类Crustin抗菌肽及编码基因的获取方法与应用

摘要

本发明涉及由凡纳滨对虾基因组中多WAP编码基因转录并经选择性剪切产生的一组类Crustin抗菌肽的获取及其抗菌应用。该组成熟mRNA分子编码类Crustin抗菌肽LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4，分别由SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的氨基酸序列组成。本发明利用表达载体pET32a(+)和表达菌株大肠杆菌BL21，对LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4分别进行原核重组表达，并获得了具有生物学活性的重组蛋白。对其生物学功能进行体外验证，证实重组蛋白能够对多种细菌产生有效的抑制作用。

权利要求

1.类Crustin抗菌肽，其特征在于：包括凡纳滨对虾类Crustin蛋白LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4或LvTWD‑C3W2C4中的一种或二种或三种，它们分别为序列表SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示的氨基酸序列。

2. 一种编码权利要求1所述类Crustin抗菌肽的基因，其特征在于：包括mRNA序列LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4或LvTWD‑C3W2C4中的一种或二种或三种，分别为序列表SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4中的碱基序列，它们分别编码对应的类Crustin抗菌肽序列，分别为列表SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的氨基酸序列。

3. 一组权利要求1所述的类Crustin抗菌肽的重组表达方法，其特征在于：分别根据LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4中的一种或二种或三种的类Crustin抗菌肽序列信息，确定其编码碱基序列信息，设计PCR引物，分别扩增其成熟肽编码序列，构建原核表达载体，利用大肠杆菌表达体系，获得有活性的重组抗菌蛋白SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7中的一种或二种或三种。

4.一组权利要求1所述的类Crustin抗菌肽的获取方法，其特征在于：

其是由一条来源于凡纳滨对虾基因组的多WAP编码基因LvTWD，其为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列；其编码的前体mRNA在对虾体内经过选择性剪切产生一组成熟mRNA序列LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4。

5.权利要求1所述的类Crustin抗菌肽的应用，其特征在于：所述凡纳滨对虾类Crustin蛋白LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4中的一种或二种或三种在制备抑制细菌生长过程中或制备细菌的生长抑制剂药物中的应用，所述细菌为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌和大肠杆菌。

6. 细菌的生长抑制剂，其特征在于：以凡纳滨对虾类Crustin蛋白LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4中的一种或二种或三种为活性成分，它们分别为序列表SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示的氨基酸序列。

7.按照权利要求6所述的细菌的生长抑制剂，其特征在于：其中还添加有药剂学或药物学上可接受的载体或辅料。

说明书

类Crustin抗菌肽及编码基因的获取方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程，尤其是涉及一组类Crustin抗菌肽LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4的获取及其抗菌应用。

背景技术

[0002] 对虾养殖是海水养殖的支柱产业之一，随着市场对优质水产品需求量的不断增长，虾类养殖在水产养殖中占据越来越重要的地位。然而，虾类病害的爆发性流行使对虾养殖遭受了巨大损失，多种细菌病毒引发的对虾疾病频发困扰着对虾养殖业的发展。目前抗生素、激素类等药物在水产养殖上，虽然对病害控制起到一定的作用，但也破坏了水环境及动物体内的微生态平衡，使水产动物失去了正常的菌群屏障及生物拮抗作用，同时抗生素的滥用也将导致细菌产生耐药性，变异出致病性更强、危害性更大的致病微生物。因此开发特异的生物制品药物来替代传统抗生素的任务十分紧迫。

[0003] 对虾抗菌肽是一类基因编码的小分子多肽，在先天性免疫中起到了重要作用。它们一般带有正电荷，能够对某些细菌、真菌和病毒等具有较强的杀伤作用。同时，与传统抗生素相比，抗菌肽作为多肽抗生素具有无污染，针对性强，不易产生耐药性等特点，是解决对虾病害问题的重要突破口。

[0004] 甲壳肽Crustin作为甲壳动物的一类抗菌肽，作为先天性体液免疫的重要效应分子，具有广谱的抗菌活性，并可以直接杀灭病原，在先天免疫反应中起着至关重要的作用，也是近年来抗菌肽类的研究热点之一。乳清蛋白(whey acidic protein，WAP)结构域是Crustin的关键结构域，在其抗菌活性发挥中具有重要作用。在前期的研究中，申请人所在项目组从凡纳滨对虾基因组数据中获取了34条完整的Crustin抗菌肽编码基因，鉴定获得部分新的Crustin类型，并通过功能研究揭示了它们抗菌活性的作用机制。随后，发明人经过数据挖掘，进一步从凡纳滨对虾基因组中获得一条编码多个WAP结构域的基因LvTWD，其转录本可经过选择性剪切产生多种形式的成熟mRNA分子，其中一组分子编码的氨基酸序列具有与Crustin类似的结构域组成，暗示其可能发挥抗菌肽作用。

发明内容

[0005] 目的在于提供一组类Crustin抗菌肽的获取及其抗菌应用。

[0006] 本发明技术方案如下：

[0007] 一条来源于凡纳滨对虾基因组的多WAP编码基因LvTWD，具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列，其转录的前体mRNA经过选择性产生一组成熟mRNA序列LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4，分别具有序列表SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4中的碱基序列，编码的类Crustin抗菌肽序列分别具有列表SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的氨基酸序列。

[0008] 所述LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4的重组表达：根据其序列信息，构建原核表达载体pET32a(+)，分别转化至大肠杆菌BL21菌株中，鉴定阳性克隆，并通过IPTG诱导表达，通过钴离子亲和层析柱，纯化出具有活性的重组抗菌蛋白，并检测其活性；具体为：

[0009] 1.类Crustin抗菌肽编码DNA制备

[0010] 根据LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4的碱基序列信息，分别设计带有限制性内切酶酶切位点的PCR扩增引物，以cDNA为模板，经PCR扩增并进行产物胶回收，获得LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4的成熟肽编码DNA。

[0011] 2.重组表达载体及宿主菌的选择

[0012] 确定使用pET32a(+)为原核表达载体，使用大肠杆菌BL21为表达宿主菌。

[0013] 3.重组表达载体的构建

[0014] 利用限制性内切酶份额分别酶切胶回收后的LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4的PCR产物以及pET32a(+)表达载体质粒，并分别把不同抗菌肽DNA与酶切后的载体DNA进行连接，构建重组表达载体，将其转化到大肠杆菌Trans5α感受态细胞中，利用PCR技术检测阳性菌株。

[0015] 4.转化与筛选

[0016] 提取重组表达载体，并转化到大肠杆菌BL21感受态表达菌株中，挑选单克隆菌，进行PCR检测，筛选出阳性工程菌。

[0017] 5.IPTG诱导表达

[0018] 挑选阳性克隆，在LB液体培养基中过夜培养，培养液按照1:100稀释到新鲜LB液体培养基中，摇床培养至OD600约0.4～0.6，添加IPTG至终浓度为1mM进行诱导表达，SDS‑PAGE检测重组蛋白的表达形式，三种重组蛋白均以可溶形式进行表达(图1、2、3)。

[0019] 6.重组蛋白的分离纯化

[0020] 选用TALON His‑Tag钴离子纯化树脂(Clontech，美国)对重组表达蛋白进行纯化，纯化后在Tris‑HCl溶液中进行透析，获得可溶重组蛋白。

[0021] 所述的一组类Crustin抗菌肽重组蛋白对革兰氏阳性菌和阴性菌的生长均具有抑制作用。

[0022] 本发明类Crustin抗菌肽来源于凡纳滨对虾基因组的多WAP编码基因LvTWD，由SEQ ID No.1所示的碱基序列组成，其编码的前体mRNA经选择性剪切后产生了一组可翻译成与Crustin抗菌肽结构域组成类似蛋白的成熟mRNA分子LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4，分别由SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的碱基序列组成。该组成熟mRNA分子编码类Crustin抗菌肽LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4，分别由SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的氨基酸序列组成。本发明利用表达载体pET32a(+)和表达菌株大肠杆菌BL21，对LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4分别进行原核重组表达，并获得了具有生物学活性的重组蛋白。对其生物学功能进行体外验证，证实重组蛋白能够对多种细菌产生有效的抑制作用。

[0023] 本发明有如下优点：

[0024] 1.本发明中使用原核重组表达系统，获得可溶的重组表达蛋白，可以较为简单地打量制备目的活性蛋白。

[0025] 2.利用本发明中使用的重组表达载体及宿主菌，能够成功表达出具有抗菌活性的重组蛋白。

[0026] 3.本发明可开发有效的对虾细菌性疾病的防治制剂。

附图说明

[0027] 图1重组蛋白LvTWD‑C1W1C3纯化后的SDS‑PAGE电泳图。泳道1未结合蛋白，泳道2为杂蛋白，泳道3为Wash Buffer洗脱液，泳道4为纯化后的蛋白，泳道M为蛋白Marker；

[0028] 图2重组蛋白LvTWD‑W2C4纯化后的SDS‑PAGE电泳图。泳道1未结合蛋白，泳道2为杂蛋白，泳道3为Wash Buffer洗脱液，泳道4为纯化后的蛋白，泳道M为蛋白Marker；

[0029] 图3重组蛋白LvTWD‑C3W2C4纯化后的SDS‑PAGE电泳图。泳道1未结合蛋白，泳道2为杂蛋白，泳道3为Wash Buffer洗脱液，泳道4为纯化后的蛋白，泳道M为蛋白Marker。

具体实施方式

[0030] 下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

[0031] 实施例

[0032] 一组类Crustin抗菌肽LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4及其编码基因，具有如下序列：

[0033] (1)SEQ ID No.1的信息(参见序列表)

[0034] (a)序列特征

[0035] *长度：11907碱基对

[0036] *类型：核酸

[0037] *链型：双链

[0038] *拓扑结构：线性

[0039] (b)分子类型：DNA

[0040] (c)假设：否

[0041] (d)反义：否

[0042] (e)最初来源：凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

[0043] 序列描述：SEQ ID No.1

[0044] ACAAGTGAGGATCAAGATGCGCACCGGCACTCTCCTGCTGGTGGTGGCGGCTGCCCTCTCCGCTGCAGCACAGGGTGAGACTTAAAATAAAATCTAGATAAAAATCACGTTAACGATAGTACTAATATTGAAACAAAATATACAAATGAGTAAATATATAAAATCTAAATAAAAGTCACGTTAACGATAGTACTCATAATGAAGCAAAATAAACAAATCAGTAAATATTTAAAATCTAGAAAAAAATCACGTTAACAATAGTACTCATATTGAAACAAATAATGTAAATGAGTAAATACACGTAAAACAGTTGATCATGAGATAATATTAAGAATTTTGAAAATTACGAATAGAGGCTTGGAAGTGAGAATATGTGTGGAAAGTCAAGAATCAGAATACATACCAAAATAACGGTAAACAACATAGAATCCGAGGAAACTTTTGTTTAAGGAGGAAAGAATATGAATATAAGATATTAAAAATAGAGACTTTCGATAAAAAAAAAATGATTAATGGTTAAAAGCAAAATAAATGTGCTAGACATATAAGGTCATATAACACTATAGGAAGGTACAGCAAAAGGGTAGTGAAGTTAGAAACAATAGTAACAACAATAGTTAGTGAGTTAGTAGTTAGTTGCTATGCGTCAAATATGTAGAGCAGAGGTTCTCAACCTTTACTAGTTAGTGGCGCACTAAGGATATAGCCTGGACTTCGACGGCGCACAAACTATACAGTAATAATAATAATGATAAGTAATATTATTATATCTATTACCAATATCATTATTGTTGTTTTTATTATCATATATATGAGAATGAATTAATGAACACATGGGAATGAAATATATAATTCCAGTTGTAGATTAAACATACATGATTAATGGGACACTTGCGCTTGTCTGGATTTGCATATCCTTTCGATGTCATGAGGAAAAAATAATTGTGAAAATAAGGCGGCTAGAAGCAAGGCACAAATTCAAGACATAACTAGATATTCATTAAATTTTCGCGGCGACCTTGAGGGATGGTCGCGGCGCAGGTTGAGAACCACTGACCTAGAGTAATATTGAAAAGGTTAAAGATGGGTAAAGGAGTTGAGTGAATGGGTTACGGTGGGGTTAGGCAAGGGGATTAGATCAAGTGAAGGATATGTATAGTCTGAGGAAGGAGAACAGGTTGTCAAAGCAGAGGAGGATGCGTAGGAAAAGTCTCTTGGGAGGCAGAGAAGGGACGGGTTATACGGAGAAAGGATATGACGAAGGCCAAGTCTGTGAGAACGGAAACAGCGAATATTCTAATGCAGGAGAGCTATTGCTTAGTTAAAGGATATGACGAAGATCAGGTCTGTGTGAACGGAAACCGGGAATTATTACTTTGTTGATCTACGAGTGATAACGGTTACAGTTTGGAGAATTTGAAGGGAAAGGAACTAGGGGGTGAGAAAAGGAATTAGAGTGGGGGGGGGGGTAGTATCAGGAGGGGTATTAGGAGGTGGAGGATCTGGGGAAGGGTATAGTTGTGACATAAGGGGTTCACGTGTGTATCCAGGAGGGAATGGGAGGGATAGAGGGGATGGAGGGAGGGTTGATGTAGTTGGAACTGAGGGGGATGGGCTGTGTTGGGAGGGAGTAGGAGGAAGAGGTGTAGGAGGAATATGAGTAGGAGGAGGATGGATACCGGCAGTCACTTTGAGGGTGGAGGGAGCAGGAGTTGTGGAATTTTAGGGTGGGTGAGGGTTTTCGGTGTCATTTTGGGACTCGAGCAGATAGTTCTGAATGTCTTCAAGGGTTTCTGAAACGTAGTCGGCCGGGGAGTGTTGTGAGACAAAGGTTTTCTCATGAGGGGGGGGGGGGGGGAGAGAAACTGGTGTCTGAGGAGTGGAGGCAAAGGTAGGTGGAGGTGAGAGTGTGGTAGAAGTATGAGAAAAATCCCGTCGACGTGCTTCCTGTCTGGGTTCACGCAGAGTGAGACCAAGTCTGTATCTGAGAGTTGCCACCTCAGACTCAAACTTGTAGGTGGGGCAGCCCCTATAAAATACATTATGGGGGCTGCCGCAGTTAGCGCATGTGCGTGACTGCGCAGAGCAGATTGATCGGTTATGACCAGGTTGTGCACACAGAGGGCATCGGGCTGTGGGACGGCAGTGTTTGGCAGAATGTCCTTAACGCCAACAGTTTTAACATTGACGGGGAGGATGTTGATATGATCGGACAGGGAGGGATTCTCCACCAATGTAGACATTAAAGTGAAGGTCATGTCTACGGAAAGTAATTTTGGCAATGTTGGTGGGGTTCTTACGATGAATTTTAGGAGGAATGAAGTAGCACTGTACTGTTCGTACATCATCGTCCGCGGCTCTCACACCTTAGGAAGTAGGTAGTAGAAGGGGACGGAGAAGGGACAGAAACGAAAAAGCAGGAGGGAGAAAAGACCTTGCAAAATTAGTTGAGTCGAGGGCTGAGGCTCAAGGGAAGGGAGATCCCCAGCAGCATTGGGCCCCAGTCCTCGCCTTCCAAGCCCCCTCACGACAACAAAGGGTAAGGGATTGGGGGGGAGGGGGGTCGACAAAAAAAAAAAAAAAACGAAAATGTTGTACGAGAGGAGAGGGGAGAAGGGAGAGTGTAAATCTTGAACGGTTTTCGAGAGATCATATCATATCAATTTTTTTTTATTCTACCAGTTCCCCCATCCCCTCTCATTTTTGACCAATATCTACGTCATATTATCTCTATGCGTATCTATGCTAAAACATTATTCTCTTGACATTCATATTCACAATTTTCTTTTTTATTTTCCGTACAACTACAGAGGGCATCCCGACAGAAGGAAAACTTACACCAACAGGTAAGACTCATAATGATAATGAATAACATAAAAATGAATAAAACAGGATGTGATGATACAAAAAATAAACCCACTTATTAATAGGTTTAATAATTTGCATACAATTCTTGACATGTTTCAATTCATTATGATTAAATCTTAAAAGTATGACAATGGCACAAAAAAAAAAAAAAAATAATAATAAATAAATAAATATGGCGAACTACAATTTTGTGTTTGTTTGTTTTACAGAAGCTCCTCGAGAATTCCAGACTCTCCCCCCTAGCAGTAAGTCAATATACATCAATTAACAACTGATGATAATTATCCTTATTATGATTATCATCATTACTTTTATCCTTGTTATTATTATTATCATTATTGTTATTATCATTACTATTATCATCAGCATTGTTATTATCATTATTATTATTATCATCATCATTATCATCATCATTATCATCATCATTATCGTTATTATTATTTCTCATTATTTTATTATTATTATCATTTATCATTATATTATAGTTATTTGATTTTATTCCTATTATTATTATTCTATTCCTATCATTATCATCATAATTGTATACCTATTATTAGTAGTATTATCATTACTAATATCATTATCATTATCATAGTAATTAGCATCTTATTATCATCATACATCTGCCACACAATAGTAAATGGTCTAAGGGGATGTTATTTTCTCTAATTTATTCTCTAATTCTATTTGTTATACCGGATGTATTTATTTATTTAATTTAAGCATTTTTTTTATCTAATTTCATTTTGATTTACCGAATAAGATTTTTGTAGCCTCTTTTTATCTGATTTCATTTTCATTTAGCGAATAGATTTATCTTTTGTATTTTCTTTTCTCTAATTTTATTTTCATTTACTCAGCCGTCAAGCAGTAAGTCAGTGTACATAGTTTAATAAATTATTATTATCATTATCATCATTGTGCTATCATGGAATACGGTCTTAAACTTTGATCAAAAGTCTTAAGAGGTCTGAAAGTGAATAAAACATTTTTGTAAAATATTCCAACTCTCTTCTCTTCCTTTTTTTTCAATTTACTATATAATTATTGACATTTTTCTTCCTATATCATTTTTTTCAGATTGTCGCTACTATTGCGCTTACGAAGGAATTGCGTACTGCTGCGATGATGGCACTAGACCTAGTAAGTGAAAAAGAAATGTGTATATATATATGTATATCTGTCTATCTATCTATCAGTCCGTCTATTCATATATGTGTGTGTATATACATTATTTTCTGTTCTTTTTTAATATACATCAAAAGAACTTATCACTTATATAGTGGCGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCATAATCATCATTTCATCATAATAAAAAATAGCATAATTATTTATCTATCATCATCATCATCTATTATCATTATTACCATTATCATTATTACCATTATCATCATAATTATCAACACTTTGTCTCTTCCAGTTCCCCCAGATCACGATGAGAATGCAGGTACTTGCGTCGAAATTGAAGAACATATTTGTGAAAAGGATGCCATCTACTATAACGTCACTGACAGTGTAAGTCCCTCAGATTTAAAAAAAAGAAAGAAAGAAAGAAAAAAAAGAAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGGAAAGAAAGAAAAAAAAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAAGAAAAGAAGAAAGAAAGAAAGGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGGAAAAGGAAAGAAAGAAAAGTGTATCCGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTTGAAAGTCTTTGTTAGATTTGTGTTGTCTACACACAAATACCCGCACACATTCACATACACACATACACACGCACATAGATACCCACATACACAGATACCCGCACACACACACACAGATACCCACACATACATACAGATACCCCTCACACACATGCAAATACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGATACCCACACACACACACAGATACCCGCACACACACAGATACACACTACACACACAGATACCCGTACACACACACAGATACACACACAGATACCCGTACACACACACATACCCGCACACACACACATACCCGTACACACACACACACAGATACCCGCACACACACACATACTACACACAGGATACACACACACACATTTCTACACATTCTCCATCTATTGTTCTTCAGACTGGCGCGAACACGACGAAGCAGCTGTTCTCGGCTCGCCAACGGCCACGCCCCCTGCGCCTCCGACGGCTACTGCGCCGAGGACGAGAAGTGCTGCCCGACGCCCTGCGCCAGGAAGCACCTGTGCCTCGCCGCCGCAGCACAGGGTGAGGTCTCGAAAGTTTATTTATTTGTTTATTTATCTATTATTTATTCATTTTATTTATTTTTATTTTATTTATTCATTTATATTTATTTCATTTATTTAATTATTTATTTATTTTTATTCATTTATTTAATTATTTATTTATTATTTATTTATATTTACTTATTTATTTATTTATTTGTTTTTATTTCATTTATTTTTTTATTATGATTCATTTATTTTTTTAGAAGGACATGTGTAATAAAAGGATTGATGATCAAAGGAGACGAGGCAGAATAGGAGAGGATTCTGACGTGGGAATGAAGCACAGGGAAAAATTATTCTAGAATATTTTTTTAGAATTAGAATCAAAATTTCCTTTTTCTACTTCCTTTAACCTCTTCCTCTATTTTGATTATGCTCTCTACAAATATTTTGACTTTTTGTCGTGATGATAAACAACATTTTATTTTTTTATTTCTTTCTTAAATTTGCAGAAAAATATCCAGTCACAGATACGCCTCCAGTAACAGGTAAGACTAAAATAAGAGAAACTGAATATATGTATACTTATACAGTACATATATCACATTGTATATTTTCTACAATAATGAAAAACATATTTATATTCCATATATTAGTGGAATACATTAGTTAAATCGGAGAATAACTCAAATACATGCACTCGTGGAGGACTACATAAAAAAAAAATTTGACTTTGAACACAAAGCACTTAGCTATGTTGCCTTTTCTCTAAATTCATGGGTTATTTTTTTCGTCTCGCAAAATACACCGAGTTAGAAATAAACCCATTTTACTCTTATTTTCCTGATTTTTTATTCATTTACATATTTATTTATTTATTTTCCTGATGTTTTATTTATTTATATATTTATTTATTTATTTATTTATAGCCTGTCGGTACTACTGTGGCTACGCGGGGGTTAGCTACTGTTGCGACGGTGGACTCGCGCCCGGTCTGTTTCCTATTTTTCTTTCCTTCTTATTTTTCTTTCTTTCTTACTTTTTTTTCTTTCTTTCTTTTTTATTTTTCTTTCTTTCTTTCTGTCCTTCTTCCCTTTTTTTCCTCCCTCCCTCTCTCTCTCTCTGTCTCTCTGTCTCTCTCTGTCTGTCTGTCTCTGTCTCTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCACACACACACACACACATATATAATGCATACACACGTATGTATGTACATAGATACACACGTGTATATGTATATATTTCTGTGTATGTGTGCATATATATATATGTTATACTCATTTCTGTTTGATTAGGAAAACAGAAAATTACATTTACTCTATTAGTGGAATAGACTAGACAGAAATATCAGAGAATGACTCAATTTCACCCTCTAATGGAATATTACATTGACAACTTTTGCTTTTGTTTGACAGATTTCCGCCGCCAATACCCAACTCAGCCGCCAAGCAGTAAGTCAATGTGTATAGTTTAGCAAATGATTATTATTATCATTATCATCTTTGCACTAGCCTGGAATACGGTCTCAAAGTTTGATCTAAATTCTTAGAGGTCTGTAAGTGGATTGAATATTTTTGTAAGATATTCCAACTCTCTCTTCTCTTACTTTTTATTCAATTTACTATATATCTATTGACATTTTTCTTCCTATATCTTTTTTTTTCAGATTGTCGCTACTTCTGTGGCTACGAGGGAGATGCTTACTGCTGTGACGATGGCACCAGACCCAGTAGGTGATGCTCGTCTTTGCAAAAAAGAAAGAAAGAAAGAGAAAGATAATAATAGAAAAATAAAATAAATAAATATCAATTAAAATTTAAAAATGATAATACAAAAATAGAATAAATAAATAAATATGAAAATAAAAAAGATCATAATACAAAATTAAGATAAATAAATAAATATGACAATAAAAATAAAATATGTTTTCTAAAAAGACCATTGCCTATTGCCGTACCTGTTCAGATAACTTTAGATCGTGTCTTCTCTATACATATATCCTTCTCTTTTGTTGTGTTGTCTCTGTCTCTTTCGTTTCCTCTCACTCCCTCTTGATTGCCCCTTTGAAAGTTATTATTCTCGTTGCCTCTTACAGTTCCCCAGGATCACGATGAGAATGCAGGTGTTTGTATCGAAATGAGCGAACACATCTGCGAGGATGACGCCATTTACTACAACACTACTGATGGGGTAAGTATAGTACTTATATGATACGTATGAAATTTAGACAACCAGAGTCTACTGAGGAAAAAATACTTGCAAATCTTACACACACTGCAACAGGAACAACGAAGGGAAGGACAAAAAAATACACGAATAGGCCCATATTCGTGTGTTTTCCTGTCCGTCATGAATTCCACACATACACACACATGTACACAAAGGGAGATTCAGGGAAAGACACGTTTATACCGAAGGTTTTTTTCACGTTATTGTTTCTTCATGCTCTGAAGAAGCGCTATGAAGGCCTTGGGTGTGATCTCAGGTTTCCGTTTTTTTCCTTTTTTTCATAACTTACTCATCATCAATCTTCTACACACTCACGCACATAAAAACCGTACAAACACACACTTAAAACACCCGCAAACATACACGCACAAAACACCCGCACACATACACACCCACAACATCCACCCACACACATATTTATACACATTCTCCATCTATTGTTCTTCAGACTGGCGCGAACACGACGAAGCAGCTGTTCTCGGGCTCGCCAACGGCCACGCCCCCCTGCGCCTCCGACGGCTACTGCGCCGAGGACGAGAAGTGCTGCCCGACGCCCTGCGCCAGGAAGCACCTGTGCCTCGCCGCCGCAGCACAGGGTGAGGCCTCGAGAAAGCTCATTAGAGGAAATAAGAGAGTTATTGGGGATGAAATTGAGGTTTCGGATAAAACAGGATTGTTTTAGGTGCCACCCCCCCCCCCCCTAGCACCACCAACCTCAACCCTCCTTCTCTGTCATATTGTAGGAAATGTATTTTGTTTTATTGTCAGTATGTTTGACTCCGTTAGTACCTACGTTTATTTTTTATTTATTTATTTACAGAGAATGCCCCGATAGAAAAGGCCCCTACGGCAGAAGGTGAGACTCGTAGAAATAAATAGAAAATAAGGAAACGGAAAAATTACGCATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAACACACACACACACACACACACACACACACACACACACCACACACATATACACTCACACAAACGTGCCTGTGAGTATATGTCACATCCGAACTTATTTTTGCTTGATAATGAATAACACTGCAGGAGTTACAACTGATAAAGTAATTTGTGAAAGAAACAAGTCTGCAATAAAAATAACGCCTTTGTTTCTTCCGACAGACGACCTTCTCGAGTTTCCGACTATCCCGCCGAACAGTAAGGCGTTCTATTATACATTATTTACAATACTTATTTCAACTTATAATCAAACAATGATATTCAGGATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCAAAAATTTCTGAAAAACTCCAATTATGTGTATTTTCATTACTCTGTTGAATTAAATAGTCTAAAATCAGTGATTTAAATGCACAGTACAAAAAAAAAAAAGTTGCTATTCAAGATCGAAAGCAGAGTGGGATTAAATGGTTCAAGTAATAGAAAAAAAACTAAATTGACTGAATTAAAGTAATAATAATAATAATAATGATAATAATAACAATAATGATAATAAATAAAAGTTCAAGTATGCCAAAGGTTTCTCAATTTTCTTCAACAGCCTGTCGCTACTACTGCAGCTACGATAATACCGTCTACTGCTGTGACGATGGCACCAGACCTCGTAGGTGGTATTGTATTTGTATTAAGCCAGGGGAGGCCAGCCTTTTGTGGGATACGATCTATTCTATCTACAATTACCCTGATGCGATCTACCAGCCTAAGAGTCAAACATAAATAATTGTATGTTGTTCAGACATATCCGCCATTATGAATATAAATATAACTTATTCCCAGAAAAGAAAAGAAATATAATAATCTAATTATCATTCGTGCTCGGATATGATATTGAAGCTATTTACATGGCAACTTCTGAAGGCCGAATTATTAACAGGTACAGTAGTGTGATCGACTTAGAACAGGCTTGTGACCGACTGGTTGGCCAACCGTTGCGTTAACCCGTGCGTGCGTGCGTGTGTGTTCGTACGTACGTGTGTGTGTGTGTGTGCGTGCGACTGTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCATCTTTTTAAGTTCCCATCTCCTTGAGCAACTGTTTTTCTCTCTCTCTTTTCAGTTCCTCCGGATCACTATGCCCACCAAGGAATGTGTGTAGCTAAGGAAGAACACATCTGCAAGAGTGACGGAATCTACTATAAGGTATGTCGCTAGATACAGTAACTGCAGGACATTCGGTGTAACTTTCTTTCTAAAGTCTAAAGATAAAAAGAAATATAACCATTTTGTGAGAGTATGACCATAGAAAGACAATGGTCAAACACACCAGTATGTATGTGTGGCTAATAGATAAATAGTTAATGAAATGAATAATGATAAAAAGACATAGATGTATACATGTATTTATACACACACACACACACACGTAAATGTATGTCTATGAATGTATACTCATACACACAAACCTCGTTACTCAGAGCGAGAAAGCCACGATCGAGAAATTGTTCTCGGGCTCGCCAGTGACCACGCCCCCCTGCGCCTCCGACGGCTACTGCGCCGAGGACGAGAAGTGCTGCCCGACGCCCTGCGCCAAGAAGCACCATTGCCTCAAGTATGTGCCGTATCCAAGCAGCTGCCGTTACTACTGCTTCTGGGACAGCGAGAGCTACTGCTGCGACGATGGTAGTTTACTAGGTGAGCTAGTCAACTGTCTATAGGATTTTTTTCTTATTTTGCCTTCATTCTTATTCTTATTTCTAATGAATATTTTGTATGTTTATTTTGGCGAGAATGCCAGTATGTATTATAACTCCATCTGTAATTTATCAACATTGTTATTATCTTCAACTGAATGAATCAAAATCCCACTGGAATCAATATGATAAAAAAATATATCAGAGAAACCTGAATAAGCAGTAATTAATAAGATAATCCAAAATATGACGAGATAACCTCCGATCTCTAGCGCCATTAACTAACACCCCCCCCTCCTCCCTCCCTCCCCCCTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCAGAACCCAAGAACCATGACGACCACGAGGGACTCTGCCCCAAGATCGAGGATGAAGACTGCGACGGAGACAGGGAAGTCCCGATCAAGTTTGGGGTAAGTTCTCAAAACTGTTTTAGGGGATGTTTAATGCATGAACCTTCGGGTTTCTTTCGGTTGAACGAAGGCATTGTGCAACACACATACACACATATATATGTGTGTATATGTATATGTATACTTACATATACATACATGCATACATACATATATGAGTGAGAGAGTGATTAAGTGAATGGGTGCGCACCCGCGTATGTATATTATAGAAACATAAATTTACGATTCCCAACAGACTTTAATAAAACTTTCTCGTTACACAAAGTATGCCACATAACACCCACCTCTCCGTTCCAGGACAAAGGCTACAAGCAGAAAGCCGCCGCCTGTGCCTCCGACGGGTACTGCGCGCGCGACGAGAAGTGCTGCCCCAGCAAGTGTGCGCAGCGCCACGTCTGCCTCAAGGCCAACCGCATCGTGGAGGAGATCGACGGGAGTGGAGGAGCGCAGGAACTCGATTTTTAAGTTTCAAGTGCAACCGATGGGCGCCATGTTCAGGGAGGAGGAGGAGAAGGAGGAGCCAATAGAGGAGGAGGACGCGGAGAAGGAAGAAGTAGGGGAGGATGAGGATGAGGTGGAGGGGGAGGACGGGGAGAAGGAGGAAGTGGAGGAGTAGGTTGAGGAGGAGGATGGGGAGAAGAAAGTGGAGGAAGAGGACGGGGAGGAGAAAGTGGAGGAGGAGGACGGGGAAGAGAAAGTGGAGGAAGAGGAGGAGGAGGAGGAGGACGGGGAAGAGAAAGTGGAGGAAGAGGAGAAGGACGTGGAGCTGGAGGAAGAGAAAGAAGTGAGAATTGAATGGTGTTTAAGACGAAGACGGAGAGGATAGAAGATGAGAGGAAACGAATTGCAAACAGGAACGCAGCTCAGAAGCGAGTGTGGATTCGTTTGCAAAAATCTCTATAATGCGTAGATAGGAACAAGTTCTTGGTGATGCAGAGATGAAAAGCATAAATGTAACGCTTAGATAGAACTGAAATATGGTGACGCTGTCGGTTACATTTTTTATCTTTATGTAGATTCTTAGCGATGTAAATTCAGTGTAAAATTTGCACTTCTTGTGATTCATGTCATTAGTGCACACTGTTGAGCAAGTTTGCTTTTATGTTTGTTGAAGATTGTGAAATA

[0045] (2)SEQ ID No.2的信息

[0046] *长度：849碱基对

[0047] *类型：核酸

[0048] *链型：双链

[0049] *拓扑结构：线性

[0050] (b)分子类型：cDNA

[0051] (c)假设：否

[0052] (d)反义：否

[0053] (e)最初来源：凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

[0054] 序列描述：SEQ ID No.2

[0055] CATACTCGAAAAGACAAGTGAGGATCAAGATGCGCACCGGCACTCTCCTGCTGGTGGTGGCGGCTACCCTCTCCGCTGCAGCACAGGAGGGCATCCCGACAGAAGGAAAACTTACACCAACAGAAGCTCCTCGAGAATTCCAGACTCTCCCCCCGAGCAATTGTCGCTACTATTGCGCTTACGAAGGAATTGCGTACTGCTGCGATGATGGCACTAGACCTATTCCCCCAGATCACGATGAGAATGCAGGTACTTGCGTCGAAATTGAAGAACATATTTGTGAAAAGGATGCCATCTACTATAACGTCACTGACAGTACTGGCGCGAACACGACGAAGCAGCTGTTCTCGGGCTCGCCAACGGTCACGCCCCCATGCGCCTCCGACGGCTACTGCGCCGAGGACGAGAAGTGCTGCCCGACGCCCTGCGCCAGGAAGCACCTGTGCCTCGCCGCCGCAGCACAGGAAAAATATCCAGTCACAGATACGCCTCCAGTAACAGATTTCCGCCGCCAATACCCAACTCAGCCGCCAAGCAATTGTCGCTACTTCTGTGGCTACGAGGGAGATGCTTACTGCTGTGACGATGGCACCAGACCCATTCCCCAGGATCACGATGAGAATGCAGGTGTTTGTATCGAAATGAGCGAACACATCTGCGAGGATGACGCCATTTACTACAACACTACTGATGGGACAGCGAGAGCTACTGCTGCGACGATGGTAGTTTACTAGAACCCAAGAACCATGACGACCACGAGGGACTCTGCCCCAAGATCGAGGATGAAGACTGCGACGGAGACAGGGAAGTCCCGATCAAGGCTGGGGACAAAGGCTACAAGCAGAAAGC

[0056] (3)SEQ ID No.3的信息

[0057] *长度：1366碱基对

[0058] *类型：核酸

[0059] *链型：双链

[0060] *拓扑结构：线性

[0061] (b)分子类型：cDNA

[0062] (c)假设：否

[0063] (d)反义：否

[0064] (e)最初来源：凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

[0065] 序列描述：SEQ ID No.3

[0066] ACTCGAAAAGACAAGTGAGGATCAAGGTGCGCACCGGCACTCTCCTGCTGGTGGTGGCGGCTGCTCTCTCCGCTGCAGCACAGGAGGGCATCCCGACAGAAGGAAAACTTACACCAACAGATTGTCGCTACTATTGCGCTTACGAAGGAATTGCGTACTGCTGCGATGATGGCACTAGACCTATTCCCCCAGATCACGATGAGAATGCAGGTACTTGCGTCGAAATTGAAGAACATATTTGTGAAAAGGATGCCATCTACTATAACGTCACTGACAGTACTGGCGCGAACACGACGAGGCGGCTGTTCTCGGGCTCGCCAACGGACACGCCCCCCTGCGCCTCCGACGGCTACTGCGCCGAGGACGAGAAGTGCTGCCCGACGCCCTGCGCCAGGAAGCACCTGTGCCTCGCCGCCGCAGCACAGGAAAAATATCCAGTCACAGATACGCCTCCAGTAACAGATTTCCGCCGCCAATACCCAACTCAGCCGCCAAGCAATTGTCGCTACTTCTGTGGCTACGAGGGAGATGCTTACTGCTGTGACGATGGCACCAGACCCATTCCCCAGGATCACGATGAGAATGCAGGTGTTTGTATCGATATGAGCGAACACATCTGCGAGGATGACGCCATTTACTACAACACTACTGATGGGACTGGCGCGAACACGACGAAGCAGCTGTTCTCGGGCTCGCCAACGGCCACGCCCCCCTGCGCCTCCGACGGCTACTGCGCCGAGGACGAGAAGTGCTGCCCGACGCCCTGCGCCAGGAAGCACCTGTGCCTCGCCGCCGCAGAACAGGAGAATGCCCCGATAGAAAAGGCCCCTACGGCAGAAGACGACCTTCTCGAGTTTCCGACTATCCCGCCGAACACCTGTCGCTACTACTGCAGCTACGATAATACCGTCTACTGCTGTGACGATGGCACCAGACCTCGTAGGTGGTATTGTATTTGTATTAAGCCAGAGGAGGCCAGCCTTTTGTGGGATACGATCTATTCTATCTACAATTACCCTGATGCGATCTACCAGCCTAAGAGTCAAACATAAATAATTGTACGTTGTTCAGACATATCCGCCATTATGAATATAAATATAACTTATTCCCAGAAAAGAAAAGAAAATAATCTAATTATCATTCGTGCTTGGATGTGATATTGGAGCTATTTACATGGCAACTTCTGAAGGCCGAATTATTAGCAGGTACAGTAGTGTGACCGACTTAGAACAGGCTTGTGACGCCTCCGACGGCTACTGCGCCGAGGACGAGAAGTGCTGCCCGACGCCCTGCGCCAGGAAGCACCTGTGCCTCGCCGCCGCAGCACAGGAGAATGCCCCGATAGAAAAGGCCCCTACGGCAGAAG

[0067] (4)SEQ ID No.4的信息

[0068] *长度：872碱基对

[0069] *类型：核酸

[0070] *链型：双链

[0071] *拓扑结构：线性

[0072] (b)分子类型：cDNA

[0073] (c)假设：否

[0074] (d)反义：否

[0075] (e)最初来源：凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

[0076] 序列描述：SEQ ID No.4

[0077] CATACTCGAAAAGACAAGTGAGGATCAAGATGCGCACCGGCACTCTCCTGCTGGTGGTGGCGGCTGCCCTCTCCGCTGCAGCACAGGAGGGCATCCCGACAGAAGGAAAACTTACACCAACAGAAGCTCCTCGAGAATTCCAGACTCTCCCCCCGAGCAATTGTCGCTACTTCTGTGGCTACGAGGGAGATGCTTACTGCTGTGACGATGGTACCAGACCCATTCCCCAGGATCACGATGAGAATGCAGGTGTTTGTATCGAAATGAGCGAACACATCTGCGAGGATGACGCCATTTACTACAACACTACTGATGGGACTGGCGCGAACACGACGAAGCAGCTGTTCTCGGGCTCGCCAGTGACCACGCCCCCCTGCGCCTCCGACGGCTACTGCGCCGAGGACGAGAAGTGCTGCCCGACGCCCTGCGCCAGGAAGCACCTGCGCCTCGCCGCCGCAGCACAGGAGAATGCCCCGATAGAAAAGGCCCCTACGGCAGAAGACGACCTTCTCGAGTTTCCGACTATCCCGCCGAACACCTGTCGCTACTACTGCAGCTACGATAATACCGTCTACTGCTGTGACGATGGCACCAGACCTCGTAGGTGGTATTGTATTTGTATTAAGCCAGGGGAGGCCAGCCTTTTGTGGGATACGATCTATTCTATCTACAATTACCCTGATGCGATCTACCAGCCTAAGAGTCAAACATAAATAATTGTACGTTGTTCAGACATATCCGCCATTATGAATATAAATATAACTTTTTCCCAGAAAAGAAAAGAAATATAATAATCTAATTATCATTAGTGCTCGGATATGATATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACCTGCCCTTTTT

[0078] (5)SEQ ID No.5的信息

[0079] (a)序列特征

[0080] *长度：234氨基酸残基

[0081] *类型：氨基酸

[0082] *链型：单链

[0083] *拓扑结构：线性

[0084] (b)分子类型：蛋白

[0085] 序列描述：SEQ ID No.5

[0086] MRTGTLLLVVAATLSAAAQEGIPTEGKLTPTEAPREFQTLPPSNCRYYCAYEGIAYCCDDGTRPIPPDHDENAGTCVEIEEHICEKDAIYYNVTDSTGANTTKQLFSGSPTVTPPCASDGYCAEDEKCCPTPCARKHLCLAAAAQEKYPVTDTPPVTDFRRQYPTQPPSNCRYFCGYEGDAYCCDDGTRPIPQDHDENAGVCIEMSEHICEDDAIYYNTTDGTARATAATMVVY

[0087] (6)SEQ ID No.6的信息

[0088] (a)序列特征

[0089] *长度：149氨基酸残基

[0090] *类型：氨基酸

[0091] *链型：单链

[0092] *拓扑结构：线性

[0093] (b)分子类型：蛋白

[0094] 序列描述：SEQ ID No.6

[0095] MSEHICEDDAIYYNTTDGTGANTTKQLFSGSPTATPPCASDGYCAEDEKCCPTPCARKHLCLAAAEQENAPIEKAPTAEDDLLEFPTIPPNTCRYYCSYDNTVYCCDDGTRPRRWYCICIKPEEASLLWDTIYSIYNYPDAIYQPKSQT

[0096] (7)SEQ ID No.7的信息

[0097] (a)序列特征

[0098] *长度：227氨基酸残基

[0099] *类型：氨基酸

[0100] *链型：单链

[0101] *拓扑结构：线性

[0102] (b)分子类型：蛋白

[0103] 序列描述：SEQ ID No.7

[0104] MRTGTLLLVVAAALSAAAQEGIPTEGKLTPTEAPREFQTLPPSNCRYFCGYEGDAYCCDDGTRPIPQDHDENAGVCIEMSEHICEDDAIYYNTTDGTGANTTKQLFSGSPVTTPPCASDGYCAEDEKCCPTPCARKHLRLAAAAQENAPIEKAPTAEDDLLEFPTIPPNTCRYYCSYDNTVYCCDDGTRPRRWYCICIKPGEASLLWDTIYSIYNYPDAIYQPKSQT

[0105] 一组类Crustin抗菌肽的获取及其抗菌应用：

[0106] 针对凡纳滨对虾编码产生的LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4序列信息，设计PCR引物，分别扩增其成熟肽编码序列，利用大肠杆菌表达系统，获得了具有活性的重组抗菌蛋白。具体如下：

[0107] 1)成熟肽编码序列扩增

[0108] 根据LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4的序列信息，分别设计两侧分别带有限制性内切酶BamHⅠ和Hind III酶切位点及15bp同源臂的PCR引物(表1)，使用Premix TMEx Taq  Hot Start Version分别扩增其成熟肽编码序列，PCR反应体系及反应条件：

[0109]

[0110] 反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50/52℃(此处对应温度见表1所示)退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。取2μL PCR产物，用1％质量浓度的琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，将大小正确的SteadyPure PCR反应液纯化试剂盒(艾科瑞，湖南)进行纯化。

[0111] 表1不同剪接体引物序列

[0112]

[0113] 2)重组表达载体的构建

[0114] 利用BamHⅠ和Hind III内切酶，双酶切pET32a(+)表达载体质粒，并利用In‑Fusion连接酶(TaKaRa)，分别将目的基因片段连接于酶切后的表达载体pET32a(+)中，转化到大肠杆菌宿主菌Trans5α中，过夜培养，分别挑选单克隆用通用引物T7(F：TAATACGACTCACTATAGGG；R：GCTAGTTATTGCTCAGCGGT)进行PCR检测，并送样测序，确定重组质粒。

[0115] 3)转化与筛选阳性菌

[0116] 分别利用天根质粒提取试剂盒(DP106，天根)，提取重组质粒，分别转化至大肠杆菌宿主菌BL21中，涂布Amp+终浓度100μg/mL的LB培养平板，37℃过夜培养，并挑选单克隆菌株，测序并筛选出阳性克隆。

[0117] 4)IPTG诱导表达

[0118] 将测序成功的阳性克隆菌液分别接种于氨苄抗性(Amp+,100μg/mL)的LB固体培养基上，220rpm、37℃过夜活化，然后按体积比1:100接种于新鲜的氨苄抗性(Amp+,100μg/mL)的LB液体培养基中，220rpm、37℃继续培养至OD600为0.4‑0.6时，每个菌株取2管菌液，一管加入终浓度为1mM的诱导剂异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(isopropylthio‑β‑galactoside,IPTG)，另一管作为对照组不加诱导剂。在0h、2h、4h、6h取样，每个样品1mL。室温8000rpm离心2min沉淀菌体，加入1mL PBS缓冲液重悬，8000rpm离心2min去除培养基杂质，清洗2次；去除离心后的上清，用500μL PBS缓冲液重悬菌体；用超声波细胞破碎仪(新芝生物，宁波)进行超声破碎细胞；4℃，12000rpm离心5min，分离上清和沉淀，沉淀用200μL PBS缓冲液重悬；分别将上清和沉淀与30μL 4×SDS‑PAGE上样缓冲液(P1015，Solarbio)充分混匀后100℃煮沸10min；4℃冷却5min后进行SDS‑PAGE，用考马斯亮蓝染色，脱色后通过GelDocTM EZ Imager成像系统(BIO RAD，美国)检测蛋白的表达。

[0119] 5)扩大培养纯化

[0120] 将构建的菌株按体积比1:100接种量接种至5mL氨苄抗性(Amp+,100μg/mL)的LB培养基，37℃，220rpm过夜活化；将过夜活化的菌液按体积比1:100接种量转接至新鲜的200mL Amp+抗性(Amp+,100μg/mL)的LB培养基，37℃，220rpm培养3h至菌液OD值为0.4‑0.6，加入终浓度1mM的IPTG诱导培养4h；预冷离心机，将菌液用无RNA酶的50mL离心管收集，4℃，8000rpm离心5min，弃去培养基；用15mL的Buffer A(50mM Na3PO4、300mM NaCl，pH 7.4，于水中)重悬菌体；使用超声波细胞破碎仪破碎菌体，工作/暂停时间设置为1s/4s超声破碎
10min；4℃，8000rpm离心30min，分离上清和沉淀，因目的蛋白为可溶性表达，所以收集上清；将溶解于Buffer A中的目的蛋白使用TALON His‑Tag钴离子纯化树脂(Clontech，美国)用亲和层析的方法纯化目的蛋白。

[0121] 6)抑菌试验

[0122] 最小抑菌浓度(MIC)的测定：利用最小抑菌浓度的测定方法来测定对革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和藤黄微球菌(Micrococcus  luteus)；革兰氏阴性菌：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大肠杆菌(Escherichia coli)的抑菌活性。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的实验条件为：在TSB培养基中28℃培养，测定560nm下光密度。其它细菌的实验条件为：在LB培养基中37℃培养，测定
600nm下光密度。即：将上述细菌分别在液体LB(或TSB)培养基中进行培养，过夜培养后的菌液按体积比1:100接种于新鲜的液体LB(或TSB)培养基中，分别在37℃或28℃培养至600nm
8
(或560nm)下光密度(OD600或OD560)值达到相应于约1×10CFU/ml，用新鲜液体LB(或TSB)
6
培养基将菌液稀释并在96微孔板中每孔加入150μl，使菌的终浓度至约1×10CFU/ml，并在
96微孔板中加入重组表达蛋白使其终浓度分别为：24μM、12μM、6μM、3μM、1.5μM、0.75μM、
0.375μM、0μM，过夜培养，在酶标仪中测定各孔中溶液的OD600(或OD560)。根据OD值检测目的蛋白对细菌的抑菌活性，当实验组的细菌生长浓度达到对照组生长浓度的90％时，被认为是最小抑制浓度(Liu,N.；Zhang,R.；Fan,Z X.；Zhao,X F.；Wang,X W.；Wang,J X.Characterization of a type‑I crustin with broad‑spectrum antimicrobial activity from red swamp crayfish Procambarus clarkii.Dev.Comp.Immunol.2016,
61,145–153)。

[0123] 结果表明重组蛋白LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有广谱的抑制活性，具体抑制活性见表2。

[0124] 表2重组蛋白LvTWD‑C1W1C3、LvTWD‑W2C4和LvTWD‑C3W2C4的最小抑菌浓度MIC的测定

[0125]

[0126]

[0127] 该组类Crusitn抗菌肽的成功表达与重组蛋白生物活性的鉴定，在新型抗菌药物研发上具有重要的应用前景。