具有紫外抗性的高毒力苏云金芽胞杆菌突变株及其应用

摘要

本发明属于农业微生物应用技术领域，公开了一株具有紫外抗性的高毒力苏云金芽胞杆菌突变株及其应用。本发明采用CRISPR/Cas9技术，敲除了菌株HD‑1的hmgA基因，获得了突变株HD‑1‑△hmgA，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2022892。该菌株具有较高的黑色素产量以及良好的紫外抗性，棉铃虫生物测定表明，在经过紫外线照射3h后，该菌株仍具有80％的杀虫效力。本发明可用于研制具有高效杀虫活性、持效期长的苏云金芽胞杆菌工程菌，以开发光稳定型的生物农药。

权利要求

1.一株具有紫外抗性的高毒力苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis) HD‑1‑△hmgA，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2022892。

2.  一种微生物菌剂，其含有权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis) HD‑1‑△hmgA。

3. 一种如权利要求2所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：将权利要求1所述苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis) HD‑1‑△hmgA接种至液体培养基并进行培养，获得的菌液即为菌剂。

4. 一种农药组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis) HD‑1‑△hmgA。

5.根据权利要求4所述的农药组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为悬浮剂、粉剂、颗粒剂、油悬剂或可湿性粉剂。

6. 如权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis) HD‑1‑△hmgA在防治鳞翅目害虫中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的鳞翅目害虫为棉铃虫。

8.如权利要求4或5所述的农药组合物在防治鳞翅目害虫中的应用。

说明书

具有紫外抗性的高毒力苏云金芽胞杆菌突变株及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物农药技术领域，具体而言，涉及一株具有紫外抗性的高毒力苏云金芽胞杆菌突变株及其应用。

背景技术

[0002] 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种常见的革兰氏阳性好氧细菌，它在形成芽胞的同时会产生由cry或cyt基因编码的杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)组成的伴胞晶体。该蛋白对鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)等多种昆虫都有特异的毒杀活性，同时对线形动物门和原生动物门中某些有害种类也有杀虫活性。Bt已开发成为世界上应用最成功、使用量最大的生物杀虫剂，广泛用于农、林、医领域的害虫生物防治。Bt杀虫剂具有多方面的优越性：它对昆虫有较强的致病力和特异毒杀作用，不易使害虫产生抗药性；对环境污染小，不会对人畜健康造成威胁；成本低廉，便于工厂生产，具有极高的推广价值(Schnepf.et al.1998)。但Bt杀虫剂较短的田间持效性制约了其更大规模的商业化应用，如紫外线辐射、温度、土壤酸碱性、雨水等环境因素都会影响其活性成分杀虫蛋白的生物活性。其中紫外线所在的光谱范围会引起晶体蛋白的降解，使得杀虫制剂失活(Sanchis.et al.1999)。

[0003] 近年来，研究者们曾在荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、鱼腥藻(Anabaena)等生物体内异源表达cry基因；对Bt的芽胞和伴胞晶体进行封装和包被，如构建抗紫外的苏云金芽胞杆菌微胶囊(CN110278946B)；外源添加紫外保护剂，如化学染料甲基绿、罗丹明B、吖啶黄，生物材料菌糠水浸提液(CN112646770A)等；通过诱变筛选紫外抗性突变菌株等。随着对紫外线保护机制研究的深入，研究者发现黑色素有良好的紫外线吸收能力。通过外源添加黑色素对Bt菌株进行保护，可以起到很好的抗紫外作用。

[0004] 黑色素(melanin)是一种广泛存在于各种原核及真核生物内的氨基酸衍生物，一般呈黑褐色。黑色素来源于酪氨酸代谢途径，由多种类型的酚类或吲哚单体聚合组成，具有良好的吸光性。根据黑色素的来源以及结构的不同，可以将其分为真黑色素、褐黑色素和异黑色素(Plonka.et al.2006)。其中，异黑色素中存在一类脓黑色素(pyomelanin)，又称为尿黑酸黑色素，多为棕褐色，存在于动物和微生物中。底物酪氨酸或苯丙氨酸由对羟基苯丙酮酸羟化酶(4‑Hydroxyphenylpyruvate  dioxygenase,HPPD)催化形成尿黑酸(homogentistic acid,HGA)，再自氧化形成尿黑酸黑色素，该途径一般称为HGA途径。Bt主要合成的就是尿黑酸黑色素。一般在生物体内，尿黑酸会被尿黑酸双加氧酶
(homogentisate1,2‑dioxygenase,HmgA)催化形成马来酰乙酰乙酸，再经过异构酶(MaiA)及水解酶(FahA)作用形成乙酰乙酸等参与三羧酸循环(Turick.et al.2010)。而当HmgA失活或者缺失后，尿黑酸就会积累并分泌到细胞外，进一步氧化聚合形成黑色素。

[0005] 在采用诱变法获得产黑色素的Bt菌株的过程中，发现大多数Bt菌株可以在L‑酪氨酸存在下通过高温(42℃)诱导获得产黑色素表型(Ruan.et al.2004)。但是该诱变温度往往不利于杀虫蛋白基因cry的合成，导致产生的突变株毒力较低。随后，通过对无毒力Bt突变株BMB171进行高温诱导传代培养，获得了高产黑色素突变株BMB181(Liu.et al.2013)(保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2011016)。通过对产黑色素机制的研究，发现Bt中广泛存在由尿黑酸介导的酪氨酸代谢通路，且当HmgA失活或缺失时，尿黑酸就会积累并分泌到细胞外，氧化聚合形成脓黑色素(Yang.et al.2018)。通过对突变株BMB181进行测序分析，发现其hmgA基因发生了单个氨基酸的错义突变而失活，进一步证明了hmgA是决定Bt黑色素产生的关键基因。然而，目前获得的产黑色素突变株都为无毒或低毒力菌株，无法用于杀虫剂的制备，因此构建高产黑色素的高毒力Bt菌株具有极高的应用价值。

[0006] 苏云金芽胞杆菌库斯塔克血清变种HD‑1产生Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2A等多种杀虫蛋白，对鳞翅目害虫具有高杀虫活性，并且作为高毒力工业菌株广泛用于农药制备，是生物杀虫剂Dipel使用的原始菌株。考虑到菌株HD‑1良好的应用现状，本发明将基于HD‑1构建抗紫外诱变菌株。

发明内容

[0007] 鉴于现有技术的不足，本发明的第一个目的在于构建一株产黑色素的高毒力苏云金芽胞杆菌突变株，使其具有紫外抗性，并且经紫外处理后仍具有较高的杀虫效力，以用于研制具有高效杀虫活性、持效期长的苏云金芽胞杆菌工程菌。

[0008] 为了实现上述技术目的，本发明人结合自身多年来对苏云金芽胞杆菌的研究经验，创造性地利用CRISPR/Cas9的技术，将苏云金芽胞杆菌库斯塔克血清变种HD‑1菌株的hmgA基因进行敲除，获得产黑色素的突变菌株。该突变菌株被命名为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)HD‑1‑△hmgA，于2022年6月15日送交中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2022892。

[0009] 需要说明的是，本发明构建得到的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)HD‑1‑△hmgA具有如下特征：

[0010] (1)该菌为革兰氏阳性菌，营养体为短杆状，芽胞为椭圆形。生长温度为28±2℃，pH6‑8均生长良好，最适生长pH为7.0‑7.2。

[0011] (2)在LB培养基上30℃培养24h，菌落为乳白色近似圆形，表面似磨砂玻璃，无粘液且厚实，外沿稍有扩散而不整齐。

[0012] (3)光学显微镜观察，伴胞晶体为典型的大菱形颗粒。

[0013] (4)在LB培养基中培养24h后开始产黑色素，能观察到发酵液变色。

[0014] (5)具有较高的黑色素产量，在LB培养基中培养3天后达到3.60mg/mL。

[0015] (6)经过紫外线处理180min后，杀虫晶体蛋白仍大部分保持完整。

[0016] (7)棉铃虫生物测定表明，该菌株经过紫外照射3h后仍具有80％以上的杀虫活性。

[0017] (8)按照常规甘油管保藏方法保藏该菌株。

[0018] 本发明的第二个目的在于提供一种微生物菌剂，该菌剂含有苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)HD‑1‑△hmgA。

[0019] 本发明的第三个目的在于提供一种上述微生物菌剂的制备方法，该方法包括如下步骤：将苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)HD‑1‑△hmgA接种至液体培养基并进行培养，获得的菌液即为菌剂。进一步优选地，所述的液体培养基为LB液体培养基。所述微生物菌剂的制备方法中，培养的具体条件可以为：28±2℃/200‑250rpm下震荡培养23‑75h。

[0020] 本发明的第四个目的在于提供一种农药组合物，所述组合物包含上述的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)HD‑1‑△hmgA。进一步优选地，所述农药组合物中除了苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)HD‑1‑△hmgA外，还有载体的辅助成分，在这些辅助成分的作用下，所述组合物可以被制成悬浮剂、粉剂、颗粒剂、油悬剂或可湿性粉剂等稳定的剂型。

[0021] 本发明的第五个目的在于提供上述的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)HD‑1‑△hmgA和/或其代谢产物、上述的农药组合物在防治鳞翅目害虫中的应用。进一步优选地，所述的鳞翅目害虫为棉铃虫，所述的代谢产物为杀虫晶体蛋白。

[0022] 与现有的苏云金芽胞杆菌库斯塔克血清变种HD‑1菌株相比，本发明构建的苏云金芽胞杆菌HD‑1‑△hmgA具有更高的黑色素产量，从而可提高其作为生物杀虫农药的使用持效期，同时本发明的苏云金芽胞杆菌HD‑1‑△hmgA具有更为高效的杀虫活性，尤其对鳞翅目的毒杀活性是HD‑1的3倍以上。

附图说明

[0023] 图1：菌株HD‑1与HD‑1‑△hmgA的菌落观察。

[0024] 图2：菌株HD‑1与HD‑1‑△hmgA的黑色素产量曲线。

[0025] 图3：紫外线处理后菌株HD‑1与HD‑1‑△hmgA的芽胞存活数。

[0026] 图4：紫外线处理后的杀虫蛋白SDS‑PAGE检测。附图标记说明：图中M为蛋白质marker，120kDa和60kDa标注的为杀虫蛋白大小，泳道1、3、5、7、9为菌株HD‑1经过UV处理0、60、120、180、240min的样品；泳道2、4、6、8、10为野生型HD‑1‑△hmgA经过UV处理0、60、120、
180、240min的样品。

[0027] 图5：紫外线处理后菌株HD‑1与HD‑1‑△hmgA的杀虫致死率统计。

具体实施方式

[0028] 以下叙述是根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，没有限制作用。本发明中所涉及的其他各项实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日前的各种常用工具书、科技文献或相关说明书、手册等加以实施。

[0029] 实施例1：敲除质粒的构建

[0030] 在CRISPy‑web(http://crispy.secondarymetabolites.org/#/input)网站上提交苏云金芽胞杆菌库斯塔克血清变种HD‑1菌株中的hmgA基因序列设计sgRNA，在设计好的sgRNA 5’端添加Bsa I酶切位点。在hmgA上下游各600bp设计F、R引物，并在5’端添加Sfi I酶切位点，用于扩增上下臂。在上下臂的外侧50bp内选取20bp的引物，用于验证目的基因是否敲除。sgRNA上游和下游引物各10μL配成20μL体系，95℃‑25℃每5℃反应3min。此步的目的是让上下游引物互补配对形成双链，便于后续连接。采用穿梭载体pJOE8999，参照产品说明书，用Bsa I酶切载体，并回收产物。酶切后的载体与自退火的sgRNA用T4 DNA酶连接，产物转化DH5α，验证转化子抽提质粒。以HD‑1的基因组稀释50倍为模板，扩增hmgA基因的上下游片段各600bp，用于切割后的同源修复。参照产品说明书，用Sfi I酶切连接有sgRNA的载体以及同源上下臂，分别回收，T4 DNA酶连接并转化DH5α，验证转化子抽提sgRNA‑up‑down‑pJOE8999质粒。

[0031] Bt基因组抽提：接种Bt过夜活化，在10mL LB培养基中加入1％的菌液，30℃、220r/min培养12‑16h。离心收集菌体，STE清洗1次。加入360μL溶液I和40μL溶菌酶，4℃过夜裂解。加400μL 10％SDS溶液，轻轻混匀后55℃水浴至溶液清亮。加360μL 5M NaCl，轻轻混匀后置冰上放置5‑10min。12000r/min、4℃离心15min，吸取上清并加入600μL苯酚/氯仿/异戊醇溶液，上下颠倒200次左右，充分混匀。12000r/min、4℃离心15min，取上清，加入2/3倍体积的异丙醇沉淀DNA，于‑20℃静置1‑2h。冷冻离心(12000r/min，15min)弃上清，加入200μL 70％乙醇洗涤一次沉淀，离心去上清，室温干燥沉淀。每管加入50μL水溶解沉淀，置于‑20℃保存备用。

[0032] PCR反应体系20μL为：模板DNA 1μL，上/下游引物1μL，dNTPs 1.6μL，Pfu DNA聚合酶/EasyTaq/Taq Mix 0.4μL/0.4μL/10μL，Pfu酶缓冲液/EasyTaq缓冲液4μL/2μL，ddH2O补足20μL。

[0033] PCR扩增反应程序为：第1步94℃预变性5min；第2步94℃变性1min，第3步55℃复性1min，第4步72℃延伸1.5min；第5步转到第2步继续运行30个重复；第6步72℃延伸5min。

[0034] 所用引物序列(5’‑3’)：

[0035] HD‑sg‑F TACGGATTCCCCATGGACCGCATC

[0036] HD‑sg‑R AAACGATGCGGTCCATGGGGAATC

[0037] HD‑up‑F AAGGCCAACGAGGCCGGGCGAAATATTTCTCGTGA

[0038] HD‑up‑R AAGGCCATGTTGGCCGCCCATCACCCGCTTCCTTT

[0039] HD‑do‑F AAGGCCAACATGGCCGTAAAAAAGGCATGCTCTCA

[0040] HD‑do‑R AAGGCCTTATTGGCCTGCCCGAGACAGGAACTGAA

[0041] HD‑Y‑F TGGACGAAGAGGATTAGATG

[0042] HD‑Y‑R CGAGACAGGAACTGAAGAA

[0043] 实施例2：Bt感受态的制备与敲除质粒的电转化

[0044] 将菌株HD‑1单菌落接种过夜活化，在100mL LB培养基中按1％接种量转接，28℃/220rpm培养3‑4h。冰浴30min，5000r/min离心4min收集菌体，用预冷的SG缓冲液洗涤菌体3次，根据菌体量多少决定重悬的SG buffer体积(一般为1mL)。每管分装100μL，于‑80℃冻存。

[0045] 电转时，将1μg DNA加入1管感受态中，再将其转移至预冷的转化杯中，混匀后在冰上放置10min，准备电脉冲。电脉冲结束后，加入预热的0.6mL LB培养液，恢复培养3‑4h，5000r/min离心3min后，吸取100‑200μL涂布LB抗性平板，培养12h‑16h，以挑取相应抗性菌落。

[0046] 实施例3：Bt快速模板的制备与敲除突变体的筛选

[0047] 由于Bt是革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，所以制备PCR模板时需要额外将细胞壁破碎。在1.5mL EP管中加入50mL ddH2O，用枪头刮取一点Bt菌落，插入EP管中，振荡下来。用锅煮沸10min，冰浴10min，4℃12000r离心10min。上清为DNA模板。

[0048] LB平板上的转化子培养3‑5天后，观察是否有菌落以及周围的培养基变为红褐色。挑取该转化子进行菌落PCR验证，如果条带大小与阳性对照相比缺失hmgA基因长度(1173bp)，则说明hmgA被成功敲除。得到的菌株突变体被命名为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)HD‑1‑△hmgA。菌株HD‑1与菌株HD‑1‑△hmgA在LB平板上培养3天可以观察到明显区别，菌株HD‑1菌落为乳白色近似圆形，菌株HD‑1‑△hmgA的菌落中心和周围变为褐色，见图1。

[0049] 实施例4：黑色素产量的测定

[0050] 标准曲线的测定：购买黑色素标准品(Sigma Chemical Co.)，分别将5、10、15、20、25、30、35、40mg标准品溶解于1mL ddH2O中，利用酶标仪测定400nm的吸光值，并绘制标准曲线。

[0051] 将菌株按1％接种到100mL LB培养基中，28℃/200rpm下培养。按照6、23、25、28、31、33、48、72、75h的时间间隔取出1mL发酵液，12000r离心2min后取上清，利用酶标仪测定其400nm的吸光值。根据标准曲线算出相应时间的黑色素产量，发酵3天以上，菌株HD‑1‑△hmgA的黑色素产量达到3.60mg/mL。生产曲线见图2。

[0052] 实施例5：检测样品的制备

[0053] 将菌株HD‑1和菌株HD‑1‑△hmgA的单菌落点在LB平板中央(直径6cm)，在30℃培养箱中培养3天以上，光学显微镜(油镜100×)观察，确保芽胞和伴胞晶体完全形成。将平板置于超净台中的紫外灯(波长254nm)下方30cm处。以60min为一个梯度，处理0min、60min、120min、180min和240min。处理完的平板在黑暗处存放直到结束，刮取适量菌苔溶解于1mL ddH2O中，调整浓度直到其吸光值相同，该样品可用于晶体蛋白检测和生物活性测定。以同样的方法处理0min、20min、40min、60min和80min后可用于芽胞计数。

[0054] 将样品稀释至合适浓度，进行平板涂布，30℃培养箱中培养16h并计数。只统计一个平板上单菌落个数在50‑300个之间的结果。结果见表1和图3。

[0055] 表1紫外线处理后的芽胞计数

[0056]

[0057] 结果显示：在UV处理80min后，HD‑1‑△hmgA还有5×105个左右的芽胞存活，表明黑色素对菌体有一定的保护作用，提高了芽胞对紫外线辐射的抗性。

[0058] 实施例6：晶体蛋白的SDS‑PAGE

[0059] 按照蛋白胶试剂盒配制10％浓缩胶和分离胶，具体步骤参考说明书。取1管样品，加入40μL ddH2O重悬，加入10μL loadingbuffer，煮沸10min，12000r/min离心10min，上清即为蛋白样品，点样10μL。180V电泳40min，待指示带迁移至凝胶底部时，停止电泳。染色：卸下凝胶后用去离子水漂洗，加入考马斯亮蓝染色液，摇床过夜染色。脱色：用去离子水漂洗凝胶，加入适量脱色液，并置于摇床上脱色，每隔一段时间更换，直到可以清楚看到条带后停止，用去离子水冲洗后照胶观察。结果表明，经过UV处理的菌株HD‑1‑△hmgA的晶体蛋白降解更慢，这表明黑色素对其有较好的保护功能，见图4。

[0060] 实施例7：生物活性测定

[0061] 用水喷雾打湿纱布上粘附的棉铃虫卵，将其置于大烧杯中，30℃培养箱中黑暗存放，孵化24h。生物饲料准备(1L)：黄豆粉40g，酵母粉20g，30％乙酸14mL，维生素C 5g，苯甲酸钠1.5g，琼脂粉16g。置于65℃水浴锅中溶解、保温，每孔0.6mL装于24孔板中，保证每孔内饲料表面平整，晾干。未经UV处理的两种菌株晶体蛋白浓度约为500μg/mL，其余样品保证OD值相同。将两种菌株的晶体蛋白样品涂布于饲料表面，每孔50μL，晾干。每孔加入1头棉铃虫，30℃培养箱避光培养，培养3天后，观察并计数，结果见表2和图5。

[0062] 表2杀虫致死率统计表

[0063]

[0064] 生测结果表明：突变株HD‑1‑△hmgA经过紫外照射3h后对棉铃虫仍具有80％的致死率。