本发明公开了一种通过Gabriel反应合成化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光素的方法，该方法以均苯四甲酸为起始原料，与乙酸酐发生酐交换反应得均苯四甲酸酐，然后使其在冰乙酸中与甲胺反应得N‑甲基‑邻苯二甲酰亚胺‑4,5‑二羧酸；再以N‑甲基‑邻苯二甲酰亚胺‑4,5‑二羧酸和间苯二酚为原料，路易斯酸为催化剂，加热反应得关键中间体N‑甲基‑5,6‑二甲酰亚胺基荧光素，此中间体在水相中回流肼解后经过简单分离纯化即得5,6‑二甲酰肼荧光素。本发明方法简单、操作方便、反应条件温和、成本较低、产率更高，产物HPLC纯度达97％以上，适合工业化生产。
1.一种通过Gabriel反应合成化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光素的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将均苯四甲酸在乙酸酐中回流反应2～4小时，停止加热，冷却至常温，分离纯化产物，得到均苯四甲酸酐；
(2)向均苯四甲酸酐中加入冰乙酸，搅拌条件下缓慢滴加甲胺水溶液，常温搅拌反应1～2小时后再升温至120～140℃继续反应2～4小时，反应后分离纯化产物，得到N‑甲基‑邻苯二甲酰亚胺‑4,5‑二羧酸；
(3)将N‑甲基‑邻苯二甲酰亚胺‑4,5‑二羧酸、间苯二酚加热至115～125℃使之熔融，缓慢加入路易斯酸作为催化剂，在145～155℃条件下剧烈搅拌混匀后，再将反应温度缓慢升高至175～185℃继续反应至混合物完全固化，经分离后得亮黄色中间体N‑甲基‑5,6‑二甲酰亚胺基荧光素；
(4)将N‑甲基‑5,6‑二甲酰亚胺基荧光素在质量分数为10％～20％的水合肼水溶液中回流反应2～4小时，反应结束后分离纯化产物，得到5,6‑二甲酰肼荧光素。
2.根据权利要求1所述的通过Gabriel反应合成化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光素的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述均苯四甲酸与乙酸酐的摩尔比为1:2.0～2.2。
3.根据权利要求1所述的通过Gabriel反应合成化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光素的方法，其特征在于：步骤(1)中，分离纯化产物的方法为：将反应混合物抽滤，滤饼用乙醚洗涤后置于40～60℃真空干燥。
4.根据权利要求1所述的通过Gabriel反应合成化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光素的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述均苯四甲酸酐与冰乙酸、甲胺的摩尔比为1:15.0～
5.根据权利要求1所述的通过Gabriel反应合成化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光素的方法，其特征在于：步骤(2)中，反应后分离纯化产物的方法为：将反应液减压浓缩，用去离子水洗涤后干燥。
6.根据权利要求1所述的通过Gabriel反应合成化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光素的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述N‑甲基‑邻苯二甲酰亚胺‑4,5‑二羧酸与间苯二酚、路易斯酸的摩尔比为1:2.0～2.5:2.0～2.5。
7.根据权利要求1或6所述的通过Gabriel反应合成化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光素的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述路易斯酸为氯化锌。
8.根据权利要求1所述的通过Gabriel反应合成化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光素的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述分离的方法为：将反应混合物冷却至常温后，加入
0.5mol/L HCl水溶液回流反应1～2h，趁热抽滤，再用热水充分洗涤滤饼至滤液呈中性后，
9.根据权利要求1所述的通过Gabriel反应合成一种化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光素的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述N‑甲基‑5,6‑二甲酰亚胺基荧光素与水合肼的摩尔比为1:6.0～10.0。
10.根据权利要求1所述的通过Gabriel反应合成化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光素的方法，其特征在于：步骤(4)中，反应结束后分离纯化产物的方法为：将反应混合物冷却至室温后，逐滴加入6mol/L HCl水溶液调节pH为3～4，静置，抽滤，滤饼先用去离子水洗涤至滤液呈中性后，再将其加入0.5mol/L NaOH水溶液中充分搅拌，抽滤，除去不溶物，滤液用
6mol/L HCl水溶液调节pH至5～6，立即析出大量沉淀，4℃静置1～2小时，抽滤，将滤饼置于
一种通过Gabriel反应合成化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光
素的方法
技术领域
[0001] 本发明属于化学发光技术领域，具体涉及一种通过Gabriel反应合成化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光素的方法。
背景技术
[0002] 化学发光试剂是化学发光分析法得以广泛应用的基础，应用高量子产率、稳定性好的水溶性化学发光试剂，能够提高化学发光分析的灵敏度和准确度，扩大其在活体成像分析中的应用范围，因此开发及合成新的化学发光试剂成为支撑化学发光分析法在现有基础上得以继续发展的重要方向。多年来，许多学者致力于新型化学发光试剂的开发及合成。其中，以鲁米诺、异鲁米诺、ABEI及L012等为代表的环酰肼类化学发光试剂因其良好的水溶性、稳定性、发光效率高且发光持续时间较长等优异性质而得到了广泛的应用。然而，这些经典环酰肼类化学发光试剂的最大发射波长较短且发光反应受介质的酸碱性影响很大，如鲁米诺、异鲁米诺、ABEI在碱性条件下被氧化时可产生波长425nm左右的强烈化学发光，但在近中性水溶液中氧化这些发光试剂时，产生的化学发光却十分微弱；L012在生理pH条件下的化学发光可达鲁米诺的100倍，但它的发光波长也仅有480nm。当将上述化学发光试剂用于活体发光分析时，碰到了一些难以克服的问题，由于产生的化学发光波长较短，光子在哺乳动物体内传播时受到某些生物分子如蛋白质等的吸收和散射，大大降低了光子穿过组织和皮肤而被检测器捕获的能力。
[0003] 为改善和克服这些经典化学发光试剂的缺点，已有研究者在这方面进行了一些卓有成效的工作。2007年，K.Burgess等采用4‑溴邻苯二甲酰肼与炔基取代的荧光素和炔基取代尼罗红通过Heck反应得到两种具有长发射波长的新化学发光探针，邻苯二甲酰肼结构与荧光素分子、尼罗红分子之间通过炔键发生有效的化学发光能量转移。在水溶液中，邻苯二甲酰肼结构与荧光素分子通过炔键偶联得到的探针相对于鲁米诺的化学发光效率为61％，最大发光波长为518nm；邻苯二甲酰肼结构与尼罗红分子通过炔键偶联得到的探针水溶性很差，在DMSO中的化学发光效率远大于鲁米诺，最大发光波长为628nm。作者利用分子间能量转移的方法计算了邻苯二甲酰肼结构与荧光素和尼罗红分子之间能量转移的效率，前者为39％，后者为42％(Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,1684–1687.)。为进一步提高化学发光能量转化效率，吕家根等(US 20180161460 A1)在合成荧光素及罗丹明衍生物时，在分子底环上预留了两个处于邻位的羧基，经高温肼化后得到系列水溶性比鲁米诺更好、发射波长更长的新化学发光探针，5,6‑二甲酰肼荧光素是其中最具代表性的一个，这些探针通过分子内化学发光能量转移保证了较高的化学发光效率，在体外及生物活体中化学发光成像分析中显示了巨大的应用潜质。
[0004] US 20180161460 A1中通过三步反应实现了5,6‑二甲酰肼荧光素的合成，步骤不多，但是后两步最为关键的反应均在较高温度下进行，对合成设备的要求较高，加大了实验难度，副反应较多且可能因高温造成产物结构的破坏，因此，得到的合成粗产物成分相当复杂，给分离提纯带来了很大压力，这也直接导致最终产物的总产率较低，经计算总产率仅16.8％，综合生产成本将变得十分高昂，这就限制了这种试剂的大规模推广应用。因此，设计开发可在较低温度下以较低成本获得高纯度5,6‑二甲酰肼荧光素的新方法具有重要的工业生产价值，对推动化学发光分析及化学发光成像技术在化学、生物医学、环境分析及物证检验等领域的发展具有十分重要意义。
发明内容
[0005] 针对上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过Gabriel反应合成化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光素的方法，相对于现有方法，本发明方法简单、操作方便、反应条件温和、成本较低、产率更高、污染较小且适于工业化生产。
[0006] 为实现上述目的，本发明所采用的5,6‑二甲酰肼荧光素的合成路线和具体合成步骤如下：
[0007]
[0008] 1、将均苯四甲酸在乙酸酐中回流反应2～4小时，停止加热，冷却至常温，分离纯化产物，得到均苯四甲酸酐；
[0009] 2、向均苯四甲酸酐中加入冰乙酸，搅拌条件下缓慢滴加甲胺水溶液，常温搅拌反应1～2小时后再升温至120～140℃继续反应2～4小时，反应后分离纯化产物，得到N‑甲基‑邻苯二甲酰亚胺‑4,5‑二羧酸；
[0010] 3、将N‑甲基‑邻苯二甲酰亚胺‑4,5‑二羧酸、间苯二酚加热至115～125℃使之熔融，缓慢加入路易斯酸作为催化剂，在145～155℃条件下剧烈搅拌混匀后，再将反应温度缓慢升高至175～185℃继续反应至混合物完全固化，经分离后得到亮黄色中间体N‑甲基‑5,6‑二甲酰亚胺基荧光素；
[0011] 4、将N‑甲基‑5,6‑二甲酰亚胺基荧光素在质量分数10％～20％的水合肼水溶液中回流反应2～4小时，反应结束后分离纯化产物，得到5,6‑二甲酰肼荧光素。
[0012] 上述步骤1中，优选所述均苯四甲酸与乙酸酐的摩尔比为1:2.0～2.2；所述分离纯化产物的方法为：将反应混合物抽滤，滤饼用乙醚洗涤后置于40～60℃真空烘箱中干燥。
[0013] 上述步骤2中，优选所述均苯四甲酸酐与冰乙酸、甲胺的摩尔比为1:15.0～18.0:1～1.1；所述反应完后分离纯化产物的方法为：将反应液减压浓缩，用去离子水洗涤后干燥。
[0014] 上述步骤3中，优选所述N‑甲基‑邻苯二甲酰亚胺‑4,5‑二羧酸与间苯二酚的摩尔比为1:2.0～2.5；所述路易斯酸为氯化锌，N‑甲基‑邻苯二甲酰亚胺‑4,5‑二羧酸与氯化锌的摩尔比为1:2.0～2.5。所述分离的方法为：将反应混合物冷却至常温后，加入0.5mol/L HCl水溶液回流反应1～2h，趁热抽滤，再用热水充分洗涤滤饼至滤液呈中性后，40～60℃真空干燥。
[0015] 上述步骤4中，优选所述N‑甲基‑5,6‑二甲酰亚胺基荧光素与水合肼的摩尔比为1:6.0～10.0；所述反应结束后分离纯化产物的方法为：将反应混合物冷却至室温后，逐滴加入6mol/LHCl水溶液调节pH为3～4，静置，抽滤，滤饼用去离子水洗涤至滤液呈中性后，将其加入0.5mol/LNaOH水溶液中充分搅拌溶解，抽滤，除去不溶物，滤液用6mol/L HCl水溶液调节pH至5～6，立即析出大量沉淀，4℃静置1～2小时，抽滤，滤饼置于40～60℃真空烘箱中干燥。
[0016] 本发明通过Gabriel反应合成化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光素的方法与现有技术相比，其有益效果在于：
[0017] 1、本发明在生产N‑甲基‑邻苯二甲酰亚胺‑4,5‑二羧酸时，以价格低廉的均苯四甲酸为原料，通过酐交换反应得到均苯四甲酸酐，经开环和闭环两步连续反应得到产品，合成路线简单，反应条件温和，操作简单。冰乙酸作为开环与闭环反应中的溶剂，可吸收过量的甲胺气体，避免了环境污染。除冰乙酸和反应原料外，未使用类似合成反应中经常使用的有机反应溶剂如甲苯、二甲苯等，避免了因溶剂与产物难分离而给产物提纯带来的困难。
[0018] 2、本发明得到的N‑甲基‑邻苯二甲酰亚胺‑4,5‑二羧酸可不经过进一步纯化处理直接用于关键中间体N‑甲基‑5,6‑二甲酰亚胺基荧光素合成。反应中将苯环上两组相邻羧基中的一组转变成N‑甲基取代邻苯二甲酰亚胺结构，另外一组相邻羧基则被保留下来，用于与间苯二酚反应合成关键中间体N‑甲基‑5,6‑二甲酰亚胺基荧光素，可通过适当加大原料间苯二酚用量的方法提高N‑甲基‑5,6‑二甲酰亚胺基荧光素产率而不至于产生复杂的副产物。
[0019] 3、本发明合成化学发光试剂5,6‑二甲酰肼荧光素的最后一步肼化反应在质量分数为10％～20％的水合肼水溶液中进行，相比于5,6‑二羧基荧光素与水合肼在三乙二醇溶剂中的肼化反应而言，反应温度较低，避免了可能生成更多的副产物，反应结束后用盐酸将反应混合物直接酸化，过滤，水洗，再经“碱溶酸沉”纯化，即可得到纯度大于97％的5,6‑二甲酰肼荧光素产品，总产率20.4％，相比于文献方法(US 20180161460 A1)略有增加，但分离难度大大降低。
附图说明
[0020] 图1是实施例1合成的N‑甲基‑邻苯二甲酰亚胺‑4,5‑二羧酸的质谱图。
[0021] 图2是实施例1合成的N‑甲基‑5,6‑二甲酰亚胺基荧光素的质谱图。
[0022] 图3是实施例1合成的5,6‑二甲酰肼荧光素的质谱图。
具体实施方式
[0023] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明的保护范围不仅限于实施例。
[0024] 实施例1
[0025] 1、500mL圆底烧瓶中加入50.8g(0.2mol)均苯四甲酸、38mL(0.4mol)乙酸酐，140℃油浴加热回流2.5小时，停止加热，将反应混合物抽滤，滤饼用乙醚洗涤残留的乙酸酐及乙酸后，放入真空烘箱中40℃干燥2小时，得到32.2g白色或淡黄色结晶均苯四甲酸酐，收率73.9％，不经分离直接用于下一步合成。
[0026] 2、在250mL三口烧瓶中加入21.8g(0.1mol)均苯四甲酸酐及100mL(1.75mol)冰乙酸，缓慢滴加10.0mL(0.1mol)质量分数为40％的甲胺水溶液，滴加完毕后于常温条件下继续搅拌1小时，再将温度升至130℃继续反应2小时，减压蒸除溶剂，用去离子水洗涤至滤液呈中性后，50℃真空干燥至恒重，得到23.1g白色固体N‑甲基‑邻苯二甲酰亚胺‑4,5‑二羧+酸，收率92.7％，不经分离直接用于下一步合成。产物的表征数据为MS(ESI ):理论值m/z‑ ‑ ‑ ‑
[C11H6NO6]:248.0201[M‑H]，实测值m/z[C11H6NO6]:248.0190[M‑H]，见图1。
[0027] 3、向装有机械搅拌装置的三口烧瓶中加入11.2g(45.0mmol)N‑甲基‑邻苯二甲酰亚胺‑4,5‑二羧酸和9.9g(90.0mmol)间苯二酚，加热至120℃使之熔融，缓慢加入13.6g(100.0mmol)氯化锌，在150℃条件下剧烈搅拌混匀后，再将反应温度缓慢升高至180℃继续反应至混合物完全固化(不能被搅动为止)，冷却至室温，向反应混合物中加入150mL 0.6mol/L HCl水溶液回流1小时，趁热过滤，用热水充分洗涤滤饼至滤液呈中性后置于50℃真空烘箱中干燥，得到11.9g亮黄色固体N‑甲基‑5,6‑二甲酰亚胺基荧光素，收率为63.6％，+ + +
不经分离直接用于下一步合成。产物的表征数据为MS(ESI ):理论值m/z[C23H14NO7 ] :
+ + + +
416.0765[M+H]，实测值m/z[C23H14NO7]:416.0770[M+H]，见图1。
[0028] 4、在100mL圆底烧瓶中加入4.2g(10.0mmol)N‑甲基‑5,6‑二甲酰亚胺基荧光素、48.0mL质量分数为10％的水合肼水溶液，搅拌条件下加热回流反应3小时，将反应混合物中冷却至室温后，逐滴加入6mol/L HCl水溶液调节pH为3～4，静置，抽滤，滤饼用去离子水洗涤至滤液呈中性后，置于洁净烧杯中，加入120mL 0.5mol/L NaOH水溶液，充分搅拌溶解，抽滤，滤液用6mol/L HCl水溶液调节pH至5～6，立即析出大量沉淀，4℃冰箱中静置1小时，抽滤，滤饼置于50℃真空烘箱中干燥至恒重，得到1.95g橙黄色固体5,6‑二甲酰肼荧光素，产‑ ‑ ‑ ‑
率为46.8％。产物的表征数据为MS(ESI):m/z理论值[C22H11N2O7] :415.0572[M‑H] ，实测‑
值m/z＝415.0577[M‑H]，见图3。
