一种含硒元素的浸种剂及其在提高植物抗盐胁迫中的应用

摘要

本发明涉及植物栽培技术领域，公开了一种含硒元素的浸种剂，所述浸种剂包括硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶，所述硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶的制备方法包括以下步骤：将硒代胱胺盐酸盐与间苯二胺在超纯水中混合，在无氧条件下120~200℃反应6 h~12 h，纯化即得。本发明含有硒元素的浸种剂能够清除体外超氧阴离子和羟基自由基，作为一种颗粒小，分散均匀的纳米酶粒子，能够提高盐胁迫下植物幼苗的长势。制备简单、水溶性好、生物相容性好、无毒副作用。

权利要求

1.一种含硒元素的浸种剂，其特征在于，所述浸种剂包括硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶，所述硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶的制备方法包括以下步骤：将硒代胱胺盐酸盐与间苯二胺在超纯水中按质量比为2 3：1混合，在无氧条件下120  200℃反应6 h 12 h，反~ ~ ~应后的溶液进行高速离心，所得上清液用透析袋透析纯化即得。

2.根据权利要求1所述含硒元素的浸种剂，其特征在于，所述硒代胱胺盐酸盐与间苯二胺的总质量分数为0.5 0.75%。

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3.根据权利要求1所述含硒元素的浸种剂，其特征在于，反应结束后，在反应后的上清液中加入聚丙烯酸修饰物进行表面修饰。

4.根据权利要求1所述含硒元素的浸种剂，其特征在于，所述纳米拟酶以硒元素标定的质量浓度为1.0 g/L 5.0 g/L。

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5.权利要求1 4任意一项所述含硒元素的浸种剂在提高植物抗盐胁迫中的应用。

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6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述含硒元素浸种剂的使用浓度为1 mg/L

100 mg/L，分散剂为水。

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说明书

一种含硒元素的浸种剂及其在提高植物抗盐胁迫中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物栽培技术领域，尤其涉及一种含硒元素的浸种剂及其在提高植物抗盐胁迫中的应用。

背景技术

[0002] 盐碱危害是限制种子萌发、幼苗生长的一个重要环境因子。实际生产中，由于初生或次生盐碱地土壤的危害，以及继而产生的渗透胁迫以及离子毒害等对作物造成的负面影响往往导致作物减产。因此，提高作物在种子、苗期的耐盐性，维持其健康的营养生长至关重要。

[0003] 纳米拟酶是拥有类似于细胞抗氧化酶活性的纳米材料的统称。近年来，研究人员发现了一种高效清除活性氧的纳米拟酶：经过表面修饰的氧化铈纳米材料（PNC）。PNC能够+清除盐胁迫下拟南芥叶肉细胞内过量累计的活性氧，增强植物细胞钾离子（K）的保留和钠+
离子（Na）的外排，从而提高植物耐盐性。但由于PNC中所含稀土元素铈是重金属，存在一定的生物安全性顾虑。硒（Se）元素作为植物编码氨基酸，硒代半胱氨酸的组成元素，在植物体内普遍存在，目前的研究表明以硒元素掺杂的碳量子点纳米材料可以清除动物细胞中的活性氧，但其在植物中的应用还未曾报道。且以往报道的合成方法原材料成本昂贵且不易合成纯化，稳定性较差，难以大面积推广使用。

发明内容

[0004] 本发明提供了一种含硒元素的浸种剂，能够提高作物高盐情况下的发芽率和长势。

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 本发明提供了一种含硒元素的浸种剂，所述浸种剂包括硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶，所述硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶的制备方法包括以下步骤：将硒代胱胺盐酸盐与间苯二胺在超纯水中混合，在无氧条件下120  200℃反应6 h 12 h，纯化即得。~ ~

[0007] 优选的，所述硒代胱胺盐酸盐与间苯二胺的质量比为2 3：1。~

[0008] 优选的，所述硒代胱胺盐酸盐与间苯二胺的总质量分数为0.5 0.75%。~

[0009] 优选的，所述纯化利用高速离心和透析的方式进行。

[0010] 优选的，反应结束后，在反应后的上清液中加入修饰物进行表面修饰。

[0011] 优选的，所述纳米拟酶以硒元素标定的质量浓度为1.0 g/L 5.0 g/L。~

[0012] 优选的，所述含硒元素浸种剂的使用浓度为1 mg/L 100 mg/L，分散剂为水。~

[0013] 本发明还包括上述含硒元素的浸种剂在提高植物抗盐胁迫中的应用。

[0014] 进一步的，含硒元素的浸种剂能提高幼苗发芽率、胚根长度及超氧化物歧化酶活性。

[0015] 本发明的有益效果：

[0016] 本发明提供了一种含硒元素的浸种剂，浸种剂中包括硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶。采用类似于细胞抗氧化酶的含硒元素的碳量子点纳米拟酶，能够进入植物细胞，可以提高作物的耐盐性。通过体外试验表明，本发明含有硒元素的浸种剂能够清除体外超氧阴离子和羟基自由基，提高盐胁迫下植物幼苗的长势。经本发明含有硒元素的浸种剂处理棉花和油菜种子后，植物幼苗的发芽率、胚根长度及超氧化物歧化酶活性皆高于对照组，根部更长，长势更好。

[0017] 本发明含硒元素的浸种剂具有价格低廉、制备简单、水溶性好、生物相容性好、无毒副作用等特点，使用方法简便，作用明显等效果。

附图说明

[0018] 图1为本发明实施例1中的硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶的TEM图像，其比例尺为100 nm。

[0019] 图2为本发明实施例2中的硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶的TEM图像，其比例尺为200 nm。

[0020] 图3为实施例1（左）和实施例2（右）纳米拟酶荧光特性测试结果。

[0021] 图4为实施例1（左）和实施例2（右）合成含硒碳量子点的电位情况。

[0022] 图5为纳米拟酶在油菜种子的子叶、外种皮及胚根细胞中分布的共聚焦图像。

[0023] 图6为纳米拟酶在棉花种子的内种皮及胚根细胞中分布的共聚焦图像。

[0024] 图7为盐胁迫下纳米拟酶浸种处理的油菜种子具有较高的发芽率与较好的幼苗生长情况。

[0025] 图8为盐胁迫下纳米拟酶浸种处理的棉花种子具有较高的发芽率与较好的幼苗生长情况。

[0026] 图9为盐胁迫下纳米拟酶浸种处理棉花种子幼苗的发芽率、发芽势、胚根长度和SOD酶活力。

具体实施方式

[0027] 本发明提供了一种含硒元素的浸种剂，所述浸种剂包括硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶，所述硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶的制备方法包括以下步骤：将硒代胱胺盐酸盐与间苯二胺在超纯水中混合，在无氧条件下120  200℃反应6 h 12 h，纯化即得。~ ~

[0028] 本发明的纳米拟酶在合成过程中加入了间苯二胺作为反应物，以增强所合成纳米材料胶体的荧光强度。本发明中，硒代胱胺盐酸盐与间苯二胺的质量比优选为2 3：1，更优~选为2：1。作为一种实施方式，本发明所述硒代胱胺盐酸盐与间苯二胺的总质量分数为0.5~
0.75%。作为一种实施方式，本发明将混合液置于磁力搅拌器上至搅拌充分，再倒入反应釜中进行反应，优选搅拌时间为2 3 h。作为一种实施方式，本发明在上述混合溶液中充氮气5~
10min，排除溶液中的氧气。
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[0029] 本发明将硒代胱胺盐酸盐和间苯二胺的混合溶液在120 200℃下反应6 12 h。可~ ~选的反应在聚四氟乙烯反应釜或高压反应釜中进行，高压反应釜由于温度控制更加精确，通入氮气后更能保证反应的无氧环境，以及反应体系较小使得反应进行更加彻底。反应温度优选为150 190℃，反应时间优选为7 9h。
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[0030] 本发明所述纯化利用高速离心和透析的方式进行。本发明对离心的方式没有特殊限定，采用本领域中的常规离心方法即可。本发明优选离心速率为10000 15000rpm，更优选~为11000 13000rpm；离心时间优选为15 30 min，更优选为20 25min。离心后的上清液用透~ ~ ~
析袋透析。作为一种可实施的方式，透析前，调整所述上清液的pH为6 8，优选为7。本发明的~
透析袋采用常规透析袋，对透析袋的来源没有特殊限定。透析时间优选的为24 48h，间隔8~ ~
12 h换一次水。本发明增加了透析的纯化步骤，经透析步骤，使得得到的硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶能够在水中稳定存在，不易沉淀。透析得到含有硒元素碳量子点的纳米拟酶。

[0031] 本发明使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP‑OES)检测硒元素的浓度，作为该纳米拟酶的浓度。所述纳米拟酶以硒元素标定的质量浓度为1.0g/L 5.0 g/L，更优选为2.0 ~g/L 4.0 g/L。
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[0032] 本发明还包括修饰的步骤，修饰过程在最后一步纯化前进行。可选的，修饰物可以为聚丙烯酸或聚乙烯亚胺。将反应后的溶液离心，所得上清液中加入聚丙烯酸或聚乙烯亚胺进行表面修饰，使碳量子点表面带负电荷或正电荷。所带一定范围电荷的纳米拟酶更容易进入植物细胞。优选所述聚丙烯酸的相对分子质量为600 1800。具体的，将聚丙烯酸溶于~水中与反应后的上清液混合，滴入氨水中，搅拌。搅拌反应后透析得到经修饰的含硒元素碳量子点纳米拟酶。

[0033] 通过对本发明制备得到的含硒元素碳量子点TEM图像中可以看到，本发明的含硒碳量子点为粒径大约2‑5nm的球形纳米颗粒。纳米拟酶具有碳量子点的基本荧光特性，利用365 nm紫外光灯照射时，可以观察到绿色荧光的产生。

[0034] 本发明将制备得到的含硒元素碳量子点纳米拟酶在水中稀释得到特定浓度的含硒元素浸种剂。作为优选的，所述浸种剂中的含硒碳量子点纳米拟酶的有效作用浓度为1~100mg/L以上，更优选为25‑70mg/L。本发明浸种剂中还可添加本领域所熟知的农药助剂，如表面活性剂。所述表面活性剂添加的质量浓度优选为0.05 0.5%，更优选的为0.05  0.1%。
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[0035] 本发明所述表面活性剂可选的为Silwet L‑77或Triton X‑100，表面活性剂会与纳米拟酶相互配合，使纳米拟酶顺利进入植物细胞。有机硅表面活性剂毒性低，安全性好，在同等浓度的溶液中具有更低的表面张力，能更好的使含硒碳量子点纳米拟酶均匀的附着在植物种子的表面，进入植物细胞后提高植物的抗逆性。

[0036] 本发明将含硒碳量子点的纳米拟酶和表面活性剂混合，浸泡植物种子，促进植物种子萌发，提高植物抗逆性。本发明含硒元素的浸种剂可以提高植物对盐胁迫的抗性，避免高盐带来的损失。实验表明，本发明含硒元素的浸种剂能够清除体外超氧阴离子和羟基自由基，提高盐胁迫下植物幼苗的发芽率、胚根长度及超氧化物歧化酶活性，幼苗长势更好。

[0037] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0038] 实施例1

[0039] 本实施例提供一种含硒元素的浸种剂，浸种剂中包括硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶。

[0040] 所述含硒碳量子点纳米拟酶的制备方法包括：将100 mg硒代胱胺盐酸盐，间苯二胺50 mg，溶于10 ml超纯水，搅拌3 h，倒入反应釜中，通入氮气以排除反应釜中的氧气，180℃下反应8h，反应得到棕黄色溶液，12000 rpm离心20 min。小心收集上清液，将上清液倒入500 D的透析袋透析24h，每6 8 h更换一次透析的水，得到的含硒元素的碳量子点纳米拟~
酶。

[0041] 图1的TEM图显示，其表观显示为球型，平均粒径为3.54 nm，与已发表的Se‑CQD（Li, Feng, et al. "Selenium‐doped carbon quantum dots for free‐radical scavenging." Angewandte Chemie International Edition 56.33 (2017): 9910‑9914.）相近，后利用光谱法测试其成分中硒元素的质量浓度为1.7 g/L，按固形物计算，产率为：61.3%。

[0042] 将制备得到的纳米拟酶用水稀释至所需浓度，得到含硒元素的浸种剂。

[0043] 实施例2

[0044] 本实施例提供一种含硒元素的浸种剂，浸种剂中包括硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶。

[0045] 所述含硒碳量子点纳米拟酶的制备方法包括：将100 mg硒代胱胺盐酸盐，间苯二胺50 mg，溶于10 ml超纯水，搅拌3 h，倒入高压反应釜中，通入氮气以排除反应釜中的氧气，180 ℃下反应8h，反应得到棕黄色溶液，12000 rpm离心20 min。小心收集上清液，将1.8 g相对分子质量为1800的聚丙烯酸（PAA）溶于2 ml水后与上清混合，用移液管缓慢滴入7 ml氨水中，500 rpm搅拌8 h。用10000 D的透析袋进行纯化，每6 8 h更换一次透析的水，透析~48 h，得到大量体积、较低浓度的含硒元素的碳量子点纳米拟酶。

[0046] 利用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP‑OES)检测硒元素的质量浓度为1.18 g/L，按固形物计算，产率为：65.9%。从TEM图像上得知，制备得到的含硒碳量子点为球型，平均粒径为4.72 nm。

[0047] 将制备得到的纳米拟酶用水稀释至所需浓度，得到含硒元素的浸种剂。

[0048] 实施例3

[0049] 本实施例提供一种含硒元素的浸种剂，浸种剂中包括硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶。

[0050] 将150 mg硒代胱胺盐酸盐，间苯二胺50 mg，溶于10 ml超纯水，搅拌3 h，倒入高压反应釜中，通入氮气以排除反应釜中的氧气，120℃下反应8h，反应得到棕黄色溶液，14800 rpm离心30 min。小心收集上清液，将上清液倒入200 D的透析袋透析24h，每6 8 h更换一次~透析的水，得到的含硒元素的碳量子点纳米拟酶。

[0051] 利用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP‑OES)检测硒元素的质量浓度为1.4 g/L，按固形物计算，产率为：50.5%。从TEM图像上得知，制备得到的含硒碳量子点为球型，平均粒径为3.63 nm。

[0052] 将制备得到的纳米拟酶用水稀释至所需浓度，得到含硒元素的浸种剂。

[0053] 实施例4

[0054] 本实施例提供一种含硒元素的浸种剂，浸种剂中包括硒元素掺杂的碳量子点纳米拟酶。

[0055] 所述含硒碳量子点纳米拟酶的制备方法包括：将300 mg硒代胱胺盐酸盐，间苯二胺150 mg，溶于30 ml超纯水，搅拌3 h，倒入高压反应釜中，通入氮气以排除反应釜中的氧气，200℃下反应6h，反应得到棕黄色溶液，15000 rpm离心30 min。小心收集上清液，将上清液倒入400 D的透析袋，每6 8 h更换一次透析的水，得到的含硒元素的碳量子点纳米拟酶。~

[0056] 将制备得到的纳米拟酶用水稀释至所需浓度，得到含硒元素的浸种剂。

[0057] 实施例5

[0058] 将实施例1 2制备的纳米拟酶进行电位测定及荧光强度测定，具体操作如下：~

[0059] 利用荧光分光光度计对所述实施例进行3D扫描，确定不同实施例所获得纳米胶体均在440 nm激发光波长照射时，在520 nm处发射出最强荧光(图3)；通过Zata电位仪测定其电位情况(图4)。

[0060] 实施例6

[0061] 本实施例利用共聚焦荧光显微镜进行观察油菜和棉花经过本发明浸种剂浸种后，所述浸种剂中的纳米拟酶进入油菜及棉花种子细胞的情况的实验，具体操作步骤如下：

[0062] 将棉花及油菜种子用50 mg/L实施例1所述浸种剂浸泡3 h后，分别取制样，利用共聚焦显微镜在405 nm激发光下激发，PMT=500‑600 nm，对所述纳米拟酶在油菜及棉花种皮、子叶及培根中的分布进行成像。其结果如图5及图6所示。经浸种处理后，所述浸种剂中的纳米拟酶在棉花和油菜种子的种皮、子叶及胚根中均有分布。

[0063] 实施例7

[0064] 含硒元素浸种剂体外清除超氧阴离子和羟基自由基的效率

[0065] 将实施例1的纳米拟酶配制成相对硒浓度为100 mg/L的胶体含硒浸种剂，利用2+
Fenton反应发生原理，将Fe 和H2O2试剂混合以产生羟基自由基，并在该体系中加入所述浸种剂，在240 nm处测定单位时间内吸光度值变化量，计算所述含硒元素浸种剂的羟基自由基清除效率。将实施例1所述纳米拟酶稀释成相对硒浓度为1 g/L的胶体含硒浸种剂，利用超氧阴离子含量清除效率测定试剂盒（南京建成生物科技有限公司），根据制造商提供的说明测定所述含硒元素浸种剂的超氧阴离子含量清除效率(具体操作步骤参照该网址：
)。结果如表 1所示。

[0066] 表 1 实施例1含硒元素的浸种剂抗氧化酶模拟活性测定

[0067] 羟基自由基体外清除率 超氧阴离子自由基体外清除率95.44% 78.72%

[0068] 实施例8

[0069] 本实施例提供纳米拟酶作为浸种剂提高油菜耐盐性应用实验，具体操作步骤如下：

[0070] 将品种为中双11号油菜种子使用3%次氯酸钠消毒后，采用实施例1纳米拟酶用清水稀释成含硒的质量浓度分别为25 mg/L、50 mg/L、75 mg/L的浸种剂，采用清水浸种作为对照（HP，Hydropriming）。室温下将种子浸没于溶液中，种子的质量与溶液的质量比为1:5，浸种时间为8 12h。将浸泡后的油菜种子放在均匀铺有石英砂的方形培养皿中，每个培养皿~放30粒种子 (5×6)，设3组重复，加入200 mM的NaCl溶液，确保种子可以接触到，将培养皿放于光照16h，黑暗8h条件的培养室进行培养，每天统计发芽的种子个数，计算发芽率，实验持续7天。

[0071] 浸种实验结果如图7所示，从及图7结果可以看出，采用不同浓度拟纳米酶的浸种剂进行浸种后，其幼苗长势相较于未使用纳米拟酶浸种均进一步提高，其中相对硒浓度为50 mg/L时效果最佳。

[0072] 实施例9

[0073] 本实施例提供纳米拟酶作为浸种剂提高棉花耐盐性应用实验，具体操作步骤如下：

[0074] 将品种为新陆早74号的棉花种子使用3%次氯酸钠消毒后，采用实施例1纳米拟酶（Se‑CDs）及实施例2纳米拟酶（PAA@Se‑CDs）用清水稀释成含硒的质量浓度为50 mg/L的浸种剂，采用相同硒质量浓度的SeO2溶液浸种作为无机对照，采用清水浸种作为对照。室温下将种子浸没于溶液中，种子的质量与溶液的质量比为1:5，浸种时间为8 12h。将棉花种子放~在均匀铺有石英砂的方形培养皿中，每个培养皿放30粒种子 (5×6)，设置3组重复，加入
200 mM的NaCl溶液，确保种子可以接触到，将培养皿放于光照16h，黑暗8h条件的培养室进行培养，每天统计发芽的种子个数，计算发芽率，实验持续7天。

[0075] 浸种实验结果如图8所示，从图8结果可以看出，采用本发明拟纳米酶的浸种剂进行浸种后，实施例1和实施例2的幼苗长势相较于未使用纳米拟酶浸种进一步提高。

[0076] 进一步统计分析发芽率、胚根长度、超氧化物歧化酶（SOD）活性，结果表明（图9），实施例1和实施例2的发芽率、胚根长度和SOD酶活力均高于对照组和无机对照组。

[0077] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。