一种治疗阿尔茨海默病及引起认知障碍的相关疾病的药物

摘要

本发明提供了一种治疗阿尔茨海默病及引起认知障碍的相关疾病的药物，其包括一种式I所示生物碱及式I所示生物碱与二甲双胍的药物组合物。本发明的式I所示生物碱具备较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性，能改善小鼠认知功能障碍，提高小鼠学习记忆能力，预防AD小鼠脑内淀粉样蛋白沉积，减缓AD的发病进程；同时，能够促进自噬相关因子LC3I蛋白在脑组织中的表达，对双歧杆菌SHQ1生长促进作用明显。式I所示生物碱与二甲双胍的药物组合物的上述效果更为显著。

权利要求

1.式I所示生物碱，其结构式如下所示：

2.权利要求1中式I所示生物碱的制备方法，其包括如下步骤：将黄连药材粉碎后，用90％‑98％乙醇溶液回流提取，收集提取液，将滤渣用65％‑75％乙醇溶液提取，收集提取液，浓缩所得提取液至无醇味，合并浸膏，调节此浸膏pH至9.8‑

10.2，氯仿萃取，所得氯仿溶液经浓缩得到氯仿层，采用硅胶柱对所得氯仿层进行分离，其中，采用CH2Cl2/MeOH‑1％氨水体系梯度洗脱，所得流分经Sephadex LH‑20柱层析分离得到式I所示生物碱。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，90％‑98％乙醇溶液的体积与黄连的重量比为5‑8mL:1g；65％‑75％乙醇体积与黄连的重量比为5‑8mL:1g。

4.权利要求1中式I所示生物碱的制备方法，其包括如下步骤：(1)2‑(1,3‑苯并二氧杂环戊烯‑5‑基)乙胺和2,2‑二甲氧基乙醛在三氟乙酸作用下，反应生成中间体1；

(2)中间体1与4‑溴‑2,5‑二甲氧基苯甲醛，在三乙酰氧基硼氢化钠催化下在酸性条件下发生还原反应偶联成中间体2；

(3)中间体2利用三氟甲磺酸在有机溶剂中反应，获得中间体3；

(4)随后发生去甲氧基反应生成中间体4；

(5)中间体4与N,N‑二甲基甲酰胺和丁基锂经过醛基化反应，得到中间体5；

(6)中间体5经过脱甲基反应，得到中间体6；

(7)中间体6发生氧化反应环合得到式I所示生物碱；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，根据如下所示反应方程式制备：

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，

方法步骤(1)中，2‑(1,3‑苯并二氧杂环戊烯‑5‑基)乙胺和2,2‑二甲氧基乙醛的摩尔比为1:1.1～3；所述反应的温度为18～45℃，时间为0.5～3h；

方法步骤(2)中，中间体1与4‑溴‑2,5‑二甲氧基苯甲醛的摩尔比为1:1.1～2；反应的温度为102～171℃，时间为4～6h；反应在乙酸存在下进行；

方法步骤(3)中，中间体2与三氟甲磺酸的摩尔比为1:1.5～3.0；所述反应的温度为80～110℃，时间为2～4h；

方法步骤(4)中，所述去甲氧基反应在I2和乙酸钾存在下进行；中间体3与I2、乙酸钾的摩尔比依次为1：1.1‑1.5：1～20；所述反应的温度为100～140℃，时间为10～20h；

方法步骤(5)中，中间体4与N,N‑二甲基甲酰胺、丁基锂的摩尔比依次为1：1.2～2.5：

1.0‑1.5；所述反应的温度为80～110℃，时间为3～4h；

方法步骤(6)中，所述脱甲基反应在氯化铝与碘化钾存在下进行；中间体5与碘化钾、氯化铝的摩尔比依次为1：1～5.0：1.0‑1.2；反应温度为20～35℃，时间为2～3h；

方法步骤(7)中，所述氧化反应环合在UV下、对甲苯磺酸存在下进行；所述氧化反应环合的反应温度为150～200℃，时间为7～8h。

7.权利要求1中式I所示生物碱在制备防治阿尔茨海默病及引起认知障碍的相关疾病的药物中的应用。

说明书

一种治疗阿尔茨海默病及引起认知障碍的相关疾病的药物

技术领域

[0001] 本发明属于医药领域，涉及一种治疗阿尔茨海默病及引起认知障碍的相关疾病的药物，具体涉及一种新颖生物碱及其与二甲双胍的药物组合物，以及其在制备防治阿尔茨海默病及引起认知障碍的相关疾病的药物中的应用。

背景技术

[0002] 阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)，又称为原发性老年痴呆症，是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，以记忆功能障碍、语言功能下降、认知功能丧失为主要临床症状。AD病情会进行性加重，由最初的短期记忆障碍发展为痴呆，进而机体功能丧失，最终导致死亡。据统计，目前世界上AD患者已达到0.5亿人，占所有痴呆病例的50％～75％，且每3秒就会增加1人，到 2050年患AD的人数预计会增加3倍以上，而我国AD患者将达2800万。AD 患病人数的爆发式增长，给患者、家人、家庭以及社会带来沉重的负担和艰巨的挑战。

[0003] 小檗碱等生物碱类化合物具有显著抑制乙酰胆碱酯酶活性的功能，是治疗 AD最有前途的候选药物之一[Jiang Y,Gao H,Turdu G.Traditional Chinese medicinal herbs as potential AChE inhibitors for anti‑Alzheimer’s disease:A review. Bioorganic Chemistry 2017,75:50‑61.]。近年来一系列研究表明，生物碱类成分能够抑制病原菌生长，调节肠道菌群紊乱[Dey A,Bhattacharya R,Mukherjee A,Pandey DK.Natural products against Alzheimer’s disease: pharmaco‑therapeutics and biotechnological interventions.Biotechnology Advances 2017,35(2):178‑216.]。此外，通过考察300名糖尿病患者小檗碱和双歧杆菌联合用药效果发现，联合用药组患者降糖效果较单独小檗碱或单独双歧杆菌给药组显著，小檗碱可以促进双歧杆菌增殖，具有明显的协同增效作用[Ming J,Xu SY,Liu C,Liu XY,Jia AH,Ji QH.Effectiveness and safety of bifidobacteria and berberine in people with hyperglycemia:study protocol for a randomized controlled trial.Trials 2018,9:72.]。同时，小檗碱类生物碱能够促进双歧杆菌、乳酸杆菌等菌株的生长(P<0.01，增长率分别提高约40％及35％)，改善认知功能障碍[Hussain G,Rasul A,Anwar H,Aziz N,Razzaq A,Wei W,Ali M,Li J,Li  XM. Role of  plant derived alkaloids  and  their mechanism  in neurodegenerative disorders. International Journal of Biological Sciences 2018,14(3):341‑357；崔祥,陶金华, 江曙,魏晓燕,徐君,钱大玮,段金廒.黄连提取物与肠道菌群的相互作用研究. 中草药2018,49(9):2103‑2107]。小檗碱通过促进益生菌生长，调节患者的菌群平衡，改善肠道微生态的功能，逆转直肠癌、AD等疾病的发展[Kumar A,Thotakura PL,Tiwary BK,Krishna R.Target identification in Fusobacterium nucleatum by subtractive genomics approach and enrichment analysis of host‑pathogen protein‑protein interactions.BMC Microbiology 2016,16:84.]。小檗碱还能够同时进行靶向淀粉样蛋白沉积、Tau蛋白的过度磷酸化、自噬清除来减轻AD小鼠模型的认知功能下降，但其治疗AD的作用机制目前仍在积极的探索研究中[Chen Y,Chen YL,Liang YB,Chen HD,Ji XY,Huang M.Berberine mitigates cognitive decline in an Alzheimer's Disease Mouse Model by targeting both tau hyperphosphorylation and autophagic clearance.Biomedicine& Pharmacotherapy 2020,121:109670.]。

[0004] 2019年之前，全球范围内仅有5款以上述治疗机制研发的药物获FDA批准上市，包括他克林(副作用过大，如今已不用)、多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏和美金刚；中国研制用于治疗AD的天然药物石杉碱甲已在临床上应用，然而这些药物仅可以轻度改善患者的认知功能障碍，且效果都不明显，无法阻止或者延缓AD病情的进展。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于解决现有单一的小檗碱及其类似物或二甲双胍在临床疗效及治疗范围的不足，提供一种阿尔茨海默病及引起认知障碍的相关疾病治疗疗效优于单一化合物的新颖生物碱，以及该新颖生物碱与二甲双胍的药物组合物。

[0006] 一方面，本发明提供一种新颖生物碱。

[0007] 本发明所提供的新颖生物碱2‑羟基‑4‑甲氧基‑7,8‑二氢‑2H‑[1,3]二噁烷 [4,5‑g]噁丁并[2',3':5,6]异喹啉并[3,2‑a]异喹啉‑6‑鎓 (2‑hydroxy‑4‑methoxy‑7,8‑dihydro‑2H‑[1,3]dioxolo[4,5‑g]oxeto[2',3':5,6]isoquin olino[3,2‑a]isoquinolin‑6‑ium，DMQ)，其结构式如式I所示：

[0008]

[0009] 上述式I所示新颖生物碱可通过提取法制得：

[0010] 将黄连药材粉碎后，用90％‑98％(具体可为95％)乙醇溶液回流提取，收集提取液，将滤渣用65％‑75％(具体可为70％)乙醇溶液提取，收集提取液，浓缩所得提取液至无醇味，合并浸膏，调节此浸膏pH至9.8‑10.2(具体可为 10)，氯仿萃取，所得氯仿溶液经浓缩得到氯仿层，采用硅胶柱对所得氯仿层进行分离，其中，采用CH2Cl2/MeOH‑1％氨水体系(CH2Cl2与含1％体积氨水的甲醇的混合液)梯度洗脱(洗脱程序为：CH2Cl2‑MeOH 0‑30min体积比为15:1、 30min‑60min体积比为10:1、60min‑90min体积比为8:1、90min‑120min体积比为6:1、120min‑150min体积比为4:1、150min‑180min体积比为2:1和 180min‑210min体积比为1:1)，所得流分(第150‑210min的流出液)再经Sephadex LH‑20柱层析分离(以70％甲醇‑30％水混合溶液作为流动相，60min) 得到式I所示新颖生物碱。

[0011] 上述方法中，90％‑98％乙醇溶液的体积与黄连的重量比可为5‑8mL:1g，具体可为5mL:1g。

[0012] 所述回流提取可进行多次，具体可进行两次。

[0013] 65％‑75％乙醇体积与黄连的重量比可为5‑8mL:1g，具体可为5mL:1g。

[0014] 所述氯仿提取可进行多次，具体可进行三次。

[0015] 每次所用氯仿的体积为pH调节后体积的1.0‑1.2倍，具体可为1.0倍。经液相考察发现所得氯仿层生物碱成分种类较为丰富，微量成分均衡，故对氯仿层进行分离。

[0016] 式I所示新颖生物碱也可按照如下合成路线图通过包括如下步骤的方法制备得到：

[0017] (1)2‑(1,3‑苯并二氧杂环戊烯‑5‑基)乙胺和2,2‑二甲氧基乙醛在三氟乙酸作用下，反应生成中间体1；

[0018] (2)中间体1与4‑溴‑2,5‑二甲氧基苯甲醛，在三乙酰氧基硼氢化钠催化下在酸性条件下发生还原反应偶联成中间体2；

[0019] (3)中间体2利用三氟甲磺酸在有机溶剂中反应，获得中间体3；

[0020] (4)随后发生去甲氧基反应生成中间体4；

[0021] (5)中间体4与N,N‑二甲基甲酰胺和丁基锂经过醛基化反应，得到中间体5；

[0022] (6)中间体5经过脱甲基反应，得到中间体6；

[0023] (7)中间体6发生氧化反应环合得到式I所示新颖生物碱；

[0024]

[0025] 上述方法步骤(1)中，2‑(1,3‑苯并二氧杂环戊烯‑5‑基)乙胺和2,2‑二甲氧基乙醛的摩尔比可为1:1.1～3。

[0026] 所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂具体可为二氯甲烷。

[0027] 所述反应的温度可为18～45℃，时间可为0.5～3h。

[0028] 上述方法步骤(2)中，中间体1与4‑溴‑2,5‑二甲氧基苯甲醛的摩尔比可为1:1.1～2。

[0029] 反应的温度可为102～171℃，时间可为4～6h。

[0030] 反应在乙酸存在下进行。

[0031] 反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂具体可为甲醇。

[0032] 上述方法步骤(3)中，所述有机溶剂具体可为二氯甲烷。

[0033] 中间体2与三氟甲磺酸的摩尔比可为1:1.5～3.0。

[0034] 所述反应的温度可为80～110℃，时间可为2～4h。

[0035] 上述方法步骤(4)中，所述去甲氧基反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂具体可为乙醇。

[0036] 所述去甲氧基反应在I2和乙酸钾存在下进行。

[0037] 中间体3与I2、乙酸钾的摩尔比依次可为1：1.1‑1.5：1～20。

[0038] 所述反应的温度可为100～140应，时间可为10～20h。

[0039] 上述方法步骤(5)中，中间体4与N,N‑二甲基甲酰胺、丁基锂的摩尔比可依次为1：1.2～2.5：1.0‑1.5。

[0040] 所述反应的温度可为80～110应，时间可为3～4h。

[0041] 上述方法步骤(6)中，所述脱甲基反应在氯化铝与碘化钾存在下进行。

[0042] 中间体5与碘化钾、氯化铝的摩尔比依次可为1：1～5.0：1.0‑1.2。

[0043] 反应温度可为20～35℃，时间可为2～3h。

[0044] 上述方法步骤(7)中，所述氧化反应环合在UV下、对甲苯磺酸存在下进行。

[0045] 所述氧化反应环合的反应温度可为150～200℃，时间可为7～8h。

[0046] 式I所示新颖生物碱在制备防治阿尔茨海默病及引起认知障碍的相关疾病的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

[0047] 另一方面，本发明提供一种以式I所示新颖生物碱为活性成分的药物组合物。

[0048] 所述药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体、辅剂。

[0049] 此外，本发明还提供一种以式I所示新颖生物碱和二甲双胍为活性成分的药物组合物。该组合物与单一药物相比，能够使得小鼠实验潜伏期明显缩短，穿越平台次数与象限内游泳时间明显延长，显著改善了小鼠的学习记忆能力，同时能降低AD小鼠脑内淀粉样蛋白沉积；能够进一步促进自噬相关因子LC3I 蛋白在脑组织中的表达；对双歧杆菌SHQ1生长促进作用明显。实验结果表明：式I所示新颖生物碱和二甲双胍经组合后可以产生协同增效作用，可用于制备防治阿尔茨海默病及引起认知障碍的相关疾病的药物。

[0050] 本发明所提供的药物组合物，式I所示新颖生物碱与二甲双胍的重量比为1:0.1至1:20，优选为1:0.1、1:0.5、1:1.0、1:1.2、1:1.5、1:1.8、1:2.0、1:3.0、1:4.0、1:5.0、1:
10.0、1:20.0，更优选为1:1.2或1:1.5。

[0051] 上述药物组合物在制备防治阿尔茨海默病及引起认知障碍的相关疾病的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

[0052] 有益效果

[0053] 本发明的式I所示新颖生物碱具备较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其药效优于小檗碱和阳性药加兰他敏。小鼠试验表明，式I所示新颖生物碱、式I所示新颖生物碱与二甲双胍组合物均能改善小鼠认知功能障碍，提高小鼠学习记忆能力，预防AD小鼠脑内淀粉样蛋白沉积，减缓AD的发病进程；同时，式 I所示新颖生物碱、式I所示新颖生物碱与二甲双胍组合物还能够促进自噬相关因子LC3I蛋白在脑组织中的表达，组合物促进表达的作用更为显著。另外，式I所示新颖生物碱、式I所示新颖生物碱与二甲双胍组合物对双歧杆菌SHQ1 生长促进作用明显，药物组合物较单一新颖生物碱促进作用更为显著。机制研究表明，式I所示新颖生物碱、式I所示新颖生物碱与二甲双胍组合物是通过作用于鸟嘌呤、尿苷酸、12‑氧代植物二烯酸、哌啶酸等代谢物调控组氨酸代谢通路、核黄素代谢通路、烟酸盐及烟酰胺代谢通路达到改善AD小鼠认知功能障碍。

[0054] 总之，本发明式I所示新颖生物碱、式I所示新颖生物碱与二甲双胍组合物能够用于治疗阿尔茨海默病及引起认知障碍的相关疾病，组合物之间存在协同增效，具备良好应用前景。

附图说明

[0055] 图1为新颖生物碱的合成路线图。

[0056] 图2为DMQ的1H‑NMR谱(400MHz,甲醇‑d4)。

[0057] 图3为DMQ的13C‑NMR谱(100MHz,甲醇‑d4)。

[0058] 图4为DMQ的DEPT135谱(100MHz,甲醇‑d4)。

[0059] 图5为DMQ的DEPT90谱(100MHz,甲醇‑d4)。

[0060] 图6为DMQ的1H‑1HCOSY谱(400MHz,甲醇‑d4)。

[0061] 图7为DMQ的HMBC谱(400MHz,甲醇‑d4)。

[0062] 图8为DMQ的HSQC谱(400MHz,甲醇‑d4)。

[0063] 图9为DMQ的HR‑ESI(+)‑MS谱。

[0064] 图10为DMQ的IR谱。

[0065] 图11为DMQ的AChE抑制活性实验结果图。

[0066] 图12为各组小鼠Barnes迷宫潜伏期时间统计图(n＝8，DMQ组(新颖生物碱)；MET组(二甲双胍)；DMQ+MET组(新颖生物碱与二甲双胍组合物))。与Model相比，**P<0.01，***P<0.001。

[0067] 图13为各组小鼠Barnes迷宫目标象限百分比统计图(n＝8，DMQ组(新颖生物碱)；MET组(二甲双胍)；DMQ+MET组(新颖生物碱与二甲双胍组合物))。与Model组相比，**P<
0.01，***P<0.001。

[0068] 图14为各组小鼠Barnes迷宫路线图。

[0069] 图15为各组小鼠脑石蜡切片刚果红染色图(a .Control组；b  .Model组；c  .DMQ组(新颖生物碱)；d .MET组(二甲双胍)；e .DMQ+MET组(新颖生物碱与二甲双胍组合物))。

[0070] 图16为LC3I在不同组别小鼠脑组织中的蛋白表达水平。与Control组比较，*P<##0.05，**P<0.01；与Model组比较，P<0.01。

[0071] 图17为单一给药新颖生物碱及药物组合物给药后双歧杆菌SHQ1培养24h 的OD600nm值。

[0072] 图18为代谢通路分析示意图。

具体实施方式

[0073] 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

[0074] 实施例1、式I所示化合物的制备

[0075] 1.1从黄连中提取DMQ：

[0076] 将黄连药材粉碎后，用5倍体积的95(体积比)％乙醇溶液回流提取两次，收集提取液，将滤渣用70(体积比)％乙醇溶液提取一次，收集提取液，浓缩所得提取液至无醇味，合并浸膏，调节此浸膏pH至10，氯仿萃取，所得氯仿溶液经浓缩得到氯仿层，采用硅胶柱对所得氯仿层进行分离，其中，采用 CH2Cl2/MeOH‑1％氨水体系(CH2Cl2与含1％体积氨水的甲醇的混合液)进行梯度洗脱，洗脱程序为：CH2Cl2‑MeOH 0‑30min体积比为15:1、30min‑60min体积比为10:1、60min‑90min体积比为8:1、90min‑120min体积比为6:1、 120min‑150min体积比为4:1、150min‑180min体积比为2:1和180min‑210min 体积比为1:1)，所得流分(第150‑210min的流出液)再经Sephadex LH‑20 柱层析分离(以70％甲醇‑30％水混合溶液洗脱，
60min)得到式I所示新颖生物碱。

[0077] 1.2参照图1所示的合成路线图制备式I所示化合物(DMQ)。

[0078] (1)2‑(1,3‑苯并二氧杂环戊烯‑5‑基)乙胺和2,2‑二甲氧基乙醛以摩尔比 1:1.1混合在二氯甲烷中在三氟乙酸作用下，30℃下反应2.5h生成中间体1；

[0079] (2)中间体1与4‑溴‑2,5‑二甲氧基苯甲醛以摩尔比1:1.1混合在甲醇中，乙酸存在下在三乙酰氧基硼氢化钠催化下于150℃偶联反应6h生成中间体2；

[0080] (3)在二氯甲烷中，中间体2与三氟甲磺酸以摩尔比1:2混合，在100℃温度下反应4h，获得中间体3；

[0081] (4)在乙醇中，中间体3在I2和乙酸钾存在发生去甲氧基反应(120℃下反应18h)生成中间体4；其中，中间体3与I2、乙酸钾的摩尔比依次为1：1.2： 10；

[0082] (5)中间体4与二甲基甲酰胺和丁基锂以摩尔比1：2.0：1.2混合，在100℃下醛基化反应4h，得到中间体5；

[0083] (6)中间体5在氯化铝与碘化钾存在下进行脱甲基反应(30℃下反应2.5h)，其中中间体5与碘化钾、氯化铝的摩尔比依次为1：4.0：1.1，得到中间体6；

[0084] (7)UV照射下，对甲苯磺酸存在下中间体6发生氧化反应环合，反应温度180℃，时间7h，得到式I所示新颖生物碱。

[0085] 所述产物的1H NMR数据和13C NMR数据如表1和表2所示：

[0086] 表1：DMQ的1H NMR数据(400MHz,Methanol‑d4,δin ppm,J in Hz)

[0087]

[0088] 表2：DMQ的13C NMR数据(100MHz,Methanol‑d4,δin ppm)

[0089]

[0090]

[0091] 图2‑10为所得化合物的结构确证数据。

[0092] 化合物的结构解析为：

[0093]

[0094] 实施例2、式I所示化合物抑制AChE水解的活性研究

[0095] AChE抑制活性

[0096] AChE(EC3.1.1.7)属于/水解酶折叠蛋白超家族，该家族中还包括与其高度同源的丁酞胆碱酷酶、梭酸醋酶和脂肪酶等。阿尔茨海默病(AD)的一个主要发病原因是乙酰胆碱水平不足，现在临床应用的多种AChE抑制剂，它们通过抑制ACh水解来提高突触间的ACh浓度，减轻AD患者的症状，提高患者的学习记忆能力和认知水平。

[0097] 溶液制备

[0098] ATCI(碘化硫代乙酰胆碱)溶液：将28.9mg ATCI加50mL去离子水配成2mM的ATCI溶液。

[0099] Tris溶液：称取Tris适量，加入去离子水配制浓度为30mM溶液，调节 pH约为8.0。

[0100] DTNB(5,5'‑二硫代双(2‑硝基苯甲酸))溶液：将6mg DTNB溶于50mL 的Tris溶液中，配成0.3mM的DTNB溶液。

[0101] AChE(乙酰胆碱酯酶)溶液：AChE加入Tris溶液成2U/mL的AChE溶液。

[0102] 式I所示化合物溶液制备：称取式I所示化合物适量，加入DMSO配制成浓度为2mM的待测药储备液。

[0103] 小檗碱溶液制备：称取小檗碱适量，加入DMSO配制成浓度为2mM的小檗碱储备液。

[0104] 阳性对照溶液制备：称取阳性药加兰他敏适量，加入DMSO配制成浓度为2mM的阳性药储备液。

[0105] 实验方法

[0106] 将DTNB溶液和AChE溶液以176.5:2.5比例混合，在96孔板中每孔加入 179μL上述混合液，再加入1μL待测样品储备液(每个化合物，平行测定3次)，放置5min后加入20μL的ATCI溶液，反应体系中酶的终浓度为0.025U/mL，化合物终浓度为10μM。

[0107] 避光放入酶标仪中，震荡10s后，在吸收波长405nm下，每隔1min测定一次吸光度，共测定10min。

[0108] 将每个待测化合物的时间作为横坐标，吸光度作为纵坐标，进行线性拟合。计算相应的斜率。斜率大小体现反应的速率，即酶活性。化合物的活性用抑制率表示，抑制率值越高，活性越好。具体公式如下：

[0109] 抑制率(％)＝[1‑(10次的吸光度与时间获得斜率求平均值‑DMSO空白对照的斜率)]×100％

[0110] 实验结果见图11。

[0111] 由图11可知：式I所示新颖生物碱具有较强的抑制乙酰胆碱酯酶的活性，且此抑制活性较阳性药加兰他敏和小檗碱更为显著。

[0112] 实施例3、治疗AD的药效学研究

[0113] 一、实验材料和方法。

[0114] 1、实验药物及试剂

[0115] 6月龄APPswe/PS1且此抑小鼠，SPF级，40只，购置于南京君科生物工程有限公司，动物饲养于哈尔滨医科大学药学院。

[0116] 2、组合物的制备方法：

[0117] 组合物中含新颖生物碱与二甲双胍的重量比例为1:1.2。

[0118] 3、实验方法

[0119] (1)动物分组及给药剂量：将APPswe/PS1小鼠喂养一周后，实验共分为 5组：A.Control组；B.Model组；C.DMQ组(新颖生物碱)；D.MET组(二甲双胍)；E.DMQ+MET组(新颖生物碱与二甲双胍组合物，两者的重量比为1:1.2)。每日灌胃给药1次(每日给药一次，新颖生物碱每次给药剂量10mg/kg 小鼠体重，二甲双胍为12mg/kg小鼠体重，Control组和Model组给予同等体积生理盐水)，连续给药6周。

[0120] (2)行为学检测：在给药6周后进行Barnes迷宫实验。

[0121] 应用Barnes迷宫法对实验组小鼠进行了空间学习和记忆功能测试。Barnes 迷宫是根据实验小鼠“喜暗避明”的习性而设计的，在规定的时间里，通过一些外部刺激使其找到暗箱中的相应孔洞。整个试验分为两个阶段，分别是训练阶段和测验阶段，在经过一段时间的连续训练后，记录其进入暗箱的总路程、速度、时间，以及进入错误洞口的次数从而达到对其的空间参考记忆能力进行考察。实验所需要注意的事项在于：要保证每次实验过后洞口分布的随机性以及连续两天迷宫位置不同，但在这过程中目标箱位置的位置不可不改变。当动物在洞口徘徊，头部伸入洞内时，实验小鼠的眼睛应低于平台边缘以判断逃生错误。

[0122] (3)样本的收集与制备

[0123] a.收集最后一次给药的各组小鼠0～24h的粪便样品，处死小鼠，断头剥离脑组织。

[0124] b.粪便自然风干，取0.5g研磨成粉末；脑组织匀浆后取0.1g。粪便用10 mL和2mL的甲醇超声提取30min，提取后离心取上清液，氮气吹干，用200 μL甲醇复溶，经0.22μm微孔滤膜过滤。将粪便样本于‑80℃下冻存。

[0125] c.取冻存的粪便样本，加5倍量的生理盐水(w/v)置冰上进行组织匀浆， 4℃、13000rpm离心15min，吸取上清80μL，加240μL预冷的甲醇，涡旋振荡1min，置冰上静置20min后于4℃、12000rpm离心15min，吸取上清 150μL于进样小瓶。此外，精密吸取上述制备的粪便样品10μL获得粪便QC 样品。

[0126] (4)病理学检测

[0127] 刚果红染色：将海马组织用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，脱水，冰冻切片机制作3.5μm切片1张，后进行刚果红染色，观察小鼠脑组织形态表现及血管淀粉样物质沉积。

[0128] 二、实验结果：

[0129] 式I所示新颖生物碱和药物组合物能够改善AD小鼠学习记忆能力的药理作用，如图12所示，与Control组相比，Model组小鼠实验潜伏期相较对照组小鼠明显加长，新颖生物碱组小鼠实验潜伏期较Model组小鼠明显缩短，MET 组小鼠实验潜伏期较Model组小鼠变化不明显，而组合物组小鼠实验潜伏期较 Model组小鼠进一步缩短。图13显示Model组小鼠目标象限百分比明显降低，相较之下新颖生物碱组小鼠及药物组合物组小鼠目标象限百分比均提升，小鼠认知功能障碍明显改善，而MET组小鼠目标象限百分比提升程度相对较低。图14中新颖生物碱组小鼠及药物组合物组小鼠的迷宫路线图相较Model组小鼠简单，表明小鼠学习记忆能力有所提高。

[0130] 图15可见Model组小鼠脑内出现轻微红色淀粉样斑块沉积，新颖生物碱组小鼠及药物组合物组小鼠小鼠脑内纤维化板块均为阴性，表明二者可预防 AD小鼠脑内淀粉样蛋白沉积，从而减缓AD的发病进程。

[0131] 实施例4、对神经细胞自噬的影响

[0132] 一、实验材料和方法。

[0133] 1、实验药物及试剂

[0134] 新生无菌APPswe/PS1小鼠，SPF级，32只，购置于南京君科生物工程有限公司，动物饲养于哈尔滨医科大学药学院。

[0135] 2、组合物的制备方法：

[0136] 组合物中新颖生物碱与二甲双胍的重量比例为1:1.2。

[0137] 3、实验方法

[0138] (1)动物分组及给药剂量：将APPswe/PS1小鼠喂养一周后，实验共分为 4组：A.Control组；B.Model组；C.DMQ组(新颖生物碱)；D.DMQ+MET 组(新颖生物碱与二甲双胍组合物，两者的重量比为1:1.2)。每日灌胃给药1 次(每日给药一次，新颖生物碱每次给药剂量10mg/kg小鼠体重，二甲双胍为 12mg/kg小鼠体重，Control组和Model组给予同等体积生理盐水)，连续给药6周。

[0139] (2)对神经细胞自噬的影响

[0140] a.原代神经细胞模型：将小鼠麻醉，断头剥离脑组织，切取两侧的皮层海马区，彻底除去脑膜及血管组织，胰酶消化，反复吹打，静置3min，取上清悬液过膜除去未分离的组织块，1000rpm离心5min，弃去上清。加入终止液，重悬，1000rpm离心5min，弃上清，反复两5
次。以5×10 个/mL密度种植于培养瓶中。每3d更换培养液，培养至第2～3代后，进行后续实验。

[0141] b.Western Blot：提取细胞和组织样品总蛋白，加入蛋白质上样缓冲液和 RIPA细胞裂解液稀释后100℃变性5min。蛋白样品采用SDS‑PAGE进行分离，并转移到PVDF膜上。5％牛奶室温封闭2h，室温孵育一抗2h，用TBS‑T 缓冲液洗膜3次，然后用红外荧光染料标记的二抗孵育膜1h。应用双色红外荧光成像系统检测蛋白表达情况，计算各样品目的条带与β‑actin的相对灰度值。

[0142] 二、实验结果

[0143] 通过比较Control组、Model组、DMQ组、DMQ+MET组小鼠(n＝8)给药6周后脑组织中LC3I的表达情况，结果发现：与Control组小鼠相比，新颖生物碱、新颖生物碱与二甲双胍组合物能够促进自噬相关因子LC3I蛋白在脑组织中的表达，药物组合物促进其表达的作用更为显著(图16)。

[0144] 实施例5、对双歧杆菌SHQ1生长的影响

[0145] 一、实验方法：

[0146] (1)培养基、稀释液及给药溶液的配制：

[0147] 培养基的制备：牛肉膏0.3g，蛋白胨l g，葡萄糖1g，氯化钠0.5g，半胱氨酸盐酸盐0.04g，水100mL，pH值调至7.0，分装，115℃灭菌15min。

[0148] ②稀释液的配制：磷酸二氢钾4.5g，磷酸氢二钠6g，半胱氨酸盐酸盐0.5 g，吐温‑80 0.5mL，蒸馏水l000 mL，琼脂1g，分装，221℃灭菌20min。

[0149] ③新颖生物碱及组合物溶液的制备：将药物用双蒸水配制溶解，115℃灭菌15min。在体外厌氧条件下，将双歧杆菌SHQ1按0.1％接种量接种于斜面培养基，培养5d后，传代于新的斜面，培养72h。分别添加不同浓度给药组溶液(0.5mg/mL，1.0mg/mL，2.0mg/mL)，用稀释液稀释10倍，对照组为空白培养基。每组设三个复孔，应用全自动生长曲线分析仪在波长
600nm处间隔2h测定一次OD值，绘制生长曲线，计算比生长速率。

[0150] 二、实验结果

[0151] 如图17所示，前期将双歧杆菌SHQ1菌种体外培养，分别加入新颖生物碱及组合物培养24h后进行比较，结果发现新颖生物碱及组合物对双歧杆菌 SHQ1生长促进作用明显(P<0.01)，药物组合物较单一新颖生物碱促进作用更为显著(P<0.01)。

[0152] 实施例6、治疗阿尔茨海默病的作用机制

[0153] 一、实验方法：

[0154] a.检测方法：色谱柱为ACQUITY CSHTM C18(2.1mm×100mm, 1.7μm)，流动相A为0.1％甲酸溶液(v/v)，流动相B为乙腈，洗脱梯度如下：0‑3min，1％流动相B；4‑7min，15％流动相B；8‑15min，45％流动相B； 16‑24min，60％流动相B；25‑39min，70％流动相B；
30‑31min，100％流动相 B；32‑35min，1％流动相B。进样量5μL，流速0.3mL/min，柱温40℃。
粪便样品(实施例3中3(3)中收集的粪便样品)进样量为5μL，将空白组、模型组、给药组(DMQ组)这3组所得样品，每个样品取10μL混合制得质控样品，从中选择3个不同极性的离子进行方法学评价，提取它们的峰面积及保留时间进行方法学验证。取质控样品连续进样分析，来检测分析方法的重复性。为确保系统的稳定性和重复性，在分析序列中，每3个样本加入1个QC样本，总共进样4次。

[0155] 利用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪收集粪便样本，采用加热电喷雾电离 (heated electrospray ionization,HESI)方法，正负离子转换采集模式，扫描方式Full 2
Scan/dd‑MS；喷雾电压正负极分别为3.5KV，2.5KV；毛细管温度为 325℃；鞘气体积流量为
2
流速50arb；辅助气体积流量为10arb；分辨率为120 000；采集范围为m/z:100‑800；HRMS强
4 2
度阈值为2.0×10 ；HRMS扫描高能碰撞解离为20％、35％、50％，分辨率为30000；碰撞诱导解离为15％、30％、 45％，分辨率为30000。

[0156] b.数据分析处理：将质谱原始数据导入Compound Discoverer 3.0软件，选择“untargeted metabolomics workflows”模块对原始数据进行降噪、峰识别、匹配及归一化处理，相关参数设置如下：mass tolerance为5ppm，maximum shift 为0.2min，minimum intensity为1000000，将生成的包含质荷比、保留时间和峰面积的二维数据矩阵导入SIMCA 14.0软件进行多元变量数据统计分析，包括主成分分析(Principal ComponentAnalysis，PCA)、正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal Partial Least Squares‑Discriminant Analysis，OPLS‑DA)，基于OPLS‑DA，筛选VIP>1且t检验p<0.05，并满足以下两个条件的变量：第一，该代谢物是Control组与Model组间差异性代谢物；第二，在DMQ组中经DMQ 治疗后与Model组相比该代谢物被显著回调。采用Compound Discoverer 3.0 软件的“untargeted metabolomics workflows”模块通过检索mz Cloud、ChemSpider等数据库对上述筛选的变量进行鉴定。采用Metaboanalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/)对各样本差异代谢物进行通路分析，筛选 pathway impact>0.1的通路为该新颖生物碱治疗阿尔茨海默病的相关通路。

[0157] 二、实验结果

[0158] 如表3所示，最终从S‑plot图中筛选出了10个VIP>1且p<0.05潜在生物标志物：鸟嘌呤、腺嘌呤、尿苷酸、异烟酸甲酯、哌啶酸、12‑氧代植物二烯酸、硬脂酰胺、水解伏马菌素B1、2'‑脱氧腺苷等。

[0159] 表3标志物筛选

[0160]

[0161] 如图18、表4所示，Metaboanalyst 5.0筛选结果有核黄素代谢通路、组氨酸代谢通路、烟酸盐和烟酰胺代谢通路，揭示该新颖生物碱可能作用于这3种代谢通路来治疗AD。

[0162] 表4代谢通路

[0163]

[0164]

[0165] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。