一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法

摘要

本发明属于G01N30/00技术领域，更具体的涉及一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法。一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法，包括以下步骤：通过干血斑自动取卡器材将干血斑卡片从干血斑样本盘取出置于解吸部位，进入LC‑HRMS系统进行分离和检测，完成。经本发明提供的干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法结合高效液相‑高分辨质谱技术，在缩短时间前处理时间的同时提高检测灵敏度，避免检测过程中因为手动操作带来的操作误差对检测准确度和灵敏度的影响。

权利要求

1.一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）通过干血斑自动取卡器材将干血斑卡片从干血斑样本盘取出置于解吸部位；

（2）进行拍照确认干血斑准确位置；

（3）利用卡片夹固定步骤（1）中卡片上的干血斑，使解吸溶液流穿干血斑的限定区域以解吸分析物，内标溶液通过HPD泵随解吸溶液一起通过干血斑，结束后再次拍照确认提取完成；

（4）解吸溶液进入在线固相萃取系统中，进行目标物净化和富集；

（5） 目标物随洗脱溶液进入高效液相色谱高分辨质谱系统进行分离和检测；

（6）卡片夹进行清洗，以进行下一个样本的提取；

步骤（3）所述的解吸溶液包括A相和B相，A相为体积浓度为0.1%的甲酸水溶液；B相为体积浓度为0.1%的甲酸甲醇溶液，A相和B相的体积比为3：2；所述的解吸溶液流穿速度为

1.5mL/min，流穿时间为0.75min；在解吸溶液流穿时需要加热处理，加热温度为50℃；

步骤（5）所述的洗脱溶液为C相，C相为甲醇、乙腈、异丙醇，体积比为2：2：1；所述的高效液相色谱高分辨质谱系统采用梯度洗脱程序，PRM模式；所述的检测采用ESI正离子模式，所述的梯度洗脱程序采用流动相液体作为洗脱液；所述的流动相液体包括流动相A和流动相B；所述的流动相A为体积浓度0.1%甲酸水溶液；所述的流动相B为体积浓度0.1％甲酸甲醇溶液；

所述类固醇酯为：异丁酸睾酮、异己酸睾酮、17‑安息香酸雄烯醇酮、庚酸睾酮、苯丙酸诺龙、环戊丙酸睾酮、美替诺龙庚酸酯、苯丙酸睾酮、去甲基癸酸睾酮、宝丹酮十一烯酸酯、月桂酸睾酮和月桂酸诺龙；

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB‑C18 column；

所述梯度洗脱程序的参数为：

。

2.根据权利要求1所述的干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述的卡片夹直径为2‑8mm。

3.根据权利要求1所述的干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法，其特征在于，步骤（4）所述的固相萃取通过TurboFlow柱进行。

4.根据权利要求1所述的干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法，其特征在于，步骤（6）的清洗溶液为水和甲醇中的至少一种，清洗流速为0.5‑4mL/min，清洗时间为1‑

10min。

5.根据权利要求1‑4任一项所述的干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法，其特征在于，所述的干血斑样本包括干血斑加标样本和干血斑校准曲线样本。

说明书

一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于G01N30/00技术领域，更具体的涉及一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法。

背景技术

[0002] 干血斑采样技术，是一种将全血样品收集在干血斑卡片上的采样技术。与传统静脉采血相比，干血斑采样技术具有操作简便、取血量少、微创性，保存和运输的简易化，室温下样本的稳定性等优势。近年来，干血斑与色谱质谱技术的联用在兴奋剂检测领域引起了广泛的关注和研究。

[0003] 据WADA统计，兴奋剂违规事件中近半数是合成类固醇类兴奋剂违规，在世界体育运动中，睾酮是类固醇类兴奋剂中常用的滥用物质。睾酮有多种形式和剂量，最广泛的使用形式是肌内注射睾酮酯。十一酸睾酮酯也可以口服给药。睾酮进入血液循环后吸收会减慢，从而产生长效作用。当口服或注射睾酮酯制剂后，该酯缓慢扩散到血流中，尽管酶解过程立即开始，但在血液中仍可检测到一定比例的睾酮酯原型（非专利文献1）。

[0004] 虽然尿液长期以来是兴奋剂检测的主要基质之一，但在尿液中，睾酮酯则是以游离睾酮及其代谢物的形式存在，难以检测到睾酮酯原型。目前，对尿液样本中外部摄入的类固醇类兴奋剂检测的常规方法，存在检测灵敏度较低，分析通量小以及检测成本较高等问题。该类物质特有的化学结构使其质谱检测灵敏度较差，目前多采用衍生后进行气相色谱串联质谱（GC‑MS/MS）的方法对尿液样本进行检测，内源性类固醇兴奋剂的外部摄入还需要同位素比质谱（IRMS）进行确证。但是，在血液样本中可直接检测外源性睾酮酯原型，一旦在血液样本中检测到睾酮酯的存在，即可确认其兴奋剂违规。非专利文献1中还通过血液样本检测睾酮酯可作为IRMS睾酮确证分析的补充。

[0005] 现阶段，已有公开的非专利文献2公开了对干血斑样本中睾酮酯进行检测的研究，但是现阶段的研究多采用传统的干血斑样本前处理方法，该方法是离线手动进行的，步骤繁琐耗时且存在检测灵敏度较低等问题。干血斑样本分析的前处理方法可能是影响该技术发展和应用的主要因素之一。由于样本体积有限以及高度复杂的样本基质（包括溶血的血细胞以及高含量的可溶性和不溶性蛋白质等），这些都可能会影响对目标物的分析检测。为了进一步提升干血斑样本在类固醇酯物质中检测的准确性和灵敏度，并且提升检测效率，有必要建立一种高灵敏度、高通量的干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法。

[0006] 非专利文献如下：

[0007] 【非专利文献1】药物检测与分析（Drug testing and analysis）；2015，7(11‑12)：983‑989；

[0008] 【非专利文献2】药学与生物医学分析杂志（Journal of pharmaceutical and biomedical analysis）；2014，96：21‑30；

发明内容

[0009] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法，包括以下步骤：

[0010] （1）通过干血斑自动取卡器材将干血斑卡片从干血斑样本盘取出置于解吸部位；

[0011] （2）进行拍照确认干血斑准确位置；

[0012] （3）利用卡片夹固定步骤（1）中卡片上的干血斑，使解吸溶液流穿干血斑的限定区域以解吸分析物，内标溶液通过HPD泵随解吸溶液一起通过干血斑，结束后再次拍照确认提取完成；

[0013] （4）解吸溶液进入在线固相萃取系统中，进行目标物净化和富集；

[0014] （5） 目标物随洗脱溶液进入高效液相色谱高分辨质谱系统进行分离和检测；

[0015] （6）卡片夹进行清洗，以进行下一个样本的提取。

[0016] 在一些优选的实施方式中，步骤（2）中所述的卡片夹直径为2‑8mm。

[0017] 进一步优选的，步骤（2）中所述的卡片夹直径为6mm。

[0018] 在实验过程中，申请人经过大量的创造性实验发现，在检测过程中卡片夹直径的选择会大大影响检测的准确性和灵敏度，尤其在卡片夹直径为6mm的时候，达到最好的精密度和准确度，并具有高灵敏度，申请人推测出现这种现象的原因是因为：不同直径的卡片夹在实验过程中会固定在卡片中的干血斑上，从而使一定量的解吸溶液流穿干血斑，直径过大，则会导致在解吸溶液在解析过程中使用量出现偏差，进而影响目标物净化效果，造成检测结果偏离正确范围；直径过小则达不到高灵敏度。

[0019] 在一些优选的实施方式中，步骤（3）所述的解吸溶液包括A相和/或B相；

[0020] 所述的A相包括体积浓度为0‑2%的甲酸水溶液；

[0021] 所述的B相为甲酸甲醇溶液、甲酸乙腈溶液、甲酸甲醇和乙腈的混合溶液中的一种，甲酸的体积百分比为0‑2%。

[0022] 其中，甲酸甲醇和乙腈的混合溶液中对于两者的体积比例不做限定，可以是任意体积比。

[0023] 在一些优选的实施方式中，解吸液以体积百分比计，包括：A相40‑100%、B相0‑60%。

[0024] 进一步优选的，所述的A相为体积浓度为0.1%的甲酸水溶液；所述的B相为体积浓度为0.1%的甲酸甲醇溶液。

[0025] 在一些优选的实施方式中，所述的A相和B相的体积比为3：2。

[0026] 在一些优选的实施方式中，步骤（3）所述的解吸溶液流穿速度为0.5‑3mL/min，流穿时间为0.1‑3min。

[0027] 进一步优选的，步骤（3）在解吸溶液流穿时需要加热处理。

[0028] 在一些优选的实施方式中，步骤（3）在解吸溶液流穿时的加热温度为10‑80℃。

[0029] 进一步优选的，所述的加热温度为50℃。

[0030] 在一些优选的实施方式中，步骤（4）所述的固相萃取通过TurboFlow柱进行。

[0031] 在一些优选的实施方式中，步骤（5）所述的洗脱液为C相，所述的C相包括水、甲醇、乙腈、异丙醇中的至少一种。

[0032] 进一步优选的，所述的C相为甲醇、乙腈、异丙醇，体积比为2：2：1。

[0033] 具体的实施过程如下：

[0034] 解吸溶液进入通过TurboFlow柱，保留目标物，并冲洗基质中干扰物，并通过C相（水、甲醇、乙腈、异丙醇体积比为2：2：1）将目标物洗脱并进入高效液相色谱高分辨质谱系统进行分离和检测。

[0035] 在一些优选的实施方式中，步骤（5）所述的高效液相色谱高分辨质谱系统采用梯度洗脱程序，PRM模式；所述的检测采用ESI正离子模式。

[0036] 在一些优选的实施方式中，步骤（5）所述的梯度洗脱程序采用流动相液体作为洗脱液。

[0037] 在一些优选的实施方式中，所述的流动相液体包括流动相A和流动相B。

[0038] 进一步优选的，所述的流动相A为体积浓度0％‑2%甲酸水溶液。

[0039] 进一步优选的，所述的流动相B为B相为甲酸甲醇溶液、甲酸乙腈溶液、甲酸甲醇和乙腈的混合溶液中的一种，甲酸的体积百分比为0‑2%。

[0040] 更有选的，所述的流动相A为体积浓度0.1%甲酸水溶液；所述的流动相B为体积浓度0.1％甲酸甲醇溶液。

[0041] 在一些优选的实施方式中，所述的PRM模式检测的参数如下：离子源鞘气35 units，辅助气15 units，气体加热350℃，离子源电压3.8 KV，S‑lens RF level 55，离子传输管加热320℃，隔离窗口1.2m/z。

[0042] 在一些优选的实施方式中，步骤（6）所述的清洗流速为0.5‑4mL/min，清洗时间为1‑10min。

[0043] 具体的实施过程如下：

[0044] 清洗时采用水1 mL，以2 mL /min的速度清洗；然后接着用甲醇1mL，2 mL /min的速度清洗，依次循环。

[0045] 本发明提供的全自动干血斑样本提取和检测主要针对干血斑样本量很少并且样本中类固醇酯的含量较低的问题，通过在线固相萃取系统对目标物进行净化和富集，并结合高效液相色谱‑高分辨质谱技术，实现了对干血斑样本中类固醇酯类物质的快速高灵敏度筛查以及定量检测。因此，本发明不仅在兴奋剂检测领域，在其他生物检测领域以及化学分析领域都有潜在应用价值。

[0046] 在一些优选的实施方式中，所述的干血斑样本包括干血斑加标样本和干血斑校准曲线样本。

[0047] 有益效果：经本发明提供的干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法相比现有技术具有以下优势：

[0048] 1.经本发明提供的干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法可以保证样本具有较高的提取效率，并且可以保证样本的净化、目标物的富集，大大缩短前处理的时间；

[0049] 2.经本发明提供的干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法结合高效液相色谱‑高分辨质谱技术，在缩短时间前处理时间的同时提高检测灵敏度，避免检测过程中因为手动操作带来的操作误差对检测准确度和灵敏度的影响；

[0050] 3.经本发明提供的干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法再检测的同时可以实现两个样本同时启动，在一个样本进入检测后两外一个样本进入前处理阶段，高通量的检测可以保证一个样本的检测时间为11.05分钟，节省了时间，提升了工作效率，实施方便，适合大规模干血斑样本检测，具有极高的应用价值。

附图说明

[0051] 图1为全自动干血斑样本处理和检测系统图；

[0052] 图2为干血斑样本提取前（A）和提取后（B）卡片照片；

[0053] 图3为全自动干血斑样本处理和检测流程图；

[0054] 图4为12种类固醇酯最低检测限色谱图和内标色谱图。

具体实施方式

[0055] 实施例

[0056] 实施例1

[0057] 在进行实施例说明之前先将实验过程中进行的样本配置和用到的仪器、设备、试剂、材料进行说明。

[0058] 在本申请中溶液的配制包括以下步骤：

[0059] 1.混合标准品溶液的配制：将12种类固醇酯标准品，配制成10μg/mL的混合标准品储备液。依次稀释为1μg/mL、500ng/mL、250ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、10ng/mL。

[0060] 所述的12种类固醇酯标准品为：异丁酸睾酮，异己酸睾酮，17‑安息香酸雄烯醇酮，庚酸睾酮，苯丙酸诺龙，环戊丙酸睾酮，美替诺龙庚酸酯，苯丙酸睾酮，去甲基癸酸睾酮，宝丹酮十一烯酸酯，月桂酸睾酮，月桂酸诺龙。

[0061] 2.内标溶液的配制：将d3‑丙酸睾酮，d3‑癸酸睾酮两种内标标准品配置成5ng/mL的混合标准品溶液。

[0062] 3.干血斑校准曲线样本制备：在一定体积的EDTA抗凝全血中，分别加入上述步骤1中提供的混标溶液，配制成加标全血样本，使终浓度分别为0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20ng/mL。轻微混匀后，取20μL各浓度的加标血液，滴加至滤纸的圆圈中央，干燥3小时，装入保护袋，放入干燥剂，密封‑20℃保存。

[0063] 4. 干血斑加标样本制备：在一定体积的EDTA抗凝全血中加入上述混标稀释溶液，配制成待测加标全血样本，使终浓度分别为0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10ng/mL。

[0064] 仪器和设备：

[0065] 干血斑自动取卡器，购自Thermo Fisher Scientific公司；

[0066] HPD泵：购自Thermo Fisher Scientific公司；

[0067] 在线固相萃取系统和液相分离系统：Transcend II TLX‑1，购自Thermo Fisher Scientific公司。

[0068] 试剂：

[0069] 甲醇、乙腈、异丙醇、甲酸均为LCMS级，购自Thermo Fisher Scientific公司；

[0070] 材料：

[0071] 干血斑卡片：购于Whatman™ FTA®DMPK‑C公司；

[0072] TurboFlow柱：Cyclone‑P TurboFlow™ column (0.5×50 mm)，购自Thermo Fisher Scientific公司；

[0073] 色谱柱：Zorbax Eclipse XDB‑C18 column  (2.1×100 mm)，购自Agilent Technologies公司。

[0074] 一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法，包括以下步骤：

[0075] （1）通过干血斑自动取卡器材将干血斑卡片从干血斑样本盘取出置于解吸部位；

[0076] （2）进行拍照确认干血斑准确位置；

[0077] （3）利用卡片夹固定步骤（1）中卡片上的干血斑，使解吸溶液流穿干血斑的限定区域以解吸分析物，并将内标溶液通过HPD泵随解吸溶液一起通过卡片，结束后再次拍照确认提取完成；

[0078] （4）解吸溶液进入在线固相萃取系统中，进行目标物净化和富集；

[0079] （5）目标物随洗脱溶液进入高效液相色谱‑高分辨质谱系统进行分离和检测；

[0080] （6）卡片夹进行清洗，以进行下一个样本的提取。

[0081] 步骤（3）所述的解吸溶液包括A相和B相；

[0082] 所述的A相为体积浓度为0.1%的甲酸水溶液；所述的B相为体积浓度为0.1%的甲酸甲醇溶液；

[0083] A相和B相的体积比为3：2；

[0084] 步骤（3）在解吸溶液流穿时需要加热处理，加热温度为50℃。

[0085] 步骤（3）所述的解吸溶液流穿速度为1.5mL/min，流穿时间为0.75min。

[0086] 步骤（4）所述的固相萃取进行目标物净化和富集通过TurboFlow柱进行。

[0087] 步骤（5）所述的洗脱液为C相，C相中甲醇、乙腈、异丙醇的体积比为2：2：1；

[0088] 具体的实施过程如下：

[0089] 解吸溶液进入通过TurboFlow柱，保留目标物，并冲洗基质中干扰物，并通过C相（甲醇、乙腈、异丙醇体积比为2：2：1）将目标物洗脱并进入高效液相色谱高分辨质谱系统进行分离和检测。

[0090] 步骤（5）所述的梯度洗脱程序采用流动相液体作为洗脱液，具体梯度见表1；

[0091] 所述的流动相液体包括流动相A和流动相B，所述的流动相A为体积浓度0.1%甲酸水溶液；所述的流动相B为体积浓度0.1％甲酸甲醇溶液。

[0092] 步骤（5）的具体操作为：随后进入高分辨质谱仪进行检测，采用PRM模式检测，应用ESI正离子模式；

[0093] PRM模式检测的参数如下：离子源鞘气35 units，辅助气15 units，气体加热350℃，离子源电压3.8 KV，S‑lens RF level 55，离子传输管加热320℃，隔离窗口1.2m/z，碰撞能根据每个碎片离子进行具体优化，具体如表2。

[0094] 步骤（6）所述的清洗通过水和甲醇交替进行清洗，具体的实施过程如下：

[0095] 清洗时采用水1 mL，以2 mL /min的速度清洗；然后接着用甲醇1mL，2 mL /min的速度清洗，依次循环，循环两次；

[0096]

[0097] 表1：

[0098] 表2：

[0099]

[0100] 性能测试：

[0101] 1.选择性：按实施例1的方法进行空白干血斑样本的检测，检测结果显示在目标物出峰处无明显干扰峰出现，说明该方法选择性良好。

[0102] 2.最低检测限：按实施例中提供的方法进行干血斑加标样本的测试，样本质量浓度为0.2 ng/mL，0.5 ng/mL，1ng/mL，并将结果记录于下表3。

[0103] 3.提取回收率：按实施例1提供的方法进行干血斑加标样本的检测，样本质量浓度为5ng/mL，得到峰面积A；按实施例1中的全自动干血斑样本处理和检测方法检测实施例1中空白干血斑样本，并通过HPD泵让混合标准品溶液（浓度为5ng/mL）通过卡片夹而不经过样本提取过程，得到峰面积B。峰面积A于峰面积B之比，即为提取回收率，并将结果记录于下表3。

[0104] 4.基质效应：按实施例1提供的方法制备空白卡片，通过空白干血斑样本和空白卡片，混合标准品溶液质量浓度为5ng/mL，通过HPD泵直径通过卡片夹而不经过样本提取过程，分别得到峰面积B和峰面积C。用峰面积B于峰面积C之比判断基质效应，并将结果记录于下表3。

[0105] 5.线性评估：按照实施例1中的全自动干血斑样本处理和检测方法检测合本申请中提供的干血斑校准曲线样本（质量浓度分别为0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.5 ng/mL、10 ng/mL、20ng/mL），12种目标物的线性范围见表3。

[0106] 6.精密度评估：按照实施例1中的全自动干血斑样本处理和检测方法检测本申请中提供的干血斑加标样本（质量浓度为1 ng/mL、5 ng/mL、10ng/mL），每个浓度测定四个样本，计算每个浓度下四个样本峰面积比（峰面积比为目标物峰面积与内标峰面积之比）的相对标准偏差RSD%，并将结果记录于下表3。

[0107] 7.准确度评估：按照实施例1中的全自动干血斑样本处理和检测方法检测本申请中制备的干血斑加标样本（质量浓度为1 ng/mL、5 ng/mL、10ng/mL），每个浓度测定四个样本，计算每个浓度下六个样本的相对误差Re%，并将结果记录于下表3。

[0108] Re%=（标曲测量浓度值‑实际浓度值）/实际浓度值*100%

[0109]

[0110] 通过以上性能测试结果显示：本申请提供的方法具有较好的选择性；通过最低检测限测定，证明了本申请提供的方法具有较高的检测灵敏度，12种目标物的最低检测限均低于1ng/mL，信噪比远大于3。

[0111] 经过检测后发现，12种目标物的线性范围见表3，在线性范围内均有良好的线性关2
系（R>0.99），并且检测结果呈现良好的精密度，RSD%均小于20%。

[0112] 通过以上干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法，采用干血斑采用技术以及全自动干血斑处理检测系统对干血斑样本中多种类固醇酯进行定性和定量，检测灵敏度高，准确度高，并可实现高通量检测。该发明在生物检测领域具有广泛的实用性和应用价值。