一种改善气虚血瘀型乳腺癌围手术期免疫微环境及生活质量的中药组合物及其应用转让专利
申请号 : CN202210701867.4
文献号 : CN115120691B
文献日 : 2023-10-17
发明人 : 盛佳钰 , 江科 , 董梦婷 , 帕提古丽·加帕尔 , 袁敏佳 , 李晓菲
申请人 : 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院
摘要 :
本发明涉及中药领域，具体是一种改善气虚血瘀型乳腺癌围手术期免疫微环境及生活质量的中药组合物及其应用，所述中药组合物由以下重量份的原料药制成：黄芪15‑45份、莪术15‑45份、石见穿5‑25份、党参5‑25份、枸杞3‑18份。所述中药组合物正切中乳腺癌术后气虚血瘀病机，全方共奏益气扶正、活血化瘀之效；细胞学实验证实“芪术方”含药血清可抑制巨噬细胞向M2型极化，进而抑制乳腺癌MDA‑MB‑231细胞增殖，且效果优于“乳癌术后方”含药血清。临床实验证实“芪术方”能通过降低外周血M2巨噬细胞水平调节气虚血瘀型乳腺癌患者围手术期免疫微环境，同时还能改善乳腺癌患者围手术期生存质量，缓解中医症状。
权利要求 :
1.一种改善乳腺癌围手术期免疫微环境及生活质量的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：黄芪15‑45份、莪术15‑45份、石见穿5‑25份、党参5‑25份、枸杞3‑18份。
2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：黄芪
20‑40份、莪术20‑40份、石见穿10‑20份、党参10‑20份、枸杞6‑12份。
3.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：黄芪
30份、莪术30份、石见穿15份、党参15份、枸杞9份。
4.一种如权利要求1‑3任一所述的中药组合物在制备改善气虚血瘀型乳腺癌围手术期免疫微环境及生活质量的药物中的应用。
5.一种以如权利要求1‑3任一所述的改善乳腺癌围手术期免疫微环境及生活质量的中药组合物作为活性成份的药物制剂，所述的药物制剂是采用本领域常规制备方法制备成药剂学上的常用剂型。
6.根据权利要求5所述的中药组合物，其特征在于，所述的药物制剂是汤剂、丸剂、片剂、合剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、膏剂。
7.根据权利要求6所述的中药组合物，其特征在于，所述的药物制剂中还包括药学上允许的辅料。
说明书 :
一种改善气虚血瘀型乳腺癌围手术期免疫微环境及生活质量
的中药组合物及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及中药技术领域，具体地说，是一种改善气虚血瘀型乳腺癌围手术期免疫微环境及生活质量的中药组合物及其应用。
背景技术
[0002] 乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤，约占全球女性癌症新发病例的30％。尽管乳腺癌治疗模式已较为成熟，但仍有近26.5％的患者因治疗失败而死亡。目前，对于临床分期为可手术的乳腺癌患者，手术治疗仍是必不可少的一环。外科手术后出现肿瘤复发或转移的原因复杂，不仅受手术操作和肿瘤自身生物学特性(侵袭和转移能力)的影响，还与围手术期肿瘤所处的免疫微环境密切相关(Looney M，Doran P，Buggy DJ.Effect of anesthetic technique on serum vascular endothelial growth factor C and transforming growth factor beta in women undergoing anesthesia and surgery for breast cancer[J].Anesthesiology,2010,113(5):1118‑1125.)。近年来研究发现，包括吸入性麻醉药七氟烷、异氟烷、局麻药利多卡因、罗哌卡因，以及吗啡等临床应用的大部分麻醉药物都会抑制患者的免疫力，使肿瘤细胞躲避免疫监视，发生逃逸，从而增加围手术期肿瘤微转移率，进一步提高术后肿瘤复发的风险。因此，急需寻找一种改善围手术期肿瘤免疫微环境的治疗方案，有效抑制免疫逃逸的发生，才能改善预后。中医药的应用是我国乳腺癌防治研究的特色和优势。大量文献报道及课题组前期研究均证实，中医药干预可有效降低乳腺癌复发转移率及延长无病生存，且与其免疫调节作用息息相关。目前，中医药在围手术期使用的安全性已被认同。(盛佳钰,张馨月,李琼,薛晓红.基于肿瘤微环境中TLR4/NF‑κB通路的变化探讨乳癌术后方对乳腺癌小鼠肺转移的影响[J].中华中医药学刊,2016,34(12):2864‑2867.盛佳钰,刘钰,严兆霞,江科.扶正中药在乳腺癌新辅助治疗中的意义[J].云南中医学院学报,2018,41(3):47‑50+54.杨辉,孙敏,刘曦.疏肝益肾方加减对乳腺癌患者免疫功能及生活质量的影响[J].现代中西医结合杂志,2020,29(33):3683‑3687.巨志刚,席春娟,候娟娟,芮锦伟,梁海鹏,陈小鹏,张志峰.益气安神汤用于乳腺癌的疗效及对体内免疫相关因子水平影响研究[J].中华中医药学刊,2020,38(12):138‑141.)。
[0003] 多数学者认为乳腺癌(乳岩)主要是由于正气不足、外邪入侵、七情内伤等导致脏腑功能紊乱、冲任气血失调，以致气滞血瘀、邪毒内蕴、结滞乳络而成。正气不足是发病的关键，邪毒侵袭是致病的重要条件。全国著名中医外科流派——顾氏外科第四代传人陆德铭教授在乳腺癌治疗方面，提出“养正积自除”和“祛邪助瘤消”的观点，制定了扶正祛邪和调摄冲任的治疗原则，确立了“益气养阴、调摄冲任，佐以解毒”的乳腺癌术后治法，拟定的“乳癌术后方”。该方遵循扶正祛邪的基本治则，以黄芪、党参、淫羊藿、山萸肉、茯苓、白术、枸杞益气健脾，温肾助阳，先后天同补，亦可调摄冲任，以扶正固本；又伍石见穿、莪术、蜂房等活血化瘀、解毒抗癌之品，防余毒旁窜。该方临床广泛应用于乳腺癌术后恢复期，即手术、方化疗治疗结束后0‑5年。既往研究发现，该方不仅能改善患者生理、情感及认识功能，提高生活质量；而且能延迟乳腺癌患者复发转移的时间，提高无病生存率，降低病死率。(万华,吴雪卿,傅勤慧,董佳蓉,刘胜,陆德铭.“乳癌术后方”对乳腺癌患者生活质量影响的临床研究[J].上海中医药杂志,2004(9):28‑31.Nan Peng,Mingwei Yu,Guowang Yang,Qi Fu,Yongmei Xu,Jie Yu,Qiang Liu,Chen Li,Weiru Xu,Yi Zhang,Cong Ma,Lin Yang,Rencun Yu,Xiaomin Wang.Effects of the Chinese medicine Yi Shen Jian Gu granules on aromatase inhibitor‑associated musculoskeletal symptoms：A randomized，controlled clinical trial[J].Breast,2018,37:18‑27.Hadeel Albabtain,Monira Alwhaibi,Khalid Alburaikan,Yousif Asiri.Quality of life and complementary and alternative medicine use among women with breast cancer[J].Saudi Pharm J,2018,26(3):416‑421.瞿文超,李艳敏,万华,吴雪卿,冯佳梅,高晴倩,邵士珺,孙佳晔.乳癌术后方队乳腺癌术后10年无病生存及总生存的影响[J].实用医学杂志，2021，37(15):
1988‑1992.)
1988‑1992.)
[0004] 但是目前针对气虚血瘀型乳腺癌围手术期的中药组合物还未见报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种改善气虚血瘀型乳腺癌围手术期免疫微环境及生活质量的中药组合物及其应用。
[0006] 肿瘤病人的血液往往处于高凝状态(Mi XK,Liu QR,Zhu L,Sang MX,Guo LR,Shan BE.Mechanism of the high coagulation state of breast cancer tissue factor[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2017,21(9):2167‑2171.)，而手术带来的应激反应也会促使患者凝血功能被进一步激活，引起术后下肢静脉血栓、肺栓塞的发生。另外，中医理论认为手术创伤耗气伤精，气虚不能行血，血行不畅，脉络瘀滞，因此“气虚血瘀”证是乳腺癌患者围手术期主要证型，且气虚、血瘀症状相较乳腺癌术后恢复期患者更甚，可见乳腺癌围手术期与乳腺癌术后恢复期中医证型区别较大，乳癌术后方并不适用于乳腺癌围手术期气虚血瘀证。本发明涉及的中药组合物，虽来源于乳癌术后方，但主要针对乳腺癌围手术期患者气虚血瘀的证型，组方原则和治法都与乳癌术后方不同，并有针对性的进行了用药剂量调整，以凑良效，构成“芪术方”，针对乳腺癌围手术期气虚血瘀证患者，改善乳腺癌围手术期免疫微环境及生活质量。
[0007] 本发明的第一方面，提供一种改善乳腺癌围手术期免疫微环境及生活质量的中药组合物，由以下重量份的原料药制成：黄芪15‑45份、莪术15‑45份、石见穿5‑25份、党参5‑25份、枸杞3‑18份。
[0008] 进一步的，所述的围手术期为患者决定接受手术、进行手术及到术后恢复的一段时间(通常为术后两周内)(Bollen Pinto B,Chew M,Lurati Buse G,Walder B.The concept of peri‑operative medicine to prevent major adverse events and improve outcome in surgical patients:A narrative review.Eur J Anaesthesiol.2019Dec；36(12):889‑903.)。
[0009] 进一步的，所述中药组合物由以下重量份的原料药制成：黄芪20‑40份、莪术20‑40份、石见穿10‑20份、党参10‑20份、枸杞6‑12份。
[0010] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述中药组合物由以下重量份的原料药制成：黄芪30份、莪术30份、石见穿15份、党参15份、枸杞9份。
[0011] 本发明的第二方面，提供一种如上所述的中药组合物在制备改善气虚血瘀型乳腺癌围手术期免疫微环境及生活质量的药物中的应用。
[0012] 进一步的，所述的改善气虚血瘀型乳腺癌围手术期免疫微环境是指抑制巨噬细胞M2型极化，抑制乳腺癌免疫逃逸。
[0013] 进一步的，所述的改善生活质量是指调节乳腺癌患者术后情志不畅造成的情绪管理障碍，改善以气虚疲劳、失眠、自汗等的气虚血瘀症状，提高患者生活质量。
[0014] 本发明的第三方面，提供一种以如上所述的改善气虚血瘀型乳腺癌围手术期免疫微环境及生活质量的中药组合物作为活性成份的药物制剂，所述的药物制剂是采用本领域常规制备方法制备成药剂学上的常用剂型。
[0015] 进一步的，所述的药物制剂是汤剂、丸剂、片剂、合剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、膏剂。
[0016] 进一步的，所述的药物制剂中还包括药学上允许的辅料。更进一步的，所述的药学上允许的辅料包括乳化剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂、助溶剂。
[0017] 本发明优点在于：
[0018] 本发明的中药组合物为临床经验方，方中黄芪益气扶正，莪术祛瘀活血，共为君药；臣药石见穿活血通络，党参补中益气健脾，增益君药之功效；佐以枸杞生津养阴，诸药共奏益气扶正、活血化瘀之效。细胞学实验证实“芪术方”含药血清可抑制巨噬细胞向M2型极化，进而抑制乳腺癌MDA‑MB‑231细胞增殖，且效果优于“乳癌术后方”含药血清。临床实验证实“芪术方”能通过降低外周血M2巨噬细胞水平调节气虚血瘀型乳腺癌患者围手术期免疫微环境，尤其对Luminal B型乳腺癌患者外周血M2型巨噬细胞具有较突出的调控作用，可能成为Luminal B型乳腺癌治疗瓶颈的重要突破口。同时还能调节乳腺癌患者术后情志不畅造成的情绪管理障碍，改善以气虚疲劳、失眠、自汗等的气虚血瘀症状，提高患者生活质量，缓解中医症状。
附图说明
[0019] 图1.实施例19临床实验的研究流程示意图。
[0020] 图2“.芪术方”、“乳癌术后方”含药血清分别处理单纯巨噬细胞及MDA‑MB‑231细胞*+巨噬细胞共培养体系后巨噬细胞M1/M2比例检测；注：与相应巨噬细胞+药物血清组比较 P** #
<0.05，P<0.05；两组间比较P<0.05。
<0.05，P<0.05；两组间比较P<0.05。
[0021] 图3.芪术方组与安慰剂组干预前后各指标的组间、组内比较情况；A：芪术方组干+ ‑ ‑ ‑ + +预前CD14与CD14巨噬细胞在CD3CD19PM‑2KCD14细胞的百分比；B：芪术方组干预后CD14‑ ‑ ‑ + + ‑
与CD14巨噬细胞在CD3CD19PM‑2KCD14细胞的百分比；C：安慰剂组干预前CD14与CD14巨‑ ‑ + + ‑
噬细胞在CD3 CD19PM‑2KCD14细胞的百分比；D：安慰剂组干预后CD14与CD14巨噬细胞在‑ ‑ +
CD3CD19PM‑2KCD14细胞的百分比；E：芪术方组与安慰剂组干预前后各指标的组间IL‑10+ +
与CD14联合检测比较情况；F：芪术方组与安慰剂组干预前后各指标的组内IL‑10与CD14联合检测比较情况；注：ns：无显著统计学意义；*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001。
与CD14巨噬细胞在CD3CD19PM‑2KCD14细胞的百分比；C：安慰剂组干预前CD14与CD14巨‑ ‑ + + ‑
噬细胞在CD3 CD19PM‑2KCD14细胞的百分比；D：安慰剂组干预后CD14与CD14巨噬细胞在‑ ‑ +
CD3CD19PM‑2KCD14细胞的百分比；E：芪术方组与安慰剂组干预前后各指标的组间IL‑10+ +
与CD14联合检测比较情况；F：芪术方组与安慰剂组干预前后各指标的组内IL‑10与CD14联合检测比较情况；注：ns：无显著统计学意义；*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001。
具体实施方式
[0022] 下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
[0023] 实施例1：本发明中药组合物(一)
[0024] 由如下重量份的原料药组成：黄芪40份、莪术40份、石见穿20份、党参20份、枸杞12份。
[0025] 实施例2：本发明中药组合物(二)
[0026] 由如下重量份的原料药组成：黄芪30份、莪术30份、石见穿15份、党参15份、枸杞9份。
[0027] 实施例3：本发明中药组合物(三)
[0028] 由如下重量份的原料药组成：黄芪20份、莪术20份、石见穿10份、党参10份、枸杞6份。
[0029] 实施例4：本发明中药组合物(四)
[0030] 由如下重量份的原料药组成：黄芪30份、莪术30份、石见穿20份、党参20份、枸杞12份。
[0031] 实施例5：本发明中药组合物(五)
[0032] 由如下重量份的原料药组成：黄芪30份、莪术30份、石见穿10份、党参10份、枸杞6份。
[0033] 实施例6：本发明中药组合物(六)
[0034] 由如下重量份的原料药组成：黄芪40份、莪术40份、石见穿15份、党参15份、枸杞9份。
[0035] 实施例7：本发明中药组合物(七)
[0036] 由如下重量份的原料药组成：黄芪20份、莪术20份、石见穿15份、党参15份、枸杞9份。
[0037] 实施例8：本发明中药组合物(八)
[0038] 由如下重量份的原料药组成：黄芪30份、莪术20份、石见穿15份、党参15份、枸杞9份。
[0039] 实施例9：本发明中药组合物(九)
[0040] 由如下重量份的原料药组成：黄芪20份、莪术30份、石见穿15份、党参15份、枸杞9份。
[0041] 实施例10：本发明中药组合物(十)
[0042] 由如下重量份的原料药组成：黄芪30份、莪术30份、石见穿20份、党参10份、枸杞9份。
[0043] 实施例11：本发明中药组合物(十一)
[0044] 由如下重量份的原料药组成：黄芪30份、莪术30份、石见穿10份、党参20份、枸杞9份。
[0045] 实施例12：本发明中药组合物(十二)
[0046] 由如下重量份的原料药组成：黄芪15份、莪术15份、石见穿5份、党参5份、枸杞3份。
[0047] 实施例13：本发明中药组合物(十三)
[0048] 由如下重量份的原料药组成：黄芪45份、莪术45份、石见穿25份、党参25份、枸杞18份。
[0049] 实施例14：本发明中药组合物汤剂的制备
[0050] 按照实施例1‑13任一所述的重量份配比称取各原料药，粉碎，加适量水，常规方法煎煮。
[0051] 实施例15：本发明中药组合物合剂的制备
[0052] 按照实施例1‑13任一所述的重量份配比称取各原料药，混合，粉碎，加8倍量和10倍量的水煎煮二次，每次1小时，分别滤过，滤液合并，浓缩至相对密度为1.20(80‑85度)，放冷，加乙醇3倍量，搅匀，静置，取上清液滤过，滤液蒸制无醇味，静置，取上清液浓缩；加适当制药辅料(白糖、蜂蜜、苯甲丙酸或羟苯乙醇等)，制成合剂。
[0053] 实施例16：本发明种药物组合物丸剂的制备
[0054] 按照实施例1‑13任一所述的重量份配比称取各原料药，粉碎成细粉，过80目筛备用；称取一定量的蜂蜜于蒸发皿中加热至沸(如有杂志可过滤)，继续炼制成炼蜜程度，捞去漂浮的泡沫；将已炼制好的炼蜜与药粉按1：1的比例进行混合，充分和匀；将合好的面团样软材放置一定时间；手工做成光滑的、圆球形丸粒，采用蜡纸包好。
[0055] 实施例17：本发明中药物组合物散剂的制备
[0056] 按照实施例1‑13任一所述的重量份配比称取各原料药，混合，粉碎成细粉，过80目筛，采用蜡纸包好。
[0057] 实施例18：本发明中药物组合物膏剂的制备
[0058] 按实施例1‑13任一所述的重量份配比称取各原料药，混合，粉碎，加8倍量合10倍量的水煎煮二次，每次1小时，分别滤过，滤液合并，浓缩至相对密度为1.20(80‑85度)，放冷，加乙醇3倍量，搅匀，静置，取上清液滤过，滤液蒸制无醇味，静置，取上清液减压浓缩得浸膏，至滴于桑皮纸上无浸润水迹，装无菌瓶中密封。
[0059] 实施例19：本发明中药组合物的体外细胞试验
[0060] 1材料
[0061] 1.1动物与细胞株
[0062] 雄性SD大鼠，SPF级，6周龄，体质量(200±10)g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物许可证号SCXK(沪)2013‑0017。饲养于上海中医药大学附属岳阳医院动物实验中心SPF级动物房，温度(23±3)℃，相对湿度35％～45％，光照12h，自由摄食饮水。
[0063] MDA‑MB‑231人乳腺癌细胞，THP‑1人单核细胞购买自中国科学院上海生命科学研究院。MDA‑MB‑231细胞用含有10％胎牛血清(FBS)的L‑15培养液培养；THP‑1细胞用含10％FBS的RPMI 1640培养液培养。
[0064] 1.2试剂及仪器
[0065] 佛波酯(PMA)、噻唑蓝(MTT)、胰酶细胞消化液(美国Sigma公司)；CD86‑APC human(德国Miltenyi公司，货号为305206)；APC anti‑human CD206(美国Biolegend公司，货号为321110)。ELX800型全自动酶标仪(美国Bio‑Tek公司)、C6分析型流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)、低温离心机(Eppendorf公司)。
[0066] 1.3药物及制备
[0067] “芪术方”(黄芪30g、莪术30g、石见穿15g、党参15g、枸杞9g)、“乳癌术后方”(黄芪15g、党参10g、白术10g、南沙参12g、枸杞子12g、淫羊藿15g、山茱萸9g、肉苁蓉12g、石见穿
15g、蜂房9g、莪术9g、茯苓12g)饮片购于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院。常规方法煎煮，先加入10倍量水浸泡30min，大火煮沸，文火煎煮40min，纱布过滤煎煮液，加入8倍量水继续大火煮沸，文火煎煮40min，纱布过滤煎煮液。合并2次药液，水浴将“芪术方”药液浓缩至原药材1.98g/ml，“乳癌术后方”药液浓缩至原药材1.40g/ml，使用50mL离心管进行分装，4℃冰箱保存。
15g、蜂房9g、莪术9g、茯苓12g)饮片购于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院。常规方法煎煮，先加入10倍量水浸泡30min，大火煮沸，文火煎煮40min，纱布过滤煎煮液，加入8倍量水继续大火煮沸，文火煎煮40min，纱布过滤煎煮液。合并2次药液，水浴将“芪术方”药液浓缩至原药材1.98g/ml，“乳癌术后方”药液浓缩至原药材1.40g/ml，使用50mL离心管进行分装，4℃冰箱保存。
[0068] 1.4药物血清制备
[0069] 将实验大鼠随机分为2组，每组5只。“芪术方”组大鼠按15mL/kg给予“芪术方”煎剂灌胃，空白对照组给予等体积蒸馏水灌胃，2次/d，连续3d。末次给药后1h，乙醚麻醉，腹主动脉取血，无菌离心管收集，4℃静置2h，4℃、3000r/min离心15min，混匀合并同组大鼠药物血清，56℃恒温水浴灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，冻存管分装，置于‑80℃冰箱贮存备用。配制成终浓度分别为2.5％、5％、10％的“芪术方”药物血清培养液。[终浓度(％)＝加入血清体积÷总体积×100％]。以同样方法制备终浓度分别为2.5％、5％、10％的“乳癌术后方”药物血清培养液。
[0070] 2方法
[0071] 2.1 MTT比色法检测细胞活性
[0072] 收集对数生长期的THP‑1人单核细胞，调整细胞密度为5×104个/mL，接种于96孔板中，100μL/孔,加入PMA，使其终质量浓度为50μg/L，37℃5％CO2恒温培养箱培养诱导24h贴壁，即可得到诱导的巨噬细胞。巨噬细胞贴壁后，更换为含2.5％、5％、10％的“芪术方”及“乳癌术后方”药物血清培养液继续培养。培养24，48h，分别于各孔细胞内加入5g/L MTT 20μL，37℃作用4h，弃上清，于各孔内分别加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，振荡溶解后，酶标仪上读取各孔细胞在570nm波长处吸光度A，以检测不同浓度“芪术方”及“乳癌术后方”含药血清对巨噬细胞活性的影响。
[0073] 2.2 MTT比色法检测细胞增殖
[0074] 诱导巨噬细胞同2.1项。换新培养液，加入含2.5％的“芪术方”及2.5％的“乳癌术5
后方”药物血清培养液作用24h。吸去含药上清，加入2×10个/mL的MDA‑MB‑231细胞，100μL/孔，2种细胞比例为1∶1，共培养24h。倒置显微镜观察孔内细胞状态，拍照。分别于各孔细胞内加入5g/L MTT 20μL，37℃作用4h，弃上清，于各孔内分别加入DMSO 150μL，振荡溶解后，酶标仪上读取各孔细胞在570nm波长处A，计算肿瘤细胞抑制率。
后方”药物血清培养液作用24h。吸去含药上清，加入2×10个/mL的MDA‑MB‑231细胞，100μL/孔，2种细胞比例为1∶1，共培养24h。倒置显微镜观察孔内细胞状态，拍照。分别于各孔细胞内加入5g/L MTT 20μL，37℃作用4h，弃上清，于各孔内分别加入DMSO 150μL，振荡溶解后，酶标仪上读取各孔细胞在570nm波长处A，计算肿瘤细胞抑制率。
[0075] 2.3流式检测巨噬细胞极化
[0076] 常规培养THP‑1细胞，收集对数生长的细胞，调整细胞密度为2×107个/mL，铺6孔板，2mL/孔，PMA诱导细胞贴壁后，加入2.5％的“芪术方”药物血清培养液。置于37℃5％CO2培养箱培养24h。收集细胞，分别进行细胞表面抗原CD86及细胞内抗原CD206的流式染色。其中细胞外抗原CD86抗体染色每管加入CD86 10μL，避光孵育30min。300×g离心3min，洗2次，弃上清，加入PBS 500μL重悬。CD206胞内抗体染色每管加入Cell Fixation&Permeabilization Kit中的固定液A，100μL/管，室温避光15min。300×g离心3min，洗1次，弃上清，加入PBS 100μL重悬。加入破膜液B，100μL/管，CD 206，5μL/管。吹打混匀后，室温避光15min。300×g离心3min，洗2次，弃上清，加入PBS 500μL重悬，充分混匀，避光，置于冰上，于流式细胞仪检测。结果使用FlowJo软件进行分析。
[0077] 3结果
[0078] 3.1“芪术方”及“乳癌术后方”含药血清对巨噬细胞生长的影响
[0079] 与空白组比较，2.5％的“芪术方”药物血清培养液作用24，48h，巨噬细胞生长无明显变化；2.5％的“乳癌术后方”药物血清培养液作用24h，巨噬细胞生长无明显变化，作用48h，则巨噬细胞的生长受到抑制(P<0.05)。因此，本实验选用的2.5％的“芪术方”及“乳癌术后方”含药血清作用于巨噬细胞。见表1。
[0080] 表1“芪术方”及“乳癌术后方”含药血清对巨噬细胞增殖的影响( n＝3)[0081]
[0082] 注：与空白组比较*P<0.05，**P<0.01。
[0083] 3.2“芪术方”及“乳癌术后方”含药血清作用后的巨噬细胞对MDA‑MB‑231乳腺癌细胞增殖的影响
[0084] 与模型组比较，2.5％的“芪术方”及2.5％的“乳癌术后方”含药血清作用后巨噬细胞均能显著抑制MDA‑MB‑231细胞的增殖(P<0.01)，“芪术方”含药血清抑制效果显著优于“乳癌术后方”。见表2。
[0085] 表2“芪术方”及“乳癌术后方”含药血清作用巨噬细胞对MDA‑MB‑231细胞增殖的影响( n＝5)
[0086]
[0087] 注：与模型组比较*P<0.01。
[0088] 3.3“芪术方”及“乳癌术后方”含药血清对巨噬细胞极化的影响
[0089] 以2.5％的“芪术方”及2.5％的“乳癌术后方”对体外诱导的巨噬细胞进行含药血清处理，结果发现：巨噬细胞+芪术方组及巨噬细胞+乳癌术后方组M1/M2比例与巨噬细胞组相比并无显著变化(P>0.05)。而对MDA‑MB‑231细胞与巨噬细胞共培养体系进行2.5％“芪术方”及2.5％“乳癌术后方”含药血清处理后发现：巨噬细胞+MDA‑MB‑231+乳癌术后方组及巨噬细胞+MDA‑MB‑231+芪术方组M2巨噬细胞比例低于巨噬细胞+乳癌术后方组(P<0.05)及巨噬细胞+芪术方组(P<0.01)。M2巨噬细胞比例显著低于巨噬细胞+芪术方组(P<0.01)，且巨噬细胞+MDA‑MB‑231+芪术方组的M2巨噬细胞比例也显著低于巨噬细胞+MDA‑MB‑231+乳癌术后方组(P<0.05)(图2)。
[0090] 4讨论
[0091] 肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)是乳腺癌发生、发展的重要土壤。在TME相关细胞群里，肿瘤相关巨噬细胞(tumor‑associated macrophages，TAMs)因其极化与可重塑化特征逐渐为学者所熟知，主要表现为在不同肿瘤微环境下可被激活或重塑为M1型和M2型巨噬细胞。与M1型巨噬细胞的促炎抑瘤作用相反，M2型巨噬细胞分泌IL‑10、转化生长因子β等抑炎因子，并协助肿瘤细胞发生免疫逃逸，同时释放多种基质以利于血管生成和重建，是导致淋巴转移等诸多不良预后的重要因素(Steenbrugge J,Breyne K,Demeyere K,De Wever O,Sanders NN,Van Den Broeck W,Colpaert C,Vermeulen P,Van Laere S,Meyer E.Anti‑inflammatory signaling by mammary tumor cells mediates prometastatic macrophage polarization in an innovative intraductal mouse model for triple‑negative breast cancer[J].J Exp Clin Cancer Res,2018,37(1):191.Gordon SR,Maute RL,Dulken BW,Hutter G,George BM,McCracken MN,Gupta R,Tsai JM,Sinha R,Corey D,Ring AM,Connolly AJ,Weissman IL.PD‑1expression by tumour‑associated macrophages inhibits phagocytosis and tumour immunity[J].Nature,
2017,545(7655):495‑499.Lala PK,Nandi P,Majumder M.Roles of prostaglandins in tumor‑associated lymphangio‑genesis with special reference to breast cancer[J].Cancer Metastasis Rev,2018,37(2‑3):369‑384.)。有研究发现乳腺癌肿瘤微环境中的巨噬细胞主要由M2型巨噬细胞所构成(Bao XW,Shi R,Zhao TY,Wang YF,Anastasov N,Rosemann M,Fang WJ.Integrated analysis of single‑cell RNA‑seq and bulk RNA‑seq unravels tumour heterogeneity plus M2‑like tumour‑associated macrophage infiltration and aggressiveness in TNBC[J].Cancer Immunol Immunother,2021,70(1):189‑202.)，本发明利用GEO数据库中乳腺癌单细胞测序数据集GSE75688对乳腺癌免疫细胞浸润类型进行鉴定，结果与文献报道一致。为了进一步证明巨噬细胞M2极化与乳腺癌预后的关系，本发明通过免疫组化法对169例乳腺癌术后患者的组织芯片进行CD68、CD16、CD163检测(分别标记总巨噬细胞、M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞)，中位随访65个月，以此确认三种细胞类群浸润总数目与患者预后的关联性，结果发现：CD163高表达患者预后较差(P＝0.023)，CD16高表达预后较好(P＝0.046)，而CD68与乳腺癌预后无明显相关性(P＝
0.283)。初步证实M2型巨噬细胞在乳腺癌免疫微环境中举足轻重的作用，巨噬细胞M2型极化与乳腺癌患者预后不良密切相关。
2017,545(7655):495‑499.Lala PK,Nandi P,Majumder M.Roles of prostaglandins in tumor‑associated lymphangio‑genesis with special reference to breast cancer[J].Cancer Metastasis Rev,2018,37(2‑3):369‑384.)。有研究发现乳腺癌肿瘤微环境中的巨噬细胞主要由M2型巨噬细胞所构成(Bao XW,Shi R,Zhao TY,Wang YF,Anastasov N,Rosemann M,Fang WJ.Integrated analysis of single‑cell RNA‑seq and bulk RNA‑seq unravels tumour heterogeneity plus M2‑like tumour‑associated macrophage infiltration and aggressiveness in TNBC[J].Cancer Immunol Immunother,2021,70(1):189‑202.)，本发明利用GEO数据库中乳腺癌单细胞测序数据集GSE75688对乳腺癌免疫细胞浸润类型进行鉴定，结果与文献报道一致。为了进一步证明巨噬细胞M2极化与乳腺癌预后的关系，本发明通过免疫组化法对169例乳腺癌术后患者的组织芯片进行CD68、CD16、CD163检测(分别标记总巨噬细胞、M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞)，中位随访65个月，以此确认三种细胞类群浸润总数目与患者预后的关联性，结果发现：CD163高表达患者预后较差(P＝0.023)，CD16高表达预后较好(P＝0.046)，而CD68与乳腺癌预后无明显相关性(P＝
0.283)。初步证实M2型巨噬细胞在乳腺癌免疫微环境中举足轻重的作用，巨噬细胞M2型极化与乳腺癌患者预后不良密切相关。
[0092] 围手术期治疗恶性肿瘤患者中有着举足轻重的作用，如何改变乳腺癌患者围手术期的肿瘤免疫微环境，抑制免疫逃逸的发生是影响预后的关键。“芪术方”为代表的益气活血法已是我科室乳腺癌围手术期综合治疗的主要治则治法，临床疗效确切，但具体机制不明。细胞学研究中发现：“芪术方”体外细胞给药能显著减少巨噬细胞与乳腺癌细胞共培养体系中M2型巨噬细胞的比例，且效果优于乳癌术后方。提示：“芪术方”可能通过改变巨噬细胞M2极化抑制乳腺癌免疫逃逸。
[0093] 实施例20：本发明中药物组合物的临床试验
[0094] 1资料与方法
[0095] 1.1研究对象
[0096] 2021年7月至2021年12月期间，选取上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院收治的80例初治乳腺癌患者。所有入选病例均经组织学或细胞学确诊为乳腺癌。分期标准符合美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第7版制定的关于肿瘤分期的标准。80例患者均为女性，芪术方组患者中位年龄58岁，病理类型：浸润性导管癌37例(92.5％)；浸润性小叶癌3例(7.5％)，安慰剂组患者中位年龄61岁，病理类型：浸润性导管癌38例(95.0％)；浸润性小叶癌2例(5.0％)。所有入组乳腺癌患者及健康人均填写《知情同意书》，BC患者的不同临床病理特征，如年龄、TNM分期、肿块大小、淋巴结转移、雌激素受体(estrogen receptor,ER)情况、人表皮生长因子2(human epidermal growth factor receptor 2,Her‑2)情况等，详见表3。
[0097] 表3乳腺癌组及健康对照组的临床病理参数
[0098]
[0099] 1.2纳排标准
[0100] 1.2.1纳入标准：①女性，年龄≥18岁，≤80岁；②组织病理结果确诊为浸润性乳腺恶性肿瘤；③符合中医气虚血瘀证诊断标准。④完成手术治疗后1天；⑤未接受过除手术外任何肿瘤相关治疗，包括放化疗、内分泌治疗等；⑥经患者知情同意。
[0101] 1.2.2排除标准：①拒绝抽血或因患有精神疾患等无法合作者；②合并严重的循环系统、呼吸系统、消化系统、血液系统、泌尿系统、神经系统、内分泌系统疾病，研究者认为该患者其他系统的严重疾病将影响本研究结果者；③有乳腺癌远处转移；④已知患有任意其他恶性肿瘤者；⑤同期参与其他临床研究者；⑥处于妊娠或哺乳期者；⑦因过敏等原因无法服用中药者；⑧实验之前近三个月有规律服用中药者(每周服用≥5天，间断≤7天)。
[0102] 1.3检测方法
[0103] 1.3.1外周血巨噬细胞的流式细胞术：取5ml抗凝全血，添加到15ml Ficoll(天津灏洋)中，800g离心20min，取出白膜层洗涤一次以分离出PBMC。使用10％人血浆封闭样本10min。每106细胞中添加1test PM‑2 K Anti‑Macrophage抗体(Abcam ab58822)4℃孵育
30min。加入5ml PBS，400g离心5min，弃去上清。重悬细胞，每106细胞中添加1test Goat Anti‑Mouse lgG Fc，Human/Bovine/Horse SPads‑FTC(SouthernBiotech 1013‑02)4℃孵育30min。重悬抗体加入5ml PBS，400g离心5min，弃去上清，重复上一步。重悬细胞，每106细胞中添加1test PerCP anti‑human CD3(Biolegend 300427)，1test PE anti‑human CD19(Biolegend 302207)，1test APCanti‑human CD14(Biolegend 325608)，4℃孵育30min。另取一管细胞按照如上方式添加同型对照。将孵育好的样本，洗去未结合抗体后进行流式细胞检测。设门圈出CD3‑CD19‑的细胞群，检测PM‑2K+CD14+和PM‑2K+CD14‑两群巨噬细胞水平。
30min。加入5ml PBS，400g离心5min，弃去上清。重悬细胞，每106细胞中添加1test Goat Anti‑Mouse lgG Fc，Human/Bovine/Horse SPads‑FTC(SouthernBiotech 1013‑02)4℃孵育30min。重悬抗体加入5ml PBS，400g离心5min，弃去上清，重复上一步。重悬细胞，每106细胞中添加1test PerCP anti‑human CD3(Biolegend 300427)，1test PE anti‑human CD19(Biolegend 302207)，1test APCanti‑human CD14(Biolegend 325608)，4℃孵育30min。另取一管细胞按照如上方式添加同型对照。将孵育好的样本，洗去未结合抗体后进行流式细胞检测。设门圈出CD3‑CD19‑的细胞群，检测PM‑2K+CD14+和PM‑2K+CD14‑两群巨噬细胞水平。
[0104] 1.3.2外周血IL‑10的检测：抽取5ml抗凝全血，置于EDTA抗凝管静置1h后，3600×g，离心10min分离血清，存于‑80℃待用。使用酶联免疫吸附法(ELISA)进行血清中IL‑10定量检测，操作步骤严格按照试剂盒说明书操作。
[0105] 1.4治疗方法
[0106] 所有入组患者按1：1比例随机分为2组，一组为芪术方组，另一组为安慰剂组：
[0107] ①芪术方：黄芪30g、莪术30g、石见穿15g、党参15g、枸杞9g。委托中国医药集团江阴天江药业有限公司成颗粒剂，每天1剂，分2次，开水冲服。
[0108] ②安慰剂：模拟中药复方制剂颗粒采用辅料和调味剂制成，包装、外形、重量、气味、颜色与中药剂一致。委托中国医药集团江阴天江药业有限公司制成颗粒剂，每天1剂，分2次，开水冲服。
[0109] 1.5观察指标
[0110] 1.5.1主要观察指标
[0111] 记录治疗前后两组乳腺癌患者外周血IL‑10、CD14+巨噬细胞检测表达的改变情况。按照构建的IL‑10与CD14+巨噬细胞联合检测公式：y＝IL‑10值+3.62*CD14+巨噬细胞值，计算得到的联合检测数据y。
[0112] 1.5.2次要观察指标
[0113] (1)生存质量评分：通过生存质量量表(QLQ‑C30)的问卷调查，将量表各个领域所包括的条目得分相加并除以所包括的条目数即可算出该领域的得分RS，即RS＝(Q1+Q2+...+Qn)/n，再转化为取值在0～100间的标准化得分SS。在计分规则中规定：对于总体健康状况及功能领域方面得分越高表明功能状况或生存质量越好，而症状领域得分越高表明症状和问题越多，生存质量越差，
[0114] (2)中医症状疗效评定：根据症状的轻重程度进行评分，按主证：无症状0分；轻度2分；中度4分；重度6分。次症：无症状0分；轻度1分；中度2分；重度3分，于治疗前后观察记录，计算症状积分，按积分评价疗效。计算公式(尼莫地平法)如下：
[0115] 疗效评分n＝[(治疗前证候积分总数‑治疗后证候积分总数)/治疗前证候积分总数]×100％
[0116] ①显著改善：治疗后证候明显减少，n达到70％及以上；
[0117] ②部分改善：治疗后证候减少，30％≤n＜70％；
[0118] ③无改善：治疗后证候无减少或稍有减少，n仅在30％以下。
[0119] (3)安全性指标：按照《临床安全性评价4级评价标准》行安全性评价观察[0120] 1级＝无任何的不良反应；
[0121] 2级＝有轻度的不良反应，不需做任何处理可继续给药；
[0122] 3级＝有中度的不良反应，做处理后可继续给药；
[0123] 4级＝有重度的不良反应，因不良反应退出试验。
[0124] 1.6统计方法
[0125] 所有数据输入电脑，使用SPSS 20.0软件包建立数据库并进行分析。计量资料以均数±标准差表示，符合正态分布用t检验，不符合正态分布用非参数检验。计数资料的组间比较用t检验。等级资料用秩和检验。双变量正态分布资料相关性分析选择Pearson积差相关系数，不满足积差相关分析的适用条件时，使用Spearman秩相关系数。有序分组资料的线2
性趋势检验采用X检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。
性趋势检验采用X检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。
[0126] 2结果
[0127] 2.1芪术方组与安慰剂组外周血IL‑10与CD14+联合检测表达水平比较
[0128] 通过流式细胞术，我们得到了芪术方组和安慰剂组干预前后的外周血CD14巨噬细胞各组群百分比(见图1‑A、B、C、D)。两组患者干预前的IL‑10与CD14+巨噬细胞联合检测基线水平未显示统计学差异(P＞0.05)。经中药口服14d后，芪术方组患者的IL‑10与CD14+巨噬细胞联合检测表达排位30.12±6.57，与干预前比呈明显下降趋势(P＝0.001)，且其表达水平明显低于安慰剂组(P＜0.001)。安慰剂组干预前后IL‑10与CD14+巨噬细胞联合检测表达未见明显改变(P＞0.05)(见表4、图3‑E、F)。
[0129] 表4芪术方组与安慰剂组外周血IL‑10与CD14+联合检测表达的组内、组间比较[0130]
[0131] 2.2芪术方对不同临床病理特征的患者的外周血IL‑10与CD14+联合检测表达的影响比较
[0132] 经中药干预，II+III期患者的IL‑10与CD14+巨噬细胞联合检测表达降至30.43±6.65，呈明显下降(P＝0.018)，I期患者干预前后改变不具统计学差异(P＞0.05)；不同激素受体状态及不同HER2表达的患者间的IL‑10与CD14+巨噬细胞联合检测表达均呈明显降低(P＜0.05)，但组间未见明显差距；所有分子分型的IL‑10与CD14+联合检测表达均呈降低趋势，但仅Luminal B型患者的IL‑10与CD14+联合检测表达的下降具有统计学意义(P＜
0.05)。(见表5)
0.05)。(见表5)
[0133] 表5芪术方组不同临床病理特征的外周血IL‑10与CD14+联合检测变化情况[0134]
[0135] 2.3芪术方组与安慰剂组生存质量评分改变情况比较情况
[0136] 生存质量评分中功能量表的分值越高，生存质量越好。治疗前，两组间的各评分在干预前无统计学差异(P＞0.05)，具有可比性，其中芪术方组与安慰剂组的患者均出现如紧张、焦虑等情绪功能障碍，因此此部分评分相对较低，芪术方组患者评分为39.79±21.80，安慰剂组患者评分为34.17±24.52。经口服中药14d后，芪术方组干预后的情绪功能分值明显提高(P＜0.05)；其余功能评分均未见明显变化(P＞0.05)。(见表6)
[0137] 表6芪术方组与安慰剂组生存量表功能评分比较
[0138]
[0139]
[0140] 生存质量评分中症状量表的分值越高，生存质量越差。治疗前两组间的各评分无统计学差异(P＞0.05)，具有可比性；经口服中药14d后，芪术方组的疲劳、失眠、及总体健康情况明显改善(P＜0.05)，而安慰剂组干预后的组内、组间均未见明显差异(P＞0.05)。(见表7)
[0141] 表7芪术方组与安慰剂组生存量表症状功能评分比较
[0142]
[0143]
[0144] 2.4芪术方组与安慰剂组中医症状改善情况比较情况
[0145] 治疗前，两组间的各评分无统计学差异(P＞0.05)，具有可比性。经中药干预后，芪术方组主证的乏力倦怠、气少懒言、面色萎黄或晦暗及次证中自汗盗汗及总评分情况均的得到明显改善(P＜0.05)，而安慰剂组干预后的组内、组间均未见明显差异(P＞0.05)，见表8、表9。
[0146] 表8芪术方组与安慰剂组中医症状主证评分比较
[0147]
[0148]
[0149] 表9芪术方组与安慰剂组中医症状次证评分比较
[0150]
[0151]
[0152] 疗效评估显示芪术方有效率40％，安慰剂组有效率为7.5％，两组疗效分布也具有统计学差异(P＜0.05)，见表10。
[0153] 表10芪术方组与安慰剂组中医症状改善评估
[0154]
[0155] 3讨论
[0156] TME是乳腺癌发生、发展的重要土壤。TME与其间不同细胞群的相互作用决定了肿瘤的生物学行为。巨噬细胞是乳腺癌TME中含量最丰富的细胞群之一，约占免疫细胞数量的50％以上，其M2型巨噬细胞的极化还提示了乳腺癌更差的预后结局。本发明前期以M2型巨噬细胞作为着手点展开探索，证实了IL‑10与CD14+巨噬细胞联合检测能够反映乳腺癌患者的肿瘤负荷与肿瘤细胞增殖分化能力，对肿瘤免疫的内环境及乳腺癌预后转归有一定的提示作用，由此，本发明对乳腺癌围手术期患者进行芪术方干预，观察IL‑10与CD14+巨噬细胞联合检测表达水平的变化情况，经中药干预后，芪术方组的IL‑10与CD14+巨噬细胞联合检测表达水平明显低于安慰剂组(P＜0.05)。在对芪术方组的进一步分层分析中，芪术方对于晚期与激素受体阴性的患者的干预效果也十分明显(P＜0.05)。证实了芪术方可通过调节外周血巨噬细胞表达，影响肿瘤细胞侵袭，调控乳腺癌肿瘤免疫微环境。
[0157] 值得一提的是，Luminal B型患者CD14+巨噬细胞与联合检测表达的降低在四种分子分型中最为显著(P＜0.05)。Luminal B型常表现为ER表达较低，PR低表达或无表达，内分泌治疗并不敏感，其较为凶险的增殖率、突出的基因突变率以及内分泌抵抗等耐药特征，使Luminal B型患者在乳腺癌治疗中获益有限(Zhu YY,Zhao YC,Chen C,et al.CCL5 secreted by luminal B breast cancer cells induces polarization of M2 macrophages through activation of MEK/STAT3 signaling pathway via CCR5[J].Gene,2022,812:146100.Tran B,Bedard PL.Luminal‑B breast cancer and novel therapeutic targets[J].Breast Cancer Res,2011,13(6):221.)。不仅如此，Luminal B型还被证实其TME高表达M2型巨噬细胞，可能促成了利于肿瘤生存的内环境，导致转移侵袭(Raschioni C,Bottai G,Sagona A,et al.CXCR4/CXCL12 Signaling and Protumor Macrophages in Primary Tumors and Sentinel Lymph Nodes Are Involved in Luminal B Breast Cancer Progression[J].Dis Markers,2018,2018:5018671.)，而本发明研究结果提示了芪术方对Luminal B型乳腺癌患者外周血M2型巨噬细胞具有较突出的调控作用，可能成为Luminal B型乳腺癌治疗瓶颈的重要突破口。
[0158] 此外，生存质量评分结果显示两组患者均有一定程度的情绪管理障碍，主要表现为焦虑、紧张，心情低落等；症状量表则显示疲劳、失眠普遍存在。乳房疾患与情志密不可分，“忧郁伤肝，思虑伤脾”，郁郁不安，则肝气内结，郁而化火，肝火上扰神魂，心神失样，最终导致失眠难寐，心烦不已；思虑过度，则脾气消阻，中土不振，气血生化乏源，脉络失养而不通，正气损害，最终导致虚劳乏力，虚者愈虚，可见，诸症皆由“肝”、“脾”二脏而起。加之乳腺癌患者围手术时期气耗血伤严重，脉络受损，易累及后天之本，气血停滞、肝脾失调之征象更为显著。芪术方方中黄芪、党参补益肝脾之气，莪术、石见穿破逐肝脾之瘀，协同枸杞滋补虚劳精亏，使得脾土健运，肝络条畅，达到肝脾通调，气血荣和之功。因此，经中药干预后，芪术方组焦虑、疲劳与失眠症状得到明显的缓解。
[0159] 本发明发现，气虚血瘀证为乳腺癌围手术期患者的主要证型，中医临床症状评估结果发现术后患者气耗精伤，除气弱倦怠外，还可因水湿集聚于手术伤口，郁而化热，血热妄行，浮于皮肤，见皮瓣瘀斑红肿；脾气虚无法固摄津液，又肝火郁蒸，营卫不调，可致自汗盗汗。芪术方扶正祛瘀，方药温而不热，可滋补阴津，调和营卫。采用芪术方对症施治可明显改善中医气虚血瘀的临床症状。
[0160] 综上，芪术方能够显著降低乳腺癌患者外周血IL‑10与CD14+巨噬细胞联合检测表达，且以中晚期与Luminal B型的患者改变为著，提示芪术方可能通过干预乳腺癌患者机体内环境中的M2型巨噬细胞表达，调控TME进而改善预后；芪术方补益肝脾之气，破逐肝脾之瘀，使得脾土健运，肝络条畅，达到肝脾通调，气血荣和之功，临床使用芪术方有助于调节乳腺癌患者术后情志不畅造成的情绪管理障碍，改善以气虚疲劳、失眠、自汗等的气虚血瘀症状，提高患者生活质量。
[0161] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。