用于鉴定大豆疫霉根腐病感抗情况的代谢标志物及其应用

摘要

本发明公开了一种用于鉴定大豆疫霉根腐病感抗情况的代谢标志物及其应用，属于植物病害防治技术领域。本发明通过代谢组学检测，以及进行代谢通路富集分析等数据分析，从大量代谢物中挖掘出可用于辅助降低抗病育种工作繁琐度的代谢标志物，分别为黄豆苷元、染料木苷、阿魏酸和根皮苷。所述代谢标志物能够辅助筛选抗病大豆品种。

权利要求

1.如下（1）‑（2）至少一项小分子物质作为代谢标志物在鉴定大豆疫霉根腐病感抗情况中的应用：（1）阿魏酸；

（2）根皮苷。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子物质的含量与大豆疫霉根腐病的病情指数呈负相关。

3.如下（1）‑（2）至少一项小分子物质作为代谢标志物在大豆抗病品种选育中的应用：（1）阿魏酸；

（2）根皮苷。

4.检测代谢标志物的试剂在制备鉴定大豆疫霉根腐病感抗情况的产品中的应用；

所述代谢标志物为如下（1）‑（2）任一项小分子物质：（1）阿魏酸；

（2）根皮苷。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂为液相色谱‑质谱联用检测试剂。

说明书

用于鉴定大豆疫霉根腐病感抗情况的代谢标志物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物病害防治技术领域，具体涉及一种用于鉴定大豆疫霉根腐病感抗情况的代谢标志物及其应用。

背景技术

[0002] 大豆是重要的粮食和经济作物，目前已成为我国的第五大主粮，是重要的战略农作物。目前来看，大豆生产上存在着很多病害问题，例如由大豆疫霉侵染所引起的大豆疫霉根腐病是一种重要的大豆根部病害，严重威胁全世界大豆生产。该病害因其病原菌具有极强的生存能力和土传特性，一旦发生，流行速度极快、传播面积极广、危害极其严重、极难防治。利用抗(耐)病品种是预防大豆疫霉根腐病最根本最有效的办法，并且目前也已成功鉴定了许多抗性来源。抗性品种具有诸多优点，例如：既可以避免大豆疫霉根腐病的大规模发生，又解决了大量使用杀菌剂造成的环境污染问题。但传统大豆抗病品种选育工作比较繁琐。

[0003] 代谢组学分析需要建立在群组指标的基础之上，研究具有共同性质的代谢物样本或某一类生物体小分子代谢物样本，通过高通量分析和全面的数据监测与数据处理过程，找到样本中具有明显差异性的小分子代谢物，继而利用整合信息建模和系统生物信息进行监控或评价基因功能，因而代谢组学可以对植物机体生理生化变化进行系统的分析研究。且代谢组是一定条件下生物学过程完成后最终代谢物的集合，是各种组学研究中最接近表型的一种组学，可以直接动态地反映出细胞的生理生化状态，从而有效地检测和发现特定生化途径，准确解释生理或者病理现象。目前代谢组检测技术发展迅速，可以通过检测样品的质谱(MS)、色谱(HPLC，GC)及色谱质谱联用技术谱图，结合模式识别方法判断生物体的病理生理状态，找出与之相关的生物标志物。

[0004] 利用代谢标志物来辅助抗病品种选育，能够降低抗病育种工作的繁琐度，但是，用于鉴定大豆疫霉根腐病感抗情况的代谢标志物目前还很少见有报道。

发明内容

[0005] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于鉴定大豆疫霉根腐病感抗情况的代谢标志物及其应用。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0007] 本发明的第一方面，提供如下(1)‑(4)至少一项所述的小分子物质作为代谢标志物在鉴定大豆疫霉根腐病感抗情况中的应用：

[0008] (1)黄豆苷元；

[0009] (2)染料木苷；

[0010] (3)阿魏酸；

[0011] (4)根皮苷。

[0012] 上述应用中，所述小分子物质的含量与大豆疫霉根腐病的病情指数呈负相关。

[0013] 本发明的第二方面，提供如下(1)‑(4)至少一项所述的小分子物质作为代谢标志物在大豆抗病品种选育中的应用：

[0014] (1)黄豆苷元；

[0015] (2)染料木苷；

[0016] (3)阿魏酸；

[0017] (4)根皮苷。

[0018] 本发明的第三方面，提供检测代谢标志物的试剂在制备鉴定大豆疫霉根腐病感抗情况的产品中的应用；

[0019] 所述代谢标志物为如下如下(1)‑(4)任一项所述的小分子物质：

[0020] (1)黄豆苷元；

[0021] (2)染料木苷；

[0022] (3)阿魏酸；

[0023] (4)根皮苷。

[0024] 上述应用中，所述试剂为液相色谱‑质谱联用检测试剂。

[0025] 上述应用中，优选的，所述代谢标志物为阿魏酸和根皮苷。

[0026] 本发明的第四方面，提供一种从野生大豆品种中筛选抗病小种的方法，包括以下步骤：

[0027] 检测野生大豆样本中的代谢标志物的含量，并与已知抗病大豆品种和感病大豆品种中代谢标志物的含量进行比较，根据代谢标志物含量比较结果筛选抗病小种。

[0028] 优选的，选择大豆下胚轴作为样本。

[0029] 优选的，选择代谢标志物含量高于抗病大豆品种或者高于感病大豆品种的野生大豆作为抗病小种。

[0030] 本发明的有益效果：

[0031] 本发明通过代谢组学检测，以及进行代谢通路富集分析等数据分析，从大量代谢物中挖掘出可用于辅助降低抗病育种工作繁琐度的代谢标志物，所述代谢标志物能够辅助筛选抗病品种。

附图说明

[0032] 图1：大豆品种Williams 79下胚轴侵染时大豆疫霉病潜在的关键代谢途径。

[0033] 图2：大豆品种Williams 82下胚轴侵染时大豆疫霉病潜在的关键代谢途径。

[0034] 图3：大豆品种Williams 79根部侵染时大豆疫霉病潜在的关键代谢途径。

[0035] 图4：大豆品种Williams 82根部侵染时大豆疫霉病潜在的关键代谢途径。

[0036] 图5：目标化合物进行靶向代谢组的绝对定量(左柱为大豆品种Williams 82，右柱为Williams 79)。

[0037] 图6：25份感抗病性未知的野生大豆品种进行靶向含量检测。

[0038] 图7：靶向物质含量高的野生大豆品种的抗病性验证。

具体实施方式

[0039] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0040] 如前所述，传统大豆抗病品种选育工作比较繁琐。基于此，本发明首先通过分析两个Williams家族的大豆抗病品种，分析了两抗病品种的代谢通路富集情况，发现抗病小种之间的抗病机制存在着高度相似，代谢物产生也存在着高度相似，最终筛选到四种抗性代谢标志物，分别为黄豆苷元、染料木苷、阿魏酸和根皮苷。然后选取了多种野生大豆品种进行了初步靶向检测并最终选定了含量比较高的大豆品种进行下一步实验，验证这些品种是否具有耐病性或抗病性。接菌实验结果表明，相较已知感病的Williams小种，这些含量较高的大豆品种具有一定的抗(耐)病性。因此，本发明的代谢标志物对于抗病育种选种工作有高效实用的作用，由此提出了本发明。

[0041] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

[0042] 实施例1：代谢标志物的筛选

[0043] (一)样品的来源和收集

[0044] 本发明中所使用的大豆材料及大豆疫霉菌均来自于山东农业大学作物生物学国家重点实验室。公众可从申请人处获得以用于重复本发明。

[0045] 收集方法：分别取Williams 82、Williams79、Williams大豆材料，其中，Williams82、Williams79是抗病品种，Williams是感病品种；将大豆下胚轴及其根部清洗干净，保持根部完整且不被破坏，将不同品种的大豆下胚轴中部摆放于8连管中，并于摆放位置的下胚轴表面滴加稀释后的大豆疫霉菌游动孢子悬浮液，根部上平铺2‑3层干燥的纸巾，并定期使用喷壶喷水，覆盖保鲜膜以此保湿；根部处理则是将不同大豆品种根部浸没于相同浓度的大豆疫霉菌游动孢子悬浮液中。在接种0、1、4、8、12小时后于大豆下胚轴接菌部位上下各1cm处取材，根部全部取材，液氮冷冻后放入﹣80℃冰箱保存，用以大豆疫霉菌代谢组的检测，其中接菌0小时正常生长状态下的大豆样品为对照样品。

[0046] (二)LC/MS分析和数据处理

[0047] 1.大豆材料样本前处理

[0048] 大豆下胚轴及根部样品磨碎后，每组样品设置6个生物学重复，每个重复取100mg样品，并于样品中加入1mL提取液甲醇：乙腈：水(2：2：1，体积比)，4℃超声10min，13000prm离心5min，取上清移至离心管内，放入旋转蒸发仪蒸发浓缩，加100μL甲醇复溶，进样前通过0.22μm的滤膜过滤后即可上样。

[0049] 2.超高液相色谱质谱分析

[0050] (1)液相色谱

[0051] 色谱柱：Thermo HYPERSIL GOLD aQ C18色谱柱(2.1×100，1.9μm)；柱温：35℃；流动相：A：含0.1％乙酸(体积分数)的水溶液，B：含0.1％乙酸(体积分数)的乙腈溶液；洗脱梯度：0‑0.5min，A＝90％；0.5‑7min，A递减至0％；7‑8.5min，A＝0％；8.6min，A递增至90％；8.6‑10min，A＝90％；进样体积：3μL。

[0052] (2)质谱条件

[0053] 正离子模式：喷雾电压：3.8kv；鞘气：40；辅助气：10；离子传输管温度：350℃。分辨率：17500；微扫数：1；AGC target：2e5；归一化碰撞能量：50。

[0054] 负离子模式：喷雾电压：2.9kv；鞘气：40；辅助气：0；离子传输管温度：350℃。分辨率：17500；微扫数：1；AGC target：2e5；归一化碰撞能量：50。

[0055] 3.数据处理、分析及标志物的筛选

[0056] (1)代谢组原数据提取以及分析

[0057] 使用高效液相仪与Q ExactiveTM组合型四极杆Orbitrap质谱仪联用仪检测所得原始数据通过Compound Discoverer软件，根据设定好的实验方法对原始数据进行峰提取、峰对齐、归一化、填补缺失数据、降噪处理等获得符合实验要求的正离子相和负离子相变量：代谢物质荷比(m/z)、保留时间(retention time)、峰面积(group area)、预测代谢物名字(formula)，可通过扫描的代谢物二级质谱图与二级谱图数据库进行匹配对代谢物进行定性，通过扫描代谢物峰面积对代谢物进行相对定量分析。

[0058] 导出至EXCEL可进行更进一步的分析，确定符合要求的正离子相和负离子相变量后采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法‑判别分析(PLS‑DA)、正交偏最小二乘法‑判别分析(OPLS‑DA)3种方法分别对质谱数据进行可信性分析检验，并根据OPLS‑DA模型的VIP值(阈值>1)、不同大豆品种间代谢产物峰面积学生氏t检验的P值(阈值<0.05)及所得代谢物峰面积倍性变化，进而对供试次生代谢产物差异进行分析。

[0059] (2)标志物的筛选

[0060] 利用Compound Discoverer软件自定义的搜库流程，我们搜索比对了以下数据库：包括6549种类黄酮及4400种内源代谢物在内的软件自带数据库；AraCyc、BioCyc、KEGG、PlantCyc及LipidMAPS开源的数据库；mzVault自建数据库；mzCloud二级谱图数据库。通过搜索这些数据库并对代谢物进行二级质谱信息的匹配，根据Log2Fold Change＞1或<‑1且P‑value＜0.05的筛选条件整理所得抗性差异代谢物，作为潜在生物标志物，结果如表1‑表
4所示。

[0061] 表1：Williams82下胚轴潜在生物标志物

[0062]

[0063]

[0064] 表2：Williams79下胚轴潜在生物标志物

[0065]

[0066] 表3：Williams82根部潜在生物标志物

[0067]

[0068] 表4：Williams79根部潜在生物标志物

[0069]

[0070] 整理出两个抗病品种下胚轴和根部中拥有KEGG ID的潜在生物标志物后，通过联川生物云平台(www.omicstudio.cn)中的代谢通路富集分析，制作出两个近等基因系抗病品种接种大豆疫霉菌后的差异代谢物的代谢通路富集分析图(图1‑图4)，并选取大豆品种Williams82和Williams79二者中均有的标志物(黄豆苷元、染料木苷、阿魏酸、根皮苷)作为抗性标志物进行下一步实验研究。

[0071] 根据非靶向代谢组的筛选，我们初步定位到了一些化合物，接下来我们利用峰面积对目标化合物(黄豆苷元、染料木苷、阿魏酸、根皮苷)进行靶向代谢组的绝对定量，结果如图5所示。

[0072] 通过对比两抗病小种的含量变化，发现这些化合物含量随着接菌时间增加而增加，因此初步推定黄豆苷元、染料木苷、阿魏酸和根皮苷为代谢标志物进行下一步研究。

[0073] 实施例2：代谢标志物的靶向含量检测

[0074] 为了验证实施例1初步推定的代谢标志物在其他大豆品种的含量高低，我们选取了多种对大豆疫霉菌感抗病性未知的野生大豆品种的下胚轴进行靶向含量检测，供试大豆品种均为常规实验品种，发芽率良好且生长稳定，共25份。

[0075] 根据上述靶向物质绝对含量的结果(图6)，本研究选取了各物质含量前三且发芽率良好的小种进行抗病性验证。通过下胚轴接菌的方法来验证这些小种是否具有抗(耐)病性。

[0076] 实验发现，下胚轴接菌后12小时后，已知感病的品种Williams出现大量病斑，而筛选出的用于抗病性验证的野生大豆品种出现少量病斑且仍可正常生长；下胚轴接菌24小时后，感病品种Williams出现明显缢缩枯萎，而野生大豆品种依旧保持轻微病斑，仍可以正常生长(图7)。

[0077] 由此说明，这些代谢标志物(黄豆苷元、染料木苷、阿魏酸、根皮苷)含量高的小种均具有较好的抗(耐)病作用。

[0078] 进一步的，对上述4种代谢标志物与大豆根腐病病情指数的相关性进行分析，大豆根腐病严重度分级标准如表5所示。

[0079] 表5：大豆根腐病严重度分级标准

[0080]

[0081] 且通过SPSS分析，结果发现，只有阿魏酸和根皮苷这两个物质的含量与病情指数存在着显著的负相关性(表6)。因此，阿魏酸和根皮苷更适合作为鉴定大豆疫霉根腐病感抗情况的代谢标志物。表6：

[0082]

[0083] **表示P＜0.01

[0084]

[0085] *表示P＜0.05

[0086] 综上所述，通过比较两个抗病品种接种大豆疫霉菌后下胚轴及根部的样品代谢组学数据分析发现，两抗病品种在代谢物产生及代谢通路富集分析上存在着高度相似，且均存在一些随着接菌时间增长而增加的代谢物，推测这些代谢物和代谢途径参与到大豆对大豆疫霉菌抗病，且两个抗病品种的大豆在抗病机制上相似。

[0087] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。