表面显干燥，增殖率明显下降。PLBs伸长的个数增多。继续切分PLBs，大小0.5cm，再次接种到培养基I培养一代。培养瓶内接种数量降低。培养室内培养，条件、方法同上。经培养50‑60天，PLBs分化率达到4株苗/团PLBs。PLBs分化苗率显著提高。

[0047] 步骤3、将分化苗丛PLBs基部切下接种到培养基Ⅲ促茎芽复壮；下部 PLBs仍然在培养基I使PLBs继续分化为苗，培养条件同上。

[0048] 培养基III包括如下质量浓度的组分：KNO31.62g/l、NH4NO30.8 g/l、 MgSO4· 7H2O0.25‑0.51g/l、CaCl2· 2H2O 0.3g/l、KH2PO30.29g/l、盐酸硫胺素 10mg/l、盐酸吡哆醇
5mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l、KI 0.83mg/l、H3BO36.2mg/l、MnSO4·
4H2O 22.3mg/l、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/l、 Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/l、CuSO4· 5H2O
0.025mg/l、CoCl2· 6H2O 0.025mg/l、 FeSO4· 7H2O 27.8mg/l、Na2‑EDTA 37.3mg/l、琼脂
6g/l、NAA 0.1mg/l、6‑BA1 mg/l、腺嘌呤10mg/l、GA30.15 mg/l、AVG50ug/l、白砂糖20g/l；

[0049] 步骤4、诱导生根，植物再生：培养基III接茎苗培养50天，苗叶片高度已经达到3‑5cm。将苗转接到培养基IV诱导生根。培养室温度控制26‑28℃， 60‑75天根系良好可出瓶移栽；

[0050] 培养基IV包括如下质量浓度的组分：KNO31.2g/l、NH4NO30.32g/l、 MgSO4· 7H2O 0.11g/l、CaCl2· 2H2O 0.15g/l、KH2PO30.16g/l、盐酸硫胺素10mg/l，盐酸吡哆醇5mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、甘氨酸2.0mg/l、KI 0.83mg/l、 H3BO36.2mg/l、MnSO4· 4H2O 
22.3mg/l、ZnSO4· 7H2O 8.6mg/l、Na2MoO4· 2H2O 0.25mg/l、CuSO4· 5H2O 0.025mg/l、CoCl2· 6H2O 0.025mg/l、FeSO4· 7H2O 27.8mg/l、Na2‑EDTA 37.3mg/l、NAA 0.1mg/l、IBA 
0.3mg/l、复硝酚钠0.2mg/l、白砂糖25g/l、琼脂6g/l。

[0051] 本技术对卡特兰PLBs分化障碍材料的再生培养明显有效，表明本技术对解决已发生茎尖分生组织扁平化植物材料恢复再生是可靠的，其自然也能在植物组织培养规模化生产中用于该问题的预防。

[0052] 本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

[0053] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。