长链非编码RNA lnc-ob1在诊断或治疗骨细胞衰老中的应用

摘要

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种长链非编码RNA lnc‑ob1在诊断或治疗骨衰老中的应用。本发明证实了lnc‑ob1可促进骨细胞衰老，敲低lnc‑ob1具备在体内抑制骨细胞衰老进而延缓增龄性骨丢失的作用，为骨细胞衰老的防治提供了新的研究方向。

权利要求

1.抑制长链非编码RNA lnc‑ob1表达的试剂在制备治疗骨细胞衰老药物中的应用；

所述试剂为含长链非编码RNA lnc‑ob1基因的反义寡核苷酸的转染试剂；

所述长链非编码RNAlnc‑ob1基因的反义寡核苷酸包括鼠源长链非编码RNA lnc‑ob1基因的反义寡核苷酸或人源长链非编码RNA lnc‑ob1基因的反义寡核苷酸；所述鼠源长链非编码RNA lnc‑ob1基因的反义寡核苷酸的序列信息如SEQ ID NO.7‑SEQ ID NO.12所示，所述人源长链非编码RNA lnc‑ob1基因的反义寡核苷酸的序列信息如SEQ ID NO.13‑SEQ ID NO.18所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为载体药物，所述载体含有长链非编码RNA lnc‑ob1基因的反义寡核苷酸。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体为脂质体、纳米载体、病毒载体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒载体为腺病毒载体、腺相关病毒载体，慢病毒载体。

说明书

长链非编码RNA lnc‑ob1在诊断或治疗骨细胞衰老中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医学领域，具体涉及一种长链非编码RNA lnc‑ob1在诊断或治疗骨细胞衰老中的应用。

背景技术

[0002] 衰老是一个复杂的过程，其特征是生理完整性和器官功能的逐步下降。导致机体衰老的一个主要因素是干细胞的衰老和衰竭，其会破坏组织的维持和损害器官的再生。细胞衰老是导致组织器官老化和退行性病变的始动因素，因此开发能够调控细胞衰老的新药物或新方法是延缓机体组织器官的衰老的有效策略。

[0003] 骨质疏松症是一种发病率高且危害巨大的骨退行性疾病，是老龄人致残致死的主要原因之一。现有研究发现，随着年龄的增长骨组织内多种细胞的衰老比例显著增加。其中骨细胞是骨组织内数量多、存活时间长、骨稳态调控能力强大的重要细胞类群，并且骨细胞的衰老被认为是导致增龄性骨丢失或骨衰老过程的关键衰老细胞类群。因此，针对骨细胞的衰老过程，鉴定新的调控骨细胞衰老的分子靶点进而开发干预策略对延缓骨衰老至关重要。

[0004] 长链非编码RNA(long non‑coding RNA，lncRNA)是转录本长度大于200bp的非编码RNA，可从基因转录、转录后修饰、蛋白翻译、翻译后修饰等多个层面调控基因的表达，在许多生理和病理学变化过程中发挥重要调控作用。今年的研究显示，lncRNA能够通过介导端粒磨损、染色质重构、衰老细胞SASP等方式调控细胞的衰老，有希望成为调控细胞衰老的潜在药物靶点。

[0005] 长链非编码RNA lnc‑ob1是申请人克隆并命名的保守lncRNA分子，目前尚未见关于lnc‑ob1和细胞衰老是否相关的文献报道，同时lnc‑ob1和骨细胞衰老的研究也未见报道。

发明内容

[0006] 本发明旨在提供一种长链非编码RNA lnc‑ob1在诊断或治疗骨细胞衰老中的应用。本发明证实了lnc‑ob1可促进骨细胞衰老，敲低lnc‑ob1具备在体内抑制骨细胞衰老进而延缓增龄性骨丢失的作用，为骨细胞衰老的防治提供了新的研究方向。

[0007] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0008] 本发明的第一个目的是提供一种抑制长链非编码RNA lnc‑ob1表达的试剂在制备治疗骨细胞衰老药物中的应用。

[0009] 优选的，所述试剂为含长链非编码RNA lnc‑ob1基因的反义寡核苷酸的转染试剂。

[0010] 本发明的第二个目的是提供一种长链非编码RNA lnc‑ob1在筛选诊断或治疗骨细胞衰老药物中的应用，所述药物抑制长链非编码lnc‑ob1的表达。

[0011] 优选的，所述药物为载体药物，所述载体含有长链非编码RNA lnc‑ob1基因的反义寡核苷酸。

[0012] 优选的，所述长链非编码RNA lnc‑ob1基因的反义寡核苷酸包括鼠源长链非编码RNA lnc‑ob1基因的反义寡核苷酸或人源长链非编码RNA lnc‑ob1基因的反义寡核苷酸；所述鼠源长链非编码RNA lnc‑ob1基因的反义寡核苷酸的序列信息如SEQ ID NO.7‑SEQ ID NO.12所示，所述人源长链非编码RNA lnc‑ob1基因的反义寡核苷酸的序列信息如SEQ ID NO.13‑SEQ ID NO.18所示。

[0013] 优选的，所述载体为脂质体、纳米载体、病毒载体。

[0014] 优选的，所述病毒载体为腺病毒载体、腺相关病毒载体，慢病毒载体。

[0015] 本发明的第三个目的是提供一种检测长链非编码RNA lnc‑ob1表达水平的试剂在制备检测骨细胞衰老试剂中的应用。

[0016] 本发明的又一个目的是提供一种检测长链非编码RNA lnc‑ob1表达水平的试剂在制备检测骨细胞衰老的试剂盒中的应用，所述试剂盒检测骨细胞衰老时长链非编码RNA lnc‑ob1的表达。

[0017] 本发明的实验设计原理及思路：

[0018] 1、本发明在试验过程中，首先设计鼠源lnc‑ob1和人源lnc‑ob1的特异性引物，通过分离提取人和小鼠正常及年老骨组织的骨细胞，采用实时荧光定量PCR(Q‑PCR)检测鼠源lnc‑ob1和人源lnc‑ob1在不同年龄骨组织的表达水平，证实lnc‑ob1在衰老骨细胞中的高表达。

[0019] 其中，所述鼠源lnc‑ob1的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1，所述人源lnc‑ob1的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；鼠源lnc‑ob1 Q‑PCR检测时的特异性引物为Mouse Q‑PCR上游引物序列信息如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列信息如SEQ ID NO.4所示；人源lnc‑ob1Q‑PCR检测时的特异性引物为Human Q‑PCR上游引物序列信息如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列信息如SEQ ID NO.6所示。

[0020] GGGTTGGGCAGGCATCCGCAGCTCCCATCTTCCGAGGCCGCCGCAGCGCCGCTGGCCGCAGCCCCGGGAGTCCGTTCCGAACCACGGCCAGTGCTTGACCCAGTGCCCAGGCCGCCGCCGAGCGGCGGCAGAGTGAAGCCTGGCGGCGAAGGAGGCGGCGGCGGGAGCCCCACGAGGGACGGCGTAGGAGGCGGCGGTGGCCCTGCGGGCGGAGAGCTGGCAGCCAACACGTTCCCCATGGTATCTGCGAGGGGAAAGCTTGAAGCCTCTGCTCCTTCCGCTGTTGTCGGCAGATGAGGATGCCTGTGCCAGCCACTGCGGTGGCGATGATGGCAGCGATAATACCTCCAATGATGCCACCAGTGGCCCCTGCTCCTGCTGTGCTGGGTGACTCTGTCAGGACAAAGACAGCATGGGGTCACTATGGAAAACTCACAGCCGCTTCTGCCAGCCCTGTCCTTCAGATACTACCTATGCCAGACTTTTCAAAATGATTGTTTTATGTATTTGTTGAGACAGGGTCTCACATTGTAGGCCAGGCTGGCTGGGACTCTCTGTAAACCAGAATAAACCCATGCCTCTGCCTTCCAAGTGTAGGCATTATGGGCATGTGCCATC(SEQ ID NO.1)；

[0021] GCTTTGACCCTTGCAGCATTTTGATTGGCTCCAGCGTGTACGGGGTCGACCTTGGTGGCGTATCAGCTTGGTACTCTCATTGGCTAACGTTCCAGGGTCGAAGGACAGGTAAAGCGTCTGCTCCTTCCGCTGCTGCCGGCAGATAAGGATGCCCGTGGCAGCCACAGCAGTAGCAATGATGGCGGCGATGATGCCCCCGATGATGCCGCCTGTGGCCCCTGCGCCTGCTGTGTTGGGGGTCTCTGCAAGGAGAGGGACAGCGTGAGGGGGTCTCCAGGAGGAAGCCACAGCTCCTTATTC CAAGCGACCATCCCACCCCACATCATCGCCTGCCTGTCTATGTCCTCTCCCATGGGCAGGGGACATTCTTTCATTCAACTCAAACTGCTGAGCATGAGGAAGGAGCGAGGATGTGTGCCCCGCATG(SEQ ID NO.2)[0022] GGGGTACCGGGTTGGGCAGGCATCCGCAGC(SEQ ID NO.3)；

[0023] CGGAATTCGATGGCACATGCCCATAATGCC(SEQ ID NO.4)；

[0024] GGGGTACCGCTTTGACCCTTGCAGC(SEQ ID NO.5)；

[0025] CGGAATTCCATGCGGGGCACACATCC(SEQ ID NO.6)。

[0026] 2、通过构建ROS诱导和紫外线(UV)诱导的骨细胞衰老模型，设计特异性基因扩增引物，Q‑PCR检测鼠源和人源lnc‑ob1序列的表达水平，证实了在衰老骨细胞中lnc‑ob1分子表达显著上调。

[0027] 3、通过构建ROS诱导的骨细胞衰老模型，采用靶向lnc‑ob1的反义寡核苷酸(ASO‑lnc‑ob1)沉默lnc‑ob1基因的表达，分析敲低lnc‑ob1对骨细胞衰老的影响。并通过详细的分子机制探究发现敲低lnc‑ob1能够显著抑制骨细胞中衰老相关基因的表达进而抑制骨细胞衰老。

[0028] 4、通过构建ROS诱导的骨细胞衰老模型，采用质粒进行骨细胞lnc‑ob1的过表达，分析lnc‑ob1对骨细胞衰老的影响。结果发现过表达lnc‑ob1可以显著促进骨细胞中衰老相关基因的表达，说明lnc‑ob1可促进骨细胞的衰老。

[0029] 5、最后，通过对20月龄衰老小鼠进行lnc‑ob1反义寡核苷酸(ASO‑lnc‑ob1)治疗，分析在体内敲低lnc‑ob1对骨细胞衰老的影响。结果发现在体内敲低lnc‑ob1的表达能显著降低衰老骨细胞的比例，同时提高了小鼠的骨量，说明在体内抑制lnc‑ob1可以抑制骨细胞衰老从而对抗衰老小鼠的骨丢失。

[0030] 其中，本发明所述敲低鼠源lnc‑ob1表达的ASO‑lnc‑ob1包括SEQ ID NO.7‑SEQ ID NO.12所示序列中的一种或几种，*代表硫代碱基，序列信息如下：

[0031] 5’–G*C*A*T*A*G*G*T*A*G*T*A*T*C*T*G*A*A*G*G–3’(SEQ ID NO.7)；

[0032] 5’–A*T*C*A*T*T*T*T*G*A*A*A*A*G*T*C*T*G*G*C–3’(SEQ ID NO.8)；

[0033] 5’–G*G*C*C*A*C*T*G*G*T*G*G*C*A*T*C*A*T*T*G–3’(SEQ ID NO.9)；

[0034] 5’–G*A*T*G*G*G*A*G*C*T*G*C*G*G*A*T*G*C*C*T–3’(SEQ ID NO.10)；

[0035] 5’–C*T*C*C*C*G*G*G*G*C*T*G*C*G*G*C*C*A*G*C–3’(SEQ ID NO.11)；

[0036] 5’–C*G*T*G*G*G*G*C*T*C*C*C*G*C*C*G*C*C*G*C–3’(SEQ ID NO.12)。

[0037] 本发明所述敲低人源lnc‑ob1表达的ASO‑lnc‑ob1包括SEQ ID NO.13‑SEQ ID NO.18所示序列中的一种或几种，*代表硫代碱基，序列信息如下。

[0038] 5’–A*A*T*C*A*A*A*A*T*G*C*T*G*C*A*A*GG*G*T–3’(SEQ ID NO.13)；

[0039] 5’–A*C*A*T*C*C*T*C*G*C*T*C*C*T*T*C*C*T*C*A–3’(SEQ ID NO.14)；

[0040] 5’–A*A*G*G*A*G*C*T*G*T*G*G*C*T*T*C*C*T*C*C–3’(SEQ ID NO.15)；

[0041] 5’–T*C*G*G*G*G*G*C*A*T*C*A*T*C*G*C*C*G*C*C–3’(SEQ ID NO.16)；

[0042] 5’–G*G*G*C*A*T*C*C*T*T*A*T*C*T*G*C*C*G*G*C–3’(SEQ ID NO.17)；

[0043] 5’–A*C*G*C*C*A*C*C*A*A*G*G*T*C*G*A*C*C*C*C–3’(SEQ ID NO.18)。

[0044] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0045] (1)本发明通过体内外系列实验证实了lnc‑ob1可促进骨细胞衰老，证实了其是通过抑制lnc‑ob1的表达进而抑制骨细胞衰老进而延缓增龄性骨丢失的作用；

[0046] (2)本发明通过在老龄小鼠体内的药效评价，证明了敲低lnc‑ob1可以在体内抑制骨细胞衰老进而延缓增龄性骨丢失的作用；

[0047] (3)本发明通过在ROS诱导的骨细胞衰老模型中检测lnc‑ob1的表达水平，证实敲低lnc‑ob1可以显著抑制骨细胞中衰老相关基因的表达；

[0048] (4)本发明首次证明了lnc‑ob1具有在体内抑制骨细胞衰老的能力，为研究开发能够调控细胞衰老的新药物或新方法提供了新的方向。

附图说明

[0049] 图1为不同来源的lnc‑ob1在正常及年老骨组织的骨细胞中的表达水平图；

[0050] 图2为不同来源的lnc‑ob1在ROS诱导和紫外线(UV)诱导的骨细胞衰老模型中的表达水平图；

[0051] 图3为敲低lnc‑ob1在抑制骨细胞中衰老相关基因的表达水平图；

[0052] 图4为过表达lnc‑ob1在促进骨细胞中衰老相关基因的表达水平图；

[0053] 图5为lnc‑ob1反义寡核苷酸(ASO‑lnc‑ob1)治疗后，具有降低衰老骨细胞和对抗骨丢失的作用结果图。

具体实施方式

[0054] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

[0055] 实施例1基因克隆构建lnc‑ob1真核表达载体

[0056] 以人或小鼠细胞的cDNA为模板，用SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4所示的引物序列，PCR扩增人和小鼠lnc‑ob1基因，并克隆至pcDNA3.1(+)载体的KpnI/EcoRI克隆位点。挑取细菌转化的克隆，进行测序鉴定。将测序鉴定正确的克隆保存菌种，并用无内毒素质粒提取试剂盒(天根生物，货号DP117)提取质粒用于后续实验。

[0057] 详细过程如下：

[0058] (1)基因扩增：本发明所有基因的扩增均采用TAKARA公司 Max DNA Polymerase试剂进行，货号R045A。

[0059] 基因PCR扩增过程如下：A、从‑20℃取出冻存的扩增引物和DNA聚合酶，提前准备好枪头、PCR管等耗材，并预热PCR仪器；B、按照如下体系进行50μL PCR反应体系的配制：Max DNA Polymerase 25μL；Primer Forward(10μM)1.5μL；Primer 
Reverse(10μM)1.5μL；cDNA or plasmid template<200ng；3dH2O Up to 50μL；C、混合均匀后，放入PCR仪中进行扩增，扩增程序如下：98℃10sec，55℃15sec，72℃5‑10sec/kb，
30Cycles，72℃5min，4℃forever；D、扩增完成后进行PCR产物的胶回收。

[0060] (2)胶回收：所有胶回收实验均采用：E.Z.N.A cycle‑pure Kit试剂盒(购自OMEGA公司，货号D6492)进行。

[0061] 胶回收过程如下：A、用1％琼脂糖凝胶分离PCR扩增产物或酶切后的DNA片段；B、对照DNA Marker在切胶仪上切下目标条带并放入EP管中称重；C、按照1g凝胶加入1mL binding buffer的比例加入binding buffer，混合后65℃加热直至凝胶完全融化，可隔2min涡旋混匀一次；D、将溶解后的凝胶全部转移至DNA结合柱内，12000×g室温离心1min；
E、用300μL Hibind buffer清洗柱子一次，12000×g室温离心1min；F、随后用700μL SPW wash buffer洗柱子两次，每次12000×g室温离心1min；G、洗涤完成后，12000×g室温离心空管2min；H、向柱内垂直滴加30‑50μL 3dH2O，室温静置5min，12000g×离心1min；I、收集胶回收片段，测定浓度后于‑20℃保存。

[0062] (3)酶切：所用限制性内切核酸酶均为TAKARA公司QuickCut系列快速反应酶。

[0063] 酶切过程如下：A、从‑20℃取出10×QuickCut buffer并溶解；B、在PCR管内配制酶切体系：10×QuickCut Buffer 5μL，DNA或质粒1.5μg，QuickCut内切酶1μL，3dH2O Up to 50μL；C、混合均匀各组分后，根据内切酶的最适反应温度37℃/30℃水浴锅酶切30min；D、酶切产物可于‑20℃进行保存或立刻进行电泳分离。

[0064] (4)连接：所用T4 DNA连接酶购自TAKARA公司，货号2011A。

[0065] 反应体系为：T4 DNA连接酶1μL，10×反应缓冲液2μL，目的基因片段300ng，质粒酶切片段100ng，3dH2O Up to 20μL；在PCR管内混合均匀各组分后，于16℃水浴连接过夜，连接产物可直接用于转化实验。

[0066] (5)转化：

[0067] 转化过程如下：A、从‑80℃冰箱取出感受态DH5α细菌，置于冰上融化；B、待完全融化后于超级台内加入5‑10μL连接产物，混合均匀；C、将感受态细菌置于冰上30min，可间隔10min轻轻混匀一次；D、冰浴结束后，将EP管放在泡沫架上，于42℃水浴中热击90sec，再冰浴3min；E、冰浴结束后，加入1mL LB液体培养基，于摇床150rpm培养1h；F、取50‑100μL培养基均匀涂布于含合适抗生素的LB平板上，于37℃恒温培养箱倒置培养；G、24‑48h观察是否有细菌克隆长出。

[0068] (6)克隆鉴定：

[0069] 克隆鉴定过程如下：A、在超净台内用接种环挑取单克隆接种于5mL含有抗生素的LB液体培养基中，于37℃200rpm摇床培养16h；B、超净台内吸取500μL菌液加入EP管中，随后12000×g室温离心2min收集菌体；C、完全吸弃残留培养基，并用80μL灭菌3dH2O重悬菌体；
D、金属加热器上100℃处理8min，随后12000×g室温离心2min，取上清进行PCR检测；E、PCR结束后琼脂糖电泳检测是否为目标克隆；F、对于鉴定正确的目标克隆，取部分菌液保存菌种，部分菌液送测序公司进行测序鉴定；G、对于测序鉴定正确的克隆做好标记并保存至‑20℃/‑80℃冰箱备用。

[0070] 实施例2骨细胞分离培养

[0071] 参考(Biotechniques，2012，52(6)：361‑373.记载的)Amber Rath Stern等人建立的骨细胞原代培养方法进行人和小鼠骨细胞的分离培养。

[0072] 具体实验过程如下：取人股骨头组织或小鼠后肢股骨及胫骨，HBSS缓冲液冲洗去除骨髓：用300U/mL胶原酶IA处理30min、用300U/mL胶原酶IA处理30min、用300U/mL胶原酶IA处理30min、5mM EDTA处理15min、用300U/mL胶原酶IA处理20min、5mM EDTA处理15min；用300U/mL胶原酶IA处理20min、5mM EDTA处理15min、用300U/mL胶原酶IA处理20min，共计9次消化；收集第9次消化所得的细胞并合并消化残余的骨碎片，用HBSS洗涤一次，300g离心
10min收集细胞。将细胞和骨片一起培养于T25细胞培养皿中，培养基配方为α‑MEN+7.5％胎牛血清+7.5％小牛血清+1％双抗；于37℃5％ CO2的细胞培养箱中培养，每3天换液一次，至细胞达90％密度进行传代或直接进行细胞衰老分析、RNA/蛋白提取等分析。

[0073] 通过Q‑PCR检测分离培养后的人源和鼠源正常及年老骨组织的骨细胞中lnc‑ob1的表达水平，实验结果如图1所示，其中，由图1(A)可知，人源lnc‑ob1在正常及年老骨组织的骨细胞中的表达，与60‑70岁组相比，80‑90岁组人骨组织分离所得骨细胞中lnc‑ob1的表达水平显著增加；由图1(B)可知，鼠源lnc‑ob1在正常及年老骨组织的骨细胞中的表达，与6月龄成年小鼠相比，小鼠骨细胞lnc‑ob1的表达水平随小鼠月龄增加逐渐增高。由此可见，通过Q‑PCR检测鼠源和人源衰老骨细胞中lnc‑ob1的表达水平，证实了lnc‑ob1在衰老骨细胞中的高表达。

[0074] 实施例3ROS诱导的骨细胞衰老模型

[0075] 正常培养原代人和小鼠骨细胞，将细胞传代后移200000/mL的密度接种于6孔板中，2mL/孔。细胞接种24h后换液，用含100μM t‑BHP(Sigma，#458139)的培养基处理细胞3天，得到ROS诱导的骨细胞衰老模型。

[0076] 通过Q‑PCR检测骨细胞衰老模型中lnc‑ob1的表达水平，实验结果如图2所示，图2(A)和图2(B)为不同来源的lnc‑ob1在ROS诱导的骨细胞衰老模型中的表达水平图；以未经过t‑BHP处理的细胞作为对照组，人源lnc‑ob1和鼠源lnc‑ob1的表达水平在ROS诱导的骨细胞衰老模型中均显著增加，说明衰老骨细胞中lnc‑ob1分子表达显著上调。

[0077] 实施例4紫外线诱导的骨细胞衰老模型

[0078] 正常培养原代人和小鼠骨细胞，将细胞传代后移200000/mL的密度接种于6孔板中，2mL/孔。细胞接种24h后进行UVA照射(model HB 406/A，Philips，Groningen，Holland)，2
1.4J/cm照射60分钟，将细胞继续培养2天，得到紫外线诱导的骨细胞衰老模型。

[0079] 通过Q‑PCR检测骨细胞衰老模型中lnc‑ob1的表达水平，实验结果如图2所示，图2(C)和图2(D)为不同来源的lnc‑ob1在紫外线(UV)诱导的骨细胞衰老模型中的表达水平图；以未经过UV照射的细胞作为对照组，人源lnc‑ob1和鼠源lnc‑ob1的表达水平在紫外线诱导的骨细胞衰老模型中均显著增加，进一步说明衰老骨细胞中lnc‑ob1分子表达显著上调。

[0080] 实施例5细胞转染

[0081] 利用Lipo2000转染lnc‑ob1表达载体或反义寡核苷酸ASO至人或小鼠骨细胞，转染按照说明书进行，取2000ng质粒或100nM ASO加入含125μL opti‑MEM培养基的EP管中吹打混匀，取5μL Lipo2000转染试剂加入含125μL opti‑MEM培养基的EP管中吹打混匀，将2个含有试剂的EP管室温静置5min，随后1：1混合2个EP管内的试剂制成转染混合物，室温静置20min，此后将转染混合物250μL加入至培养板内。转染2天后进行基因和蛋白表达水平的分析。

[0082] 实施例6总RNA提取及基因表达水平分析

[0083] 细胞总RNA的提取按照天根生化科技(北京)有限公司TRNzol Universal总RNA提取试剂(DP424)进行。6孔板每个孔加入1mL Trizol裂解细胞并用枪头反复吹打，室温作用5分钟。将裂解液移入1.5mL离心管中，加入200μL氯仿，盖紧管盖，涡旋混匀室温静置3分钟，4℃，12000g/min离心15分钟。将上层水相液体转移至新的1.5mL离心管中，加入500μL异丙醇，涡旋混匀室温静置10分钟，4℃，12000g/min离心10分钟。将上清用移液器吸取，丢弃，保留底部白色沉淀。加入1mL 75％乙醇(DEPC水配制)，用手轻轻将白色沉淀弹起，然后在4℃条件下，7500g/min离心5分钟。弃上清，室温干燥10‑15分钟，加入30‑40μL DEPC水重新溶解，RNA置于‑80℃冰箱中保存或直接使用。

[0084] 使用反转录试剂盒(TaKaRa，货号RR047A)，根据试剂盒的操作流程，将提取的1000ng总RNA反转录成cDNA。反转录过程如下：(1)测定浓度后，按照10μL反转录体系加入
500ng总RNA的量计算需要加入的RNA和DEPC水的体积；(2)向PCR管中依次加入DEPC水，总RNA和5×PrimeScriptTM RT Master Mix(TAKARA)，并混合均匀；(3)于PCR仪上按照37℃
15min，85℃5sec，4℃hold的程序进行反转录扩增；(4)扩增后的cDNA用灭菌的三蒸水稀释
30‑50倍使用，可于‑20℃长期保存。

[0085] 参考试剂盒说明书(TaKaRa，货号RR820A)使用实时荧光定量PCR技术检测基因的表达水平。实时荧光定量PCR技术过程如下：(1)提前准备好检测引物，所述引物信息如下表1SEQ ID NO.19‑SEQ ID NO.38所示，灭菌三蒸水，96孔PCR板，荧光定量试剂；(2)根据待检测基因的数目分配反应产物在96孔PCR板中的具体位置；(3)按照每个待检测基因每个样品三个复孔的比例配制反应液：20μL反应体系中含cDNA模板2μL， Premix Ex TaqTM II(TAKARA)试剂10μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，三蒸水6μL；(4)将全部反应液加入相应孔后，用专用封口膜封闭96孔PCR板，并2500rpm离心3min；(5)离心完成后，于BIO‑RAD公司CFX96 TouchTM荧光定量PCR检测系统上机检测，反应程序为：A、预变性95℃30sec；B、PCR反应：95℃5sec，60℃30sec，读板，循环40次；C、拟合曲线并读板；(6)反应完成后，用系统自带分析软件进行数据分析，排除3个复孔中CT值差异大于0.5的数值，并根据内参基因计算各检测基因的相对表达水平。

[0086] 表1扩增所述鼠源核苷酸序列和人源核苷酸序列的引物信息

[0087]SEQ ID NO. 引物名称 引物序列
19 Mouse lnc‑ob1‑F CTGCGAGGGGAAAGCTTGAA
20 Mouse lnc‑ob1‑R CTGGTGGCATCATTGGAGGTA
21 Mouse p21‑F GAGCAGTTGCGCCGTGATTG
22 Mouse p21‑R CCCAGACGAAGTTGCCCTCC
23 Mouse p16‑F GTCGTACCCCGATTCAGGTGAT
24 Mouse p16‑R GAAGGTAGTGGGGTCCTCGC
25 Mouse mmp9‑F GCGGCCCTCAAAGATGAACGG
26 Mouse mmp9‑R GCTGACTACGATAAGGACGGCA
27 Mouse Gapdh‑F TGTGTCCGTCGTGGATCTGA
28 Mouse Gapdh‑R CCTGCTTCACCACCTTCTTGA
29 Human lnc‑ob1‑F GATTGGCTCCAGCGTGTA
30 Human lnc‑ob1‑R CCGCCATCATTGCTACTG
31 Human p16‑F CTGAGGAGCTGGGCCATCG
32 Human p16‑R ATCGGGGATGTCTGAGGGAC
33 Human p21‑F AGAGGAAGACCATGTGGACCTGT
34 Human p21‑R TTGGAGTGGTAGAAATCTGTCATGC
35 Human MMP9‑F TCCAGTTTGGTGTCGCGGAG
36 Human MMP9‑R ACCGAGTTGGAACCACGACG
37 Human GAPDH‑F AGCCTCAAGATCATCAGCAATG
38 Human GAPDH‑R CACGATACCAAAGTTGTCATGGAT

[0088] 采用实施例3构建成功的ROS诱导的骨细胞衰老模型，通过靶向lnc‑ob1的反义寡核苷酸(ASO‑lnc‑ob1)沉默lnc‑ob1基因的表达，实验结果如图3所示，与反义对照组寡核苷酸ASO组相比，敲低lnc‑ob1可以显著抑制骨细胞中衰老相关基因的表达。

[0089] 采用实施例3构建成功的ROS诱导的骨细胞衰老模型，通过转染lnc‑ob1表达载体，分析过表达lnc‑ob1对骨细胞的影响。实验结果如图4所示，与反义对照组寡核苷酸ASO组相比，过表达lnc‑ob1能够显著促进骨细胞中衰老相关基因的表达。

[0090] 实施例7体内敲降lnc‑ob1延缓骨细胞衰老

[0091] 取同窝20月龄C57BL/6雌性未孕小鼠，将小鼠分为2组，每组6只小鼠，包括ASO对照处理组，ASO‑lnc‑ob1实验组。所述ASO对照处理组的序列如下SEQ ID NO.39所示，检测小鼠体内敲低lnc‑ob1表达的ASO‑lnc‑ob1的表达水平，所述敲低鼠源lnc‑ob1表达的ASO‑lnc‑ob1的序列如SEQ ID NO.7‑SEQ ID NO.12所示。用in vivo jetPEI(POLYPLUS，货号PT‑201)试剂进行ASO的体内递送，将20μg ASO和2.4μL in vivo‑jetPEI试剂分别溶解于12.5μL 10％蔗糖溶液，涡旋3秒钟混匀，随后将包含ASO的12.5μL 10％蔗糖溶液和包含in vivo‑jetPEI试剂的12.5μL 10％蔗糖溶液混合，并稀释到50μL，随后室温静置15分钟。按照25μL/只小鼠/股骨的比例将如上混合试剂注射到小鼠股骨。每周注射1次，一共4次。治疗1个月后用4％多聚甲醛心脏灌流固定小鼠。取出小鼠的股骨。4％多聚甲醛固定1周，microCT(μCT 
50，Scanco Medical)对骨样本进行扫描，并分析骨小梁的体积比(BV/TV)和骨小梁的数量(Tb.N)。对骨组织切片进行衰老标志基因p16的免疫组化分析，并统计p16阳性细胞的比例。

[0092] 5’–C*C*T*T*C*C*C*T*G*A*A*G*G*T*T*C*C*T*C*C–3(SEQ ID NO.39)。

[0093] 实验结果如图5所示，对20月龄衰老小鼠进行lnc‑ob1反义寡核苷酸(ASO‑lnc‑ob1)治疗后，如图5(A)和图5(B)所示，在体内敲低lnc‑ob1的表达显著降低了衰老骨细胞的比例；如图5(C)和图5(D)所示，在体内敲低lnc‑ob1的表达，显著提高了小鼠的骨量。因此，说明在体内抑制lnc‑ob1具有可以抑制骨细胞衰老从而对抗衰老小鼠的骨丢失的作用。

[0094] 综上所述，本发明通过检测lnc‑ob1的表达水平，可以反映骨细胞衰老的程度。因此，可以用lnc‑ob1的这一发现来开发诊断和/或治疗骨细胞衰老中的应用，例如诊断骨细胞衰老的检测试剂/试剂盒等；同时也可以通过给骨细胞过表达lnc‑ob1构建骨细胞衰老细胞模型，来筛选抑制骨细胞衰老的药物或提供了一种新的研究策略。

[0095] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。