一种银鲳肝脏细胞系及其应用转让专利
申请号 : CN202210969223.3
文献号 : CN115094028B
文献日 : 2023-05-23
发明人 : 蒋欢 , 王亚军 , 张友仪 , 王冠林 , 王想兵
申请人 : 宁波大学
摘要 :
本发明提供一种银鲳肝脏细胞系及其应用，所提供的细胞系的保藏编号为CCTCC NO:C202261。本发明的银鲳肝脏细胞系细胞性状优良，可连续传代，通过传代能够提供大量的银鲳肝脏细胞系；本发明的银鲳肝脏细胞系的构建方法重复性强、构建的细胞系稳定性好。本发明的银鲳肝脏细胞系易感染虹彩病毒、高效表达外源基因，同时适用于脂多糖和棕榈酸对肝脏细胞产生影响的体外研究。
权利要求 :
1. 一种银鲳肝脏细胞系，其特征在于，所述的银鲳肝脏细胞系的保藏编号为CCTCC NO:C202261。
2.权利要求1所述的银鲳肝脏细胞系在研究虹彩病毒逃逸宿主细胞免疫反应机制中的应用。
3.权利要求1所述的银鲳肝脏细胞系在研究脂多糖和棕榈酸对银鲳肝脏影响中的应用。
说明书 :
一种银鲳肝脏细胞系及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于海水鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一种银鲳肝脏细胞系及其应用。
背景技术
[0002] 鱼类的细胞系被广泛认为是研究水产养殖包括鱼类生长、疾病、繁殖、遗传学和生物技术等许多关键问题的重要工具。自1962年建立第一个鱼类细胞系RTG‑2以来，已经从不同类型的鱼类组织样本包括鳃、鳍、眼、肝和肾等建立了约880多个鱼类细胞株。基于肝脏在硬骨鱼类中的关键作用，首次分离肝脏细胞用于金鱼细胞中激素刺激的糖原分解研究；来自黄鳍鲷(Acanthopagrus latus)肝脏的ALL细胞系用于研究对三种主要鱼类病毒敏感时先天免疫基因的表达；石斑鱼(Epinephelus awoara)的肝脏GL细胞系用于石斑鱼虹彩病毒的繁殖，并研究了从该细胞系分离的病毒特性。此外，对巨石斑鱼(Epinephelus tauvina)肝脏细胞系GL‑av进行了基因修饰，以评估抗凋亡蛋白Bcl‑xL的有效性；来源于虹鳟肝脏的RTH‑149细胞系用于解读与鱼类营养相关的分子机制。简言之，大量研究表明肝脏细胞系是研究鱼类营养和代谢以及免疫调节基因的重要工具。
[0003] 银鲳(Pampus argenteus)是一种高价值的海洋经济鱼类，广泛分布在东南亚和中东的沿海海域。由于银鲳适合在海洋网箱和室内水池中养殖，银鲳的人工繁育和养殖技术已经标准化。然而，由细菌性、病毒性或寄生虫等病原引起的病害日益频繁爆发，已成为了制约银鲳产业化的主要因素之一。因此，迫切需要具有稳定性状的体外细胞系工具来研究银鲳养殖过程中病原体逃逸宿主免疫反应的机制。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种银鲳肝脏细胞系及其应用，所提供的细胞系能够用于研究银鲳养殖过程中病原体逃逸宿主免疫反应的机制。
[0005] 本发明首先提供一种增殖快且稳定的银鲳肝脏细胞系PaL，于2022年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO:C202261。
[0006] 本发明所提供的银鲳肝脏细胞系PaL的构建方法如下：
[0007] 1)原代培养：无菌条件下获取银鲳幼鱼肝脏组织，置于添加双抗(青霉素和链霉素)的基础培养基中，用含1％双抗的无菌D‑hanks漂洗和清理肝脏组织上的附着物，移入含细胞培养液的离心管中用剪刀剪成小块，离心后取上清，加入胰蛋白酶室温消化30分钟后加入等体积的完全培养基终止消化，而后全部转移到100目细胞筛过滤，滤液离心弃上清，加入完全培养基重悬细胞，最后将悬液转至培养瓶中于22±0.2℃培养箱正置培养；
[0008] 2)传代培养：待原代培养组织块周围细胞迁出并增殖至形成单层细胞时，加入0.25％胰蛋白酶消化液使细胞悬起，而后利用完全培养基进行传代培养，待原瓶传代细胞长满瓶底后，以1：1或1：2分瓶传代，之后3‑4天传代一次。传至10代之后，传代所用0.25％胰蛋白酶替换为重组酶。
[0009] 本发明所提供的银鲳肝脏细胞系PaL在研究银鲳养殖过程中病原体逃逸宿主免疫反应的机制中的用途；
[0010] 所述的病原，作为实施例的一种具体记载，为虹彩病毒；
[0011] 本发明所提供的银鲳肝脏细胞系PaL还用于研究脂多糖和棕榈酸对肝脏细胞的影响。
[0012] 本发明的有益效果如下：
[0013] 1、本发明的银鲳肝脏细胞系细胞性状优良，可连续传代，通过传代能够提供大量的银鲳肝脏细胞系；
[0014] 2、本发明的银鲳肝脏细胞系的构建方法重复性强、构建的细胞系稳定性好；
[0015] 3、本发明的银鲳肝脏细胞系易感染虹彩病毒、高效表达外源基因，同时适用于脂多糖和棕榈酸对肝脏细胞产生影响的体外研究。
附图说明
[0016] 图1为本发明的银鲳肝脏细胞系在不同时期拍摄的显微镜照片(a)原代细胞，T表示组织块，(b)第10代，(c)第70代，(d)冷冻保存2个月后复苏，显示为第7次传代细胞；
[0017] 图2为本发明的银鲳肝脏细胞系细胞来源Cyt b基因PCR扩增产物电泳图。DNA Maker(2000bp；M)，PaL细胞(泳道1)和肝脏组织(泳道2)；
[0018] 图3为本发明的银鲳肝脏细胞系传代培养FBS浓度和温度对PaL细胞增殖的影响；
[0019] 图4为本发明的银鲳肝脏细胞系传代培养FBS浓度和温度对PaL细胞活性的影响；
[0020] 图5为本发明的银鲳肝脏细胞系第35代PaL细胞的染色体分析；
[0021] 图6为本发明的银鲳肝脏细胞系在不同转染体系的pEGFP‑N3细胞中的表达，TMpEGFP‑N3 amount:P3000 Reagent＝1:1,1:2,and 1:3。a、b、c是明场照片；d、e、f是暗场显微照片；
[0022] 图7为本发明的银鲳肝脏细胞系对RSIV的病毒敏感性。(a)对照细胞，(b)感染RSIV 48小时后的细胞，(c)PCR产物以检测RSIV在细胞的复制。DNA标记(2000bp；M)、对照细胞(泳道1)、感染组织(泳道2)和感染细胞(泳道3)，(d)PaL细胞的RSIV滴度使用Reed–Muench方法‑△△CT
计算。(e‑f)RSIV感染后24小时PaL细胞中免疫相关基因的表达分析(MOI＝1)。根据2法，β‑actin用作内参，数值为平均值±SEM(n＝3)。星号表示RSIV感染后24小时和48小时之间存在显著差异(*p<0.05，**p<0.01)。
计算。(e‑f)RSIV感染后24小时PaL细胞中免疫相关基因的表达分析(MOI＝1)。根据2法，β‑actin用作内参，数值为平均值±SEM(n＝3)。星号表示RSIV感染后24小时和48小时之间存在显著差异(*p<0.05，**p<0.01)。
[0023] 图8为LPS对银鲳肝脏细胞系的影响。(a)CCK‑8测定细胞活力，(b‑e)LPS孵育后免‑△△CT疫相关基因的相对表达水平；根据2 法，β‑actin用作内参，数值为平均值±SEM(n＝3)。
没有共同上标字母的值表示显著性不同(P<0.05，Tukey检验)。
没有共同上标字母的值表示显著性不同(P<0.05，Tukey检验)。
[0024] 图9为不同时间LPS处理后银鲳肝脏细胞系免疫基因TLR5和TLR9基因的相对表达‑△△CT水平；根据2 法，β‑actin用作内参，数值为平均值±SEM(n＝3)。没有共同上标字母的值表示显著性不同(P<0.05，Tukey检验)。
[0025] 图10为棕榈酸PA孵育24小时后对银鲳肝脏细胞系细胞凋亡的影响。(a)Annexin V‑FITC/PI染色检测细胞凋亡，(b)CCK‑8测定评估细胞活力，没有共同上标字母的值表示显‑△△CT著性不同(P<0.05，Tukey检验)，(c)凋亡相关基因的表达，根据2 法，β‑actin用作内参，数值为平均值±SEM(n＝3)。星号表示组间存在显著差异(*p<0.05，
[0026] **p<0.01)。
[0027] 图11为棕榈酸PA孵育24小时后对银鲳肝脏细胞系炎症反应的影响。(a)LPS处理后TLR/MyD88/NF‑κB信号通路关键成分的基因的相对表达水平，(b)参与炎症反应的炎性细胞‑△△CT因子基因的相对表达水平。根据2 法，β‑actin用作内参，数值为平均值±SEM(n＝3)。星号表示组间存在显著差异(*p<0.05，**p<0.01)。
具体实施方式
[0028] 本发明构建了银鲳肝脏细胞系，所筛选并保存的细胞系能应用于病毒学和基因表达研究。实验结果表明该细胞系是一种适合用于不同生物技术应用的体外系统的工具。
[0029] 本发明所提供的银鲳肝脏细胞系的构建方法如下：
[0030] 1)原代培养：原代培养：无菌条件下获取银鲳幼鱼肝脏组织，置于添加双抗的Leibovitz's L15 Medium(L‑15)培养液中，用含1％双抗(青霉素和链霉素)的无菌D‑hanks漂洗和清理肝脏组织上的附着物，移入含基础培养基的离心管中用剪刀剪成小块，离心后取上清，加入胰蛋白酶室温消化后加入等体积的完全培养基终止消化，而后全部转移到100目细胞筛过滤，离心后弃上清，加入完全培养基重悬细胞，最后将悬液转至培养瓶中于22±0.2℃培养箱正置培养；
[0031] 2)传代培养：待原代培养组织块周围细胞迁出并增殖至形成单层细胞时，经含1％双抗的D‑hanks溶液轻轻漂洗后移除，再加入0.25％胰蛋白酶消化液使细胞悬起，而后加入完全培养基进行传代培养并加入10ng/mL的碱性成纤维样生长因子，待原瓶传代细胞长满瓶底后，以1：1或1：2分瓶传代，之后3‑4天传代一次。传至10代之后，传代所用0.25％胰蛋白酶替换为重组酶。
[0032] 本发明所提供的银鲳肝脏细胞系应用包括易感染虹彩病毒、高效表达外源基因的应用，同时适用于脂多糖和棕榈酸对肝脏细胞产生影响的体外研究。
[0033] 下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
[0034] 实施例1：构建银鲳肝脏细胞系
[0035] 1)原代培养：将来自中国宁波象山港湾水产苗种公司繁育的全人工F4代体重约30g的银鲳幼鱼浸泡在含有75mg/L的MS‑222海水中进行麻醉，直至鱼体翻转，腹部朝上，对刺激物应激行为为止。以灭菌纱布块擦除鱼体表面粘液，浸有酒精的棉球擦拭鱼体表面后，用无菌剪刀取出肝脏组织放入75％酒精中浸泡漂洗3分钟。在无菌超净台内用含2％双抗的无菌D‑hanks溶液漂洗清理2次组织上的附着物，而后放入含有2％双抗的L‑15基础培养基，
3
用外科剪刀剪碎成约1mm 小块，室温静置沉淀3分钟之后1000rpm离心2分钟，弃去上清，加入3mL0.25％胰蛋白酶(0.25％Trypsin‑EDTA(1X)，PhenolRed，gibco，加拿大)，室温消化30分钟。加入等体积的完全培养基终止消化。经过胰蛋白酶消化过地组织块转移到100目细胞筛(Solarbio，中国)过滤后加入完全培养基1000rpm离心5分钟，弃去上清，加入3mL的L‑15
2
完全培养基重悬沉淀后转移到25cm 的培养瓶(Corning，美国)，将培养瓶放入22℃培养箱培养24小时后观察细胞状态，是否贴壁，在贴壁48小时依据贴壁情况用D‑hanks漂洗液稍微漂洗后换去50％的完全培养基培养，保留1‑3块组织块继续培养。当原代细胞培养到90％～
100％融合时，按1:2标准进行传代。如图1a所示，银鲳肝脏组织启动原代培养后贴壁细胞迁徙出组织块，在进行原代培养传代10次后，肝脏细胞呈现成纤维细胞型细胞，胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起，生长时多呈放射状或漩涡状。
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用外科剪刀剪碎成约1mm 小块，室温静置沉淀3分钟之后1000rpm离心2分钟，弃去上清，加入3mL0.25％胰蛋白酶(0.25％Trypsin‑EDTA(1X)，PhenolRed，gibco，加拿大)，室温消化30分钟。加入等体积的完全培养基终止消化。经过胰蛋白酶消化过地组织块转移到100目细胞筛(Solarbio，中国)过滤后加入完全培养基1000rpm离心5分钟，弃去上清，加入3mL的L‑15
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完全培养基重悬沉淀后转移到25cm 的培养瓶(Corning，美国)，将培养瓶放入22℃培养箱培养24小时后观察细胞状态，是否贴壁，在贴壁48小时依据贴壁情况用D‑hanks漂洗液稍微漂洗后换去50％的完全培养基培养，保留1‑3块组织块继续培养。当原代细胞培养到90％～
100％融合时，按1:2标准进行传代。如图1a所示，银鲳肝脏组织启动原代培养后贴壁细胞迁徙出组织块，在进行原代培养传代10次后，肝脏细胞呈现成纤维细胞型细胞，胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起，生长时多呈放射状或漩涡状。
[0036] 2)传代培养：当原代肝脏细胞铺满单层后，将原代培养瓶或传代培养瓶中的培养基吸出，加入D‑hanks漂洗液轻轻漂洗，10s左右弃去，加入2mL胰蛋白酶消化2分钟，将培养瓶放置显微镜下进行观察，待细胞开始皱缩，大部分变成圆形吸出胰蛋白酶，即可加入6mL完全培养基终止消化，使用移液枪将细胞吹打7分钟，镜检吹打效果，如若残余细胞过多则2
可重复消化一次，吸出3mL至新25cm 培养瓶，每瓶中加入10ng/mL碱性成纤维样生长因子(bFGF)，记录细胞的代数后将培养瓶放入22℃培养箱培养，约3～4天传代一次。传至第10代时，消化液的胰蛋白酶改为重组蛋白酶。如图1b和图1c所示，银鲳肝脏细胞系从10代至第70代较稳定地呈现类纤维状多边形。
可重复消化一次，吸出3mL至新25cm 培养瓶，每瓶中加入10ng/mL碱性成纤维样生长因子(bFGF)，记录细胞的代数后将培养瓶放入22℃培养箱培养，约3～4天传代一次。传至第10代时，消化液的胰蛋白酶改为重组蛋白酶。如图1b和图1c所示，银鲳肝脏细胞系从10代至第70代较稳定地呈现类纤维状多边形。
[0037] 本发明实施例中所使用的到的各种溶液，其一种具体的配方方法记载如下：①L‑15基础培养基是取L‑15(gibco，加拿大)培养液，向培养液中加入占细胞培养液总体积2％双抗(100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)；溶液pH值为7.0‑7.4，于4℃下保存备用；②L‑15完全培养基是取L‑15培养液，向培养基中加入占细胞培养液总体积15％的FBS(gibco，加拿大)和1％双抗；③D‑hanks漂洗液是向无菌D‑hanks溶液(Solarbio，中国)加入占溶液总体积1％双抗。上述溶液pH值为7.0‑7.4，于4℃下保存备用；④秋水仙碱贮存液：取上述配置D‑hanks溶液，加入250mg秋水仙碱，定容至125mL，充分溶解，于超净台内以0.22μm针头过滤器过滤除菌。贮存液浓度为2mg/mL(100×)，除菌后密封，4℃保存；⑤低渗溶液：称取0.3gKCl溶于100mL超纯水中。室温长期有效；⑥卡诺氏固定液：将醋酸与甲醇按照1:3的比例混合，而后置于‑20℃短期保存，配好后有效期不超过1天；⑦Giemsa染液母液：称取0.5gGie msa干粉，加入5mL甘油，充分碾磨；继续加入28mL甘油，以锡箔纸包裹，于60℃加热2小时；添加
33mL甲醇，混匀。母液存放于棕色玻璃瓶中，放置3周以后使用，室温长期保存。
33mL甲醇，混匀。母液存放于棕色玻璃瓶中，放置3周以后使用，室温长期保存。
[0038] 实施例2银鲳肝脏细胞的特性
[0039] 1)细胞冻存与复苏
[0040] 细胞冻存与复苏对于细胞的保种以及细胞活力的维持有着重要意义。PaL细胞从第5代开始，每隔5代放入液氮中进行长期保存。每隔30天取一批进行复苏，在显微镜下观察细胞的形态和生长情况并用台盼蓝染色后统计活细胞数量。在第35代附近，细胞表现出80～90％的存活率，细胞状态良好能稳定增殖，复苏后形态无明显变化。2～3天即可长满。目前已传代80余次也无明显差异，证明该银鲳肝脏细胞已成为繁殖快，稳定的连续传代细胞系，命名为PaL细胞系。于2022年3月1
[0041] 8日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编：430072，藏编号：CCTCC NO:C202261。
[0042] 2)DNA提取、PCR分析与核型分析
[0043] 为了确认PaL细胞的起源，使用从肝组织和PaL细胞提取的DNA通过PCR扩增Cyt b基因。如图2显示从PaL细胞中扩增出预期的PC R产物是340bp，随后的比对分析表明，Cyt b基因与NCBI数据库中已知的银鲳基因序列一致度为100％，以上数据证实PaL细胞来源于银鲳。
[0044] 通过细胞染色体核型分析可判断细胞是否变异以及变异程度，是其能否适用于体外研究工具的重要依据。通过观察第35代的100个中期细胞来测定PaL细胞的染色体数目。结果如图3所示，细胞的染色体数目在38到56之间，染色体众数为48，占中期细胞数的40％，具有二倍体核型，与银鲳个体染色体数目相似，从而表明该细胞系满足作为银鲳体外研究的工具的条件。
[0045] 3)细胞生长特性
[0046] 不同的组织来源的细胞系适宜生长的血清浓度和温度不同。PaL细胞最适血清浓度的确定是通过在22℃条件在不同FBS浓度(10％、15％、20％、25％)培养7天。结果如图4和图5所示，当FBS浓度从10％增加到25％时，细胞生长良好，且1天后生长速度显著提高，但10％血清培养3天后细胞数量开始下降。同时进行CCK‑8测定以评估细胞活性，以大多细胞系培养20％FBS浓度为阳性对照，10％FBS组的细胞活力明显低于所有其他组。15％FBS的细胞活力在3天内保持稳定，但25％胎牛血浆在7天后显示出显著下降。同样，最适培养温度的确定是通过设置18、22、26、30℃不同温度培养箱，在20％FBS的L‑15完全培养基培养7天。结果如图4和图5所示，细胞在18℃～30℃的温度范围内都能生长，22℃时生长速率最大。对于不同温度组，升高温度显著降低细胞活力并且将温度降低至26℃可在5天内显著提高细胞活力。因此在22℃下含有15％FBS的L‑15培养基中PaL细胞生长状态最佳。
[0047] 4)细胞转染外源基因GFP
[0048] 使用pEGFP‑N3质粒检测PaL细胞转染能力，该质粒在人巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下表达绿色荧光蛋白(GFP)。第40代PaL细胞在不同转染体系(pEGFP‑N3 plasmid TMamount:P3000 Reagent＝1:1，1:2，and 1:3)转染48小时后检测到强绿色荧光信号。结果如图6所示，1:3的比例转染效率最高，提示质粒DNA量增加到一定阈值可提高外源基因转染效率，这些数据说明PaL细胞可方便用于更多的鱼类在转基因和基因操作研究。
[0049] 5)肝脏细胞对虹彩病毒的敏感性
[0050] 在银鲳养殖过程中，由虹彩病毒(RSIV)引起的疾病死亡率高达90％以上。为了检测PaL对虹彩病毒易感性，从银鲳病鱼的脾脏组织获取到虹彩病毒的匀浆液，再将1:10稀释的病毒溶液在含有细胞的无血清培养基中孵育观察细胞病变效应(CPE)。当CPE达到约90％时，通过50％组织培养感染剂量(TCID50)测定法测定病毒滴度。结果如图7所示，病毒滴度在整个感染过程中不断增加。CPE典型特征为感染48小时后细胞收缩、变圆和从培养瓶中脱离。虹彩病毒扩增特异性PCR产物证实了虹彩病毒基因在细胞中的复制。并且与未感染的细胞相比，抗凋亡蛋白Bcl‑2的mRNA表达水平显著下调，而促凋亡蛋白Bax、Cyt c3和Caspase 9在感染后mRNA表达水平显著上调，表明病毒感染后发生细胞凋亡。同时，感染RSIV后，三种免疫基因TLR4、TLR5和TLR9的mRNA表达水平受到不同程度的诱导或抑制。
[0051] 6)LPS孵育后炎症细胞因子的上调
[0052] 脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)来源于大肠杆菌的外膜，适合用于许多疾病的炎症状态下基因功能的研究。为了评估LPS处理对细胞活力的影响，用不同浓度(0、10、50和100mg/L)24小时和48小时。如图8所示，LPS处理可以剂量依赖性地降低细胞活力。其中，暴露于100mg/L LPS 24小时的细胞活力降低了50％。因此，在炎症反应实验中分别使用10mg/L和100mg/L LPS浓度在mRNA表达水平的研究。结果如图9所示，LPS上调促炎细胞因子IL‑1β、TNF‑α、IL‑8和抗炎因子IL‑10的mRNA的表达水平。同时，免疫基因TLR5和TLR9的mR NA的表达水平上调，总之，LPS激活银鲳肝脏细胞的TLR信号通路来启动非特异性免疫功能，表明PaL细胞系可作为研究鱼类细胞因子的模型。
[0053] 7)棕榈酸(Palmitic acid，PA)是水产饲料中最常见的饱和长链脂肪酸，过量摄入膳食脂肪酸可激活促炎信号通路。基于肝脏作为机体的主要代谢器官，检测了体外PA对肝脏细胞的影响。用不同浓度(0、10、25、50和100μM)PA处理PaL细胞。结果如图10所示，PA处理以剂量依赖的方式显著降低细胞活力，最小有效剂量为25μM。与对照组相比，25μM PA孵育24小时后，细胞凋亡显著增加，表现为晚期凋亡细胞多于早期凋亡细胞，同时促凋亡的Bax、Cyt c3和Caspase 9基因mRNA的表达水平上调，抗凋亡的Bcl‑2下调。此外，PA处理24小时后通过TLRs/NF‑κB信号通路激活增加炎症基因如IL‑8、IL‑1β、IL‑10的mRN A的表达水平，从而诱发炎症反应。以上数据表明PaL细胞可应用于营养和代谢方面的体外研究。