负载型缓释性微载体及其制备方法和应用

摘要

本公开提供了一种负载型缓释性微载体及其制备方法和应用，负载型缓释性微载体包括：具有温度响应性能的缓释性微载体；以及负载于缓释性微载体上的海藻酸钠封装的溶菌酶；其中，缓释性微载体具有三维纳米网络结构，组成包括N‑异丙基丙烯酰胺、2‑羟基‑2‑甲基丙烯酮、聚乙二醇二丙烯酸酯、和/或N‑羟甲基丙烯酰胺。制备方法通过将海藻酸钠水凝胶封装的溶菌酶的填充到具有温度响应性能的缓释性微载体的有序的纳米孔洞中，由于纳米空间的限域作用，提高了酶的稳定性；使用温度作为驱动力来加速酶的转移，使得缓释性微载体和细菌的细胞壁之间接触界面处的酶浓度增加，提高抗菌效果；缓释性微载体的温度智能响应性孔结构延长了抗菌时间。

权利要求

1.一种负载型缓释性微载体，其特征在于，包括：具有温度响应性能的缓释性微载体；以及负载于所述缓释性微载体上的海藻酸钠封装的溶菌酶；

其中，所述缓释性微载体具有三维纳米网络结构，组成包括N‑异丙基丙烯酰胺、2‑羟基‑2‑甲基丙烯酮、聚乙二醇二丙烯酸酯、和/或N‑羟甲基丙烯酰胺；

所述负载型缓释性微载体的制备方法，包括：制备缓释性微载体；

将所述缓释性微载体加入到溶菌酶溶液进行震荡，使所述溶菌酶填充至所述缓释性微载体的多孔结构，在质量浓度包括0.5% 3%的海藻酸钠溶液中执行浸泡处理4 8h后，加入质~ ~量浓度包括1 2%的氯化钙溶液执行处理，制备海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载~体；

其中，所述缓释性微载体的制备方法包括：采用毛细管微流控法利用二氧化硅纳米粒子制备二氧化硅的单乳液液滴；

将所述单乳液液滴执行干燥固化、煅烧，制备二氧化硅光子晶体的微球模板；

将所述微球模板依次执行亲水处理、预处理和聚合反应，制备杂交二氧化硅光子晶体的水凝胶微球；

将所述水凝胶微球执行剥离、刻蚀处理，制备多孔凝胶的缓释性微载体；

在温度包括60℃ 80℃、时间包括24h 48h的条件下执行干燥固化处理；

~ ~

在温度为800℃ 1000℃、时间包括4 h 6 h的条件下执行煅烧处理；

~ ~

在浓硫酸和双氧水的体积比为7:3的混合溶液中浸泡8h 36h的条件下执行亲水处理；

~

在预聚溶液中浸泡时间包括4h 12h的条件下执行预处理；

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其中，所述预聚溶液包括N‑羟甲基丙烯酰胺、N‑异丙基丙烯酰胺、2‑羟基‑2‑甲基丙烯酮、聚乙二醇二丙烯酸酯和去离子水；

在紫外线的波长包括320nm 400nm、光强强度包括80W 200W的紫外光照射的条件下执~ ~行时间包括1min 5min的聚合反应；

~

在氢氟酸的质量浓度包括2% 10%、时间包括12h 24h的条件下执行刻蚀处理。

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2.根据权利要求1所述的负载型缓释性微载体，其特征在于，所述缓释性微载体的组成中的N‑羟甲基丙烯酰胺和N‑异丙基丙烯酰胺的质量比包括0∶1 1∶1。

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3.根据权利要求2所述的负载型缓释性微载体，其特征在于，所述N‑羟甲基丙烯酰胺和N‑异丙基丙烯酰胺的质量比为1:9。

4.一种如权利要求1 3中任一项所述的负载型缓释性微载体在制备抗菌性药物中的应~用。

说明书

负载型缓释性微载体及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本公开涉及抗菌材料技术领域，尤其涉及一种负载型缓释性微载体及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 近年来，由于抗生素的不规范使用加速了细菌耐药性的上升，细菌感染对公共卫生构成了巨大的威胁，迫切需要开发新型抗菌剂来替代抗生素。

[0003] 溶菌酶是一种天然绿色可以有效杀菌的抗感染物质。作为生物体免疫系统的一个重要部分，溶菌酶对细菌、病毒、癌细胞等具有十分广泛的杀伤性能，同时由于它还有不易产生耐药性的优点，得到了人们广泛的关注和研究。然而溶菌酶对大多数的革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌不敏感，并且其受温度、酸碱度的影响较大，且生物半衰期较短，不易通过生物屏障等原因同样限制了其广泛使用。

发明内容

[0004] 为至少部分地解决上述提及的技术缺陷中的至少之一，本公开的实施例提供一种负载型缓释性微载体及其制备方法和应用，通过将海藻酸钠水凝胶封装的溶菌酶的填充到具有温度响应性能的缓释性微载体中，可以保持酶二级结构，提高酶的稳定性。

[0005] 为了实现上述目的，作为本公开的一个方面的实施例，提供了一种负载型缓释性微载体，包括：具有温度响应性能的缓释性微载体；以及负载于上述缓释性微载体上的海藻酸钠封装的溶菌酶；其中，上述缓释性微载体具有三维纳米网络结构，组成包括N‑异丙基丙烯酰胺、2‑羟基‑2‑甲基丙烯酮、聚乙二醇二丙烯酸酯、和/或N‑羟甲基丙烯酰胺。

[0006] 作为本公开另一个方面的实施例，提供了一种如上述的负载型缓释性微载体的制备方法，包括：制备缓释性微载体；将上述缓释性微载体加入到溶菌酶溶液进行震荡，使上述溶菌酶填充至上述缓释性微载体的多孔结构在质量浓度包括0.5％～3％的海藻酸钠溶液中执行浸泡处理4～8h后，加入质量浓度包括1～2％的氯化钙溶液执行处理，制备海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体。

[0007] 作为本公开再一个方面的实施例，提供了一种如上述的负载型缓释性微载体在制备抗菌性药物中的应用。

[0008] 本公开上述实施例提供的负载型缓释性微载体中，缓释性微载体具有三维纳米网络结构，有序的多孔结构和相互连接的纳米通道提高了负载溶菌酶的效率，同时纳米限域空间为溶菌酶的稳定性提供了一个良好的环境；具有温度响应性能的N‑异丙基丙烯酰胺为缓释性微载体的骨架，利用温度作为驱动力来加速酶的转移，溶菌酶从缓释性微载体的纳米孔洞中的持续释放导致缓释性微载体和细菌细胞壁之间接触界面处的溶菌酶浓度显著增加，从而提高抗菌效果。

附图说明

[0009] 图1为根据本公开的一种示例性实施例的二氧化硅光子晶体的微球模板的制备方法示意图；

[0010] 图2为根据本公开的一种示例性实施例的制备方法得到的二氧化硅光子晶体的微球模板和缓释性微载体的扫描电镜表征图；

[0011] 图3为根据本公开实施例的负载型缓释性微载体的制备方法，不同海藻酸钠溶液的浓度下制备的海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体对溶菌酶自然释放的影响及释放过程中溶菌酶酶活性变化图；

[0012] 图4为根据本公开实施例的负载型缓释性微载体的制备方法，在质量浓度为2％的海藻酸钠溶液条件下制备的海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体在溶菌酶释放过程中对大肠杆菌的抗菌效果图；

[0013] 图5为根据本公开实施例的负载型缓释性微载体的制备方法，在质量浓度为2％的海藻酸钠溶液条件下制备的海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体在(35℃，37℃，39℃，45℃)下的10个温度循环释放曲线图；

[0014] 图6为根据本公开实施例的负载型缓释性微载体的制备方法，在质量浓度为2％的海藻酸钠溶液条件下，制备的海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体在37℃，2.5h对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抗菌性能图；

[0015] 图7为根据本公开实施例的负载型缓释性微载体的制备方法，在质量浓度为2％的海藻酸钠溶液条件下，制备的海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体在39℃，2.5h对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抗菌性能图；

[0016] 图8为根据本公开实施例的负载型缓释性微载体的制备方法，在质量浓度为2％的海藻酸钠溶液条件下，制备的海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体与等量游离溶菌酶溶液在37℃，2h下对大肠杆菌的抑制率图(a，b)及其抗菌作用示意图(c)；

[0017] 图9为根据本公开的一种示例性实施例的负载型缓释性微载体的制备方法得到负载型缓释性微载体在14天内不同干预措施下大鼠皮肤感染伤口的代表性图像(a，b)及促炎因子IL‑6(c)、TNF‑α(c)免疫染色图；

[0018] 图10为根据本公开的一种示例性实施例的负载型缓释性微载体的制备方法得到负载型缓释性微载体在第14天不同干预措施下大鼠伤口组织切片的H&E染色图(a，b)及马松染色(c)图；以及

[0019] 图11为根据本公开的一种示例性实施例的负载型缓释性微载体的制备方法得到负载型缓释性微载体在第14天不同干预措施下的新生血管的免疫荧光染色图。

具体实施方式

[0020] 为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开作进一步的详细说明。

[0021] 为了提高溶菌酶的生物利用度，溶菌酶被固定在各种纳米颗粒的外表面，包括氧化锌、磁性聚合物纳米颗粒、静电纺纳米纤维纳米马达和二氧化硅纳米颗粒，以增强溶菌酶‑纳米颗粒结合物和细菌细胞壁之间的相互作用。然而，这种化学结合方式以及和溶菌酶的在外暴露增加了变性的可能性。此外，这些纳米载体没有控释释放性能，并且缺乏长期的抑菌性能。

[0022] 近几年来，基于微载体的药物递送系统吸引了越来越多的关注，多孔药物微载体可以提高药物的输送效率，延长药物的释放时间，从而可以有效的提高药物的治疗效果和安全性。目前已有许多研究利用微载体建立溶菌酶药物递送系统来治疗细菌感染。这些溶菌酶‑微载体的缓释时间在4小时至10天之间。然而这些微载体往往存在溶菌酶载药量低或者缓释效果差等问题，并且溶菌酶在释放过程中的抗菌活性未确定，影响了治疗效果。另外，这种静态释放溶菌酶的方式限制了它们的长期抗菌活性和进一步的治疗效果。因此，设计新型载体以提高溶菌酶的载药量、缓释性能和长期抗菌活性仍然是一个挑战。

[0023] 根据本公开一方面总体上的发明构思，提供了一种负载型缓释性微载体，包括：具有温度响应性能的缓释性微载体；以及负载于缓释性微载体上的海藻酸钠封装的溶菌酶；其中，缓释性微载体具有三维纳米网络结构，组成包括N‑异丙基丙烯酰胺、2‑羟基‑2‑甲基丙烯酮、聚乙二醇二丙烯酸酯、和/或N‑羟甲基丙烯酰胺。

[0024] 本公开实施例提供的负载型缓释性微载体中，缓释性微载体具有三维纳米网络结构，有序的多孔结构和相互连接的纳米通道提高了负载溶菌酶的效率，同时纳米限域空间为溶菌酶的稳定性提供了一个良好的环境；具有温度响应性能的N‑异丙基丙烯酰胺为缓释性微载体的骨架，利用温度作为驱动力来加速酶的转移，溶菌酶从缓释性微载体的纳米孔洞中的持续释放导致缓释性微载体和细菌细胞壁之间接触界面处的溶菌酶浓度显著增加，从而提高抗菌效果。此外，缓释性微载体的温度智能响应性孔结构延长了抗菌时间。

[0025] 在本公开的一些实施例中，缓释性微载体的组成中的N‑羟甲基丙烯酰胺和N‑异丙基丙烯酰胺的质量比包括0∶1～1∶1，优选地，N‑羟甲基丙烯酰胺和N‑异丙基丙烯酰胺的质量比为1∶9。例如，N‑羟甲基丙烯酰胺和N‑异丙基丙烯酰胺的质量比可以为0∶1、1∶9、2∶8、5∶5。

[0026] 根据本公开的实施例，还提供了一种如上述的负载型缓释性微载体的制备方法，包括：制备缓释性微载体；将缓释性微载体加入到溶菌酶溶液进行震荡，使溶菌酶填充至缓释性微载体的多孔结构，在质量浓度包括0.5％～3％的海藻酸钠溶液中执行浸泡处理4～8h后，加入质量浓度包括1～2％的氯化钙溶液执行处理，制备海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体。例如，海藻酸钠溶液的质量浓度为0.9％、1.2％、1.8％、2.3％、2.9％；浸泡时间为4.5h、5.5h、6h、6.5h、7.5h；氯化钙溶液的质量浓度为1.1％、1.3％、1.6％、
1.85％、1.98％；

[0027] 在本公开的一些实施例中，缓释性微载体的制备方法包括：采用毛细管微流控法利用二氧化硅纳米粒子制备二氧化硅的单乳液液滴；将单乳液液滴执行干燥固化、煅烧，制备二氧化硅光子晶体的微球模板；将微球模板依次执行亲水处理、预处理和聚合反应，制备杂交二氧化硅光子晶体的水凝胶微球；将水凝胶微球执行剥离、刻蚀处理，制备多孔凝胶的缓释性微载体。具体地，例如，毛细管微流控法操作条件包括：(1)单分散性二氧化硅纳米粒子的粒径为300nm；(2)单分散性二氧化硅纳米粒子的质量浓度包括18％～22％(w/v)；(3)内相为一定质量浓度的二氧化硅粒子溶液，其流速为0.2mL/h；外相为10CST的二甲基硅油，其流速为4mL/h。采用正己烷将通过毛细管微流控法制备得到的二氧化硅光子晶体的液滴进行洗涤的操作条件为：将所得的二氧化硅光子晶体的液滴在正己烷中的浸泡时间2h，其中每0.5h更换一次正己烷。

[0028] 在本公开的一些实施例中，在温度包括60℃～80℃、时间包括24h～48h的条件下执行干燥固化处理，例如，温度为65℃、68℃、72℃、75℃、78℃，时间为26h、28h、35h、39h、46h；在温度为800℃～1000℃、时间包括4h～6h的条件下执行煅烧处理，例如，温度为820℃、880℃、900℃、930℃、980℃，时间为4.2h、4.5h、5.3h、5.5h、5.8h。

[0029] 在本公开的一些实施例中，在浓硫酸和双氧水的体积比为7：3的混合溶液中浸泡8h～36h的条件下执行亲水处理。例如，浸泡时间为10h、16h、21h、26h、31h、35h。

[0030] 在本公开的一些实施例中，在预聚溶液中浸泡时间包括4h～12h的条件下执行预处理，例如，4.5h、6.5h、8.5h、9.5h、11.5h；其中，预聚溶液包括N‑羟甲基丙烯酰胺、N‑异丙基丙烯酰胺、2‑羟基‑2‑甲基丙烯酮、聚乙二醇二丙烯酸酯和去离子水。例如，预聚溶液中V(N‑羟甲基丙烯酰胺+N‑异丙基丙烯酰胺)：V(2‑羟基‑2‑甲基丙烯酮)：V(聚乙二醇二丙烯酸酯)的比值为20％：1％：5％，其中，N‑羟甲基丙烯酰胺和N‑异丙基丙烯酰胺的质量比包括0、0.1、0.2、0.5中的任意一种。

[0031] 在本公开的一些实施例中，在紫外线的波长包括320nm～400nm、光强强度包括80W～200W的紫外光照射的条件下执行时间包括1min～5min的聚合反应。例如，紫外线的波长为330nm、350nm、362nm、365nm、386nm、398nm，光强强度为95W、100W、105W、125W、155W、195W；聚合的时间为1min、2min、3min、3.5min、4min、4.9min。

[0032] 在本公开的一些实施例中，在氢氟酸的质量浓度包括2％～10％、时间包括12h～24h的条件下执行刻蚀处理。例如，氢氟酸的质量浓度为2.5％、4.5％、6.5％、7.5％、9.8％，时间为13h、16h、18h、21h、23h。

[0033] 根据本公开的实施例，还提供了一种如上述的负载型缓释性微载体在制备抗菌性药物中的应用。

[0034] 以下通过对比例和实施例来进一步说明本公开。在下面的详细描述中，为了便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本公开实施例的全面解释。然而，明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。而且，在不冲突的情况下，以下各实施例中的细节可以任意组合为其他可行实施例。

[0035] 实施例1

[0036] 制备二氧化硅光子晶体的微球模板

[0037] (1)采用毛细管微流控法利用二氧化硅纳米粒子制备二氧化硅的单乳液液滴；

[0038] 具体实验步骤如下：采用单乳液微流控芯片装置，以10CST的二甲基硅油为外相，质量分数为20％的300nm二氧化硅纳米粒子的水溶液为内相，内相在外相的剪切力作用下生成稳定的单乳液液滴[制备过程的示意图如图1中的(a)部分所示]。通过注射泵的调节，内相和外相的最佳流速分别为0.2mL/h和4mL/h。

[0039] (2)将步骤(1)所得的二氧化硅的单乳液液滴执行干燥固化、煅烧，制备二氧化硅光子晶体的微球模板

[0040] 具体实验步骤如下：将步骤(1)所得的二氧化硅的单乳液液滴小心收集在盛有500CST二甲基硅油中，并置于70℃的烘箱中24h使水分挥发完[制备过程的示意图如图1中的(b)部分所示]；之后用正己烷清洗四次除去二甲基硅油，置于马弗炉中800℃煅烧4h，即得所需的二氧化硅光子晶体微球模板，其电镜表征的结果图示出于图2中的(a)部分、(b)部分和(c)部分。

[0041] 根据图2中的(a)部分、(b)部分和(c)部分示出的不同放大倍数下的电镜表征结果可知，制备得到的二氧化硅光子晶体微球模板的尺寸均一，球形度良好，内部以密堆积形式紧密排列。

[0042] 实施例2

[0043] 制备多孔凝胶的缓释性微载体

[0044] (3)将二氧化硅光子晶体的微球模板执行亲水处理

[0045] 首先，将实施例1制备所得的二氧化硅光子晶体的微球模板浸泡在体积比为7：3的浓硫酸和双氧水的混合溶液中12小时，从而提高二氧化硅光子晶体的微球模板的亲水性；用超纯水和无水乙醇反复清洗浸泡后的二氧化硅光子晶体的微球模板，置于烘箱中充分干燥，以便于后续水凝胶溶液的浸润填充。

[0046] (4)将经过亲水处理的二氧化硅光子晶体的微球模板执行预处理

[0047] 将步骤(3)所得的干燥后的二氧化硅光子晶体的微球模板浸泡在水凝胶预聚溶液中12h，使预聚溶液完全渗透进二氧化硅光子晶体的微球模板的间隙中；预聚溶液的组成包括N‑羟甲基丙烯酰胺、N‑异丙基丙烯酰胺、2‑羟基‑2‑甲基丙烯酮、聚乙二醇二丙烯酸酯和去离子水，其中，V(N‑羟甲基丙烯酰胺和N‑异丙基丙烯酰胺)：V(2‑羟基‑2‑甲基丙烯酮)：V(聚乙二醇二丙烯酸酯)：V(去离子水)＝20％：1％：5％：74％，m(W‑羟甲基丙烯酰胺)：m(W‑异丙基丙烯酰胺)＝1：9。

[0048] (5)将经过预处理的二氧化硅光子晶体的微球模板执行聚合反应，制备杂交二氧化硅光子晶体的水凝胶微球

[0049] 将步骤(4)所得的经过预处理的二氧化硅光子晶体的微球模板在紫外线的波长为365nm、光强的强度为100W的紫外光照射的条件下，垂直照射2min，进行聚合反应，得到杂交二氧化硅光子晶体的水凝胶微球；

[0050] (6)将杂交二氧化硅光子晶体的水凝胶微球执行剥离处理

[0051] 将步骤(5)所得的杂交二氧化硅光子晶体的水凝胶微球在去离子水中浸泡0.5h，包裹在二氧化硅光子晶体的微球模板外侧的水凝胶在水中溶胀，手动剥离杂交二氧化硅光子晶体的水凝胶微球外层的水凝胶，可以得到独立的杂交二氧化硅光子晶体的水凝胶微球。

[0052] (7)将经过剥离处理的杂交二氧化硅光子晶体的水凝胶微球执行刻蚀处理，制备多孔凝胶的缓释性微载体

[0053] 将步骤(6)所得的经过剥离处理的杂交二氧化硅光子晶体的水凝胶微球放置于2％的氢氟酸中浸泡12h，刻蚀除去杂交二氧化硅光子晶体的水凝胶微球中的二氧化硅纳米粒子，最后用去离子水清洗三次，制备多孔凝胶的缓释性微载体，其电镜表征图示出于图2的(d)部分、(e)部分和(f)部分，并将多孔凝胶的缓释性微载体保存在去离子水中备用。

[0054] 根据图2中的(d)部分、(e)部分和(f)部分示出的不同放大倍数下的电镜表征结果可知，制备得到的多孔凝胶的缓释性微载体与模板具有相同有序结构。

[0055] 实施例3

[0056] 负载型缓释性微载体的制备

[0057] (8)将缓释性微载体加入到溶菌酶溶液中进行震荡，使溶菌酶填充至缓释性微载体的多孔结构，得到填充溶菌酶的缓释性微载体

[0058] 将实施例2制备得到的多孔凝胶的缓释性微载体浸入2.5mg/L异硫氰酸荧光素标记的溶菌酶溶液中，使溶菌酶填充至缓释性微载体的多孔结构，得到填充溶菌酶的缓释性微载体。

[0059] (9)将填充溶菌酶的缓释性微载体依次经过海藻酸钠溶液、氯化钙溶液处理，制备海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体。

[0060] 将步骤(8)所得的四份填充溶菌酶的缓释性微载体依次分别浸入到质量浓度分别为0.5％、1.0％、2.0％和3.0％(w/v)的海藻酸钠的溶液中8h后，加入质量浓度为2％(w/v)的氯化钙溶液，制备得到海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体。

[0061] 实施例4

[0062] 溶菌酶的释放

[0063] 将4个实施例3制备得到的海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体置于含有1.5mL PBS的培养皿中，每24h用荧光显微镜拍摄荧光照片，并用Image J软件处理。通过获得的灰度值表征荧光强度，同时用新PBS替换1.0mL上清液以保持恒定条件。持续检测22天以研究自然条件下海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体中溶菌酶的释放，并使用溶菌酶活性测定试剂盒检测释放的溶菌酶活性。实验结果示于图3中。

[0064] 根据图3中(a)部分的结果可知，2％海藻酸钠水凝胶封装的溶菌酶释放时间可长达22天。

[0065] 根据图3中(b)部分的结果可知，不同浓度海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体中的溶菌酶的释放速率不同。

[0066] 根据图3中(c)部分的结果可知，质量分数为2％的海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体中释放的溶菌酶在16天内均保持相对较高的活性(＞4000U)，甚至在第22天仍然保持活性。

[0067] 根据图4的结果可知，质量分数为2％的海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体中的溶菌酶在释放的前16天内对大肠杆菌的抑菌率高于70％。

[0068] 实施例5

[0069] 海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体的温度响应性能

[0070] 为了探究多孔微载体的温度响应性，将4个实施例3制备得到的海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体置于含有1.5mL PBS的培养皿中，并将其分别加热至35℃、37℃、39℃、45℃，各自保持10分钟。随后，将培养皿置于暗室温度下15分钟以恢复膨胀状态，并通过显微镜拍摄荧光图片，重复10次循环，每次循环后用新PBS替换1.0mL上清液。荧光强度通过Image J软件处理，实验结果示于图5中。

[0071] 根据图5中的结果分析可知，海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体中溶菌酶释放量与温度呈正相关。温度为39℃一组的(溶菌酶的释放量为39.25％)溶菌酶释放量是35℃组(溶菌酶的释放量为18.29％)的两倍。上述结果表明，海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体中溶菌酶的释放可以通过温度的调节进行控制。即温度高于体积相转变温度(39℃)将加速海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体中溶菌酶的释放。然而，在45℃下重复10次循环后，只有43.71％的溶菌酶从海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体中释放出来，表明制备的海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体对更高温度(高于体积相转变温度)具有耐受性。

[0072] 实施例6

[0073] 海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体抑菌性能

[0074] 使用革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(ATCC12600)和革兰氏阴性大肠杆菌(ATCC29522)评估海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体的抗菌活性。

[0075] 首先，将酒精浸泡后的多孔凝胶的缓释性微载体置于15mL试管中，分别使用质量分数依次为0％、1.0％和2.0％(w/v)的海藻酸钠溶液制备海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体；接着，将细菌浓度调整至约0.2的光密度(OD)值，然后向其中加入500μL细菌、400μL LB和500μL PBS并在37℃下培养。然后，在不同的培养时间段(0.5h、1h、1.5h、2h)将培养物稀释至适当的浓度，并涂布在LB琼脂板上。最后，37℃培养12h后，对菌落数进行统计以确定抗菌活性。实验结果示于图6中。

[0076] 根据图6中的结果分析可知，相比于不添加溶菌酶的对照组而言，三种不同浓度0％、1.0％和2.0％海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性均随时间增加而增强。其中，浓度为0％的海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体表现出比浓度为1.0％和2.0％海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体更高的抗菌活性，在1.5h时对金黄色葡萄球菌的抑菌率为100％，对大肠杆菌的抑菌率为
97.8％，这是由于浓度为0％的海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体比浓度为1.0％和2.0％的海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体释放出更多的溶菌酶。并且随着时间的增加三种海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均能达到100％抑制率。

[0077] 根据图7的结果分析可知，由于缓释性微载体的温度响应性能，三种不同浓度0％、1.0％和2.0％海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体，在39℃处理下短时间内能明显增强其抗菌效果。

[0078] 实施例7

[0079] 海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体与等量游离溶菌酶溶液的抑菌性能比较

[0080] 进一步比较海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体中的溶菌酶和等量游离溶菌酶溶液在37℃下对大肠杆菌作用2h的抑菌效果，其中，对照组中只有大肠杆菌。实验结果示于图8中。

[0081] 根据图8中b部分的实验结果分析可知，海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体中的溶菌酶对大肠杆菌的抑制率约为游离溶菌酶溶液的1.2倍。然而，根据图5中37℃条件下进行的实验数据可知，从海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体中释放出的溶菌酶只有一部分(约24.53％～25.12％)，浓度远远低于等量游离溶菌酶溶液。

[0082] 对于图8中b部分所示实验结果的解释如下：增强的抑菌性能归因于缓释性微载体内部有序的纳米孔洞结构，溶菌酶从纳米孔洞中的持续释放导致海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体表面具有较高浓度的溶菌酶，从而提高了溶菌酶的抑菌效率(这一机理解释的示意图如图8中的c部分所示)。另一个可能的机理是海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体增加了溶菌酶对细菌的粘附，从而增强了溶菌酶与细菌之间的相互作用。此外，缓释性微载体的纳米孔洞结构为酶提供了限域空间，有利于酶二级结构的保持，使得负载在纳米孔洞中的溶菌酶在更长时间内保持高活性。

[0083] 实施例8

[0084] 海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体促创面修复性能(1)SD大鼠经腹腔注射10％水合氯醛溶液麻醉(0.5mL/100g)，随后在大鼠背部剪去直径为1cm的圆形皮肤全层，将OD值约为0.2的大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)混悬液注入伤口区域，以建立伤口感染模型。(2)将12只大鼠随机分为4组，分为空白组，缓释性微载体组，溶菌酶组和海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体组。伤口造模后分别在第0、5、7、10、12和14天进行创面拍照。14天后分别进行HE染色、马松染色、TNF‑α和IL‑6免疫组化检测及CD31@a‑SMA免疫荧光检测。实验结果示于图9中。

[0085] 根据图9中a部分和b部分所示的结果分析可知，海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体组显示出最快的愈合效果。

[0086] 根据图9中c部分所示的结果分析可知，海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体组创面的促炎因子(IL‑6、TNF‑α)阳性率最低。

[0087] 根据图10中a部分和b部分所示的结果分析可知，海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体组中伤口的未上皮化组织程度最小。

[0088] 根据图10中c部分所示的结果分析可知，海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体组中胶原沉积量最多。

[0089] 根据图11中a部分和b部分所示的新生血管的生成情况的结果分析可知，海藻酸钠封装的溶菌酶负载的缓释性微载体组能够明显的促进血管的再生。

[0090] 本公开的实施例提供的负载型缓释性微载体及其制备方法和应用，通过将二氧化硅光子晶体作为模板，制备了具有三维纳米网络结构的缓释性微载体，缓释性微载体的有序的多孔结构和相互连接的纳米通道提高了载药效率，同时纳米限域空间为溶菌酶的稳定性提供了一个良好的环境；缓释性微载体的骨架N‑异丙基丙烯酰胺具有温度响应性能，使得包裹在缓释性微载体的纳米孔洞中的药物(例如，溶菌酶)可以在伤口炎症引起的相对高温下可控、持续地释放，避免了药物的滥用；利用温度作为驱动力来加速溶菌酶的转移，溶菌酶从缓释性微载体的纳米孔洞中的持续释放，导致缓释性微载体和细菌的细胞壁之间接触界面处的溶菌酶浓度显著增加，从而提高抗菌效果；同时缓释性微载体的温度智能响应性孔结构延长了抗菌时间。

[0091] 以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。