一种短周期培育优质蛹虫草子实体的方法

摘要

本发明公开了一种短周期培育优质蛹虫草子实体的方法，采用农作物废弃物甘薯藤及蛹虫草培养基废弃物作为发酵培养基的主要原料，建立了科学合理的培养方法，使废弃物中淀粉、蛋白质、糖类、氨基酸等营养物质及蛹虫草胞外酶酶解产生的小分子物质进一步被充分利用。本发明工艺简单，替代原料资源丰富易得，可节约40％‑60％的生产用粮，降低原料成本10％左右，实现农用废弃物利用，变废为宝，减少环境污染，符合绿色环保可持续发展的理念。

权利要求

1.一种短周期培育优质蛹虫草子实体的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将蛹虫草保藏菌种接种至一级培养基中培养，获得蛹虫草一级种子；

步骤二：将所述蛹虫草一级种子接种至二级培养基中培养，获得蛹虫草二级种子；

步骤三：将所述蛹虫草二级种子接种至子实体培养料中，培养至获得蛹虫草子实体；

所述一级培养基、二级培养基和子实体培养料中均含有蛹虫草培养基废弃物和甘薯藤，其中，所述一级培养基和二级培养基中的蛹虫草培养基废弃物和甘薯藤的质量比为（10

30）：（4 12），所述子实体培养料中的蛹虫草培养基废弃物和甘薯藤的质量比为（30 60）：~ ~ ~

（20 10）；

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所述甘薯藤采用经以下方法处理后的甘薯藤颗粒：将新鲜的甘薯藤烘干至含水量8%~

12%，粉碎至4‑40目，获得所述甘薯藤颗粒；和/或，所述蛹虫草培养基废弃物采用以下方法制备获得：将采集完蛹虫草子实体的培养料粉碎至粒径0.4 0.6 cm，烘干至含水量8% 12%备用；

~ ~

所述一级培养基包括：100 g/L农作物营养物、10‑30 g/L蛹虫草培养基废弃物、2‑20 g/L甘薯藤颗粒煮开20 25 min，滤布过滤得到滤液，再分别加入10 g/L葡萄糖、2.5 g/L蛋~白胨、1.5 g/L硫酸镁、3 g/L磷酸二氢钾、10 mg/L维生素B1、10 g/L琼脂；

所述二级培养基包括：100 g/L农作物营养物、10 30g/L蛹虫草培养基废弃物、2 20 g/~ ~L甘薯藤颗粒一起煮开20 25 min，滤布过滤得到滤液，再分别加入10 g/L葡萄糖、2.5 g/L~蛋白胨、1.5 g/L硫酸镁、3 g/L磷酸二氢钾、10 mg/L维生素B1；

子实体培养料包括：营养辅料、农作物营养物、蛹虫草培养基废弃物、甘薯藤颗粒。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述一级培养基、二级培养基和/或子实体培养料中的农作物营养物选自土豆、麦粒、大米、玉米中的任意一种或多种。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述子实体培养料中的营养辅料为硫酸镁、磷酸二氢钾和甘氨酸。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述子实体培养料的制备方法包括：将所述农作物营养物、蛹虫草培养基废弃物和甘薯藤颗粒混合得总质量份为100份的混合物料，加入基于混合物料质量1:1.5 2.0 g/ml的营养辅料即得。

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5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤一中的培养方法包括：向一级培养基中无菌接种蛹虫草保藏菌种，18 22℃避光培养。

~

6.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤二中的培养方法包括：向二级培养基中无菌接种蛹虫草一级种子，于温度18 22℃、转速130 150 rpm下避光培养3 5天。

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7.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤三中的培养方法包括：向子实体培养料中无菌接种6% 8%的蛹虫草二级种子，先于18 22℃避光培养，再进入转色阶段，控制光照~ ~强度200 400Lx，空气湿度60% 80%，待菌丝颜色转至橘黄色，扎孔透气，形成蛹虫草子实体~ ~原基，控制空气湿度85% 95%，培养至可采收。

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8.一种蛹虫草培养物，其特征在于，所述蛹虫草培养物包括如权利要求7所述的方法制备获得的蛹虫草子实体原基。

9.一种利用如权利要求1 7任一所述方法制备获得的蛹虫草子实体。

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说明书

一种短周期培育优质蛹虫草子实体的方法

技术领域

[0001] 本发明属于农业生产废弃物循环再利用和生物技术领域，具体涉及一种短周期培育优质蛹虫草子实体的方法，尤其是一种利用农作物废弃物甘薯藤及蛹虫草培养基废弃物在更短的培育周期内制备生物学形态和功能指标好的优质蛹虫草子实体的方法。

背景技术

[0002] 蛹虫草(Cordyceps militaris)又名北冬虫夏草、北虫草，属子囊菌亚门核菌纲球壳目麦角菌科虫草属真菌。作为传统药食两用真菌，因其营养及经济价值备受人们喜爱，我国自上世纪八十年代发现并分离蛹虫草以来，栽培技术发展迅速，已初步实现规模化种植，且不受季节限制。

[0003] 一直以来蛹虫草栽培原料主要为大米、麦粒，原料成本远远高于其他食用菌品种。但蛹虫草种植的经济效益高于传统基础农业，已经成为部分农民脱贫致富的支柱产业，随着农民种植技能的提高和成熟，种植规模不断扩大，产生大量蛹虫草培养基废弃物，质量约是蛹虫草干品的6～8倍，原料浪费达30％，给生产环境带来了巨大压力和困扰，培养基废弃物亟待处理。目前培养基废弃物也缺乏大量有效的再利用途径，污染自然生态环境和再生产环境，制约了虫草产业的可持续发展。

[0004] 中国土地沙漠化导致农业耕地面积不断减少，能够作为主食的抗逆性甘薯作物种植在不断推进。甘薯因抗干旱、耐瘠薄、环境适应性强、高产稳产等特点，世界上已有100多2
个国家种植。甘薯是我国主要栽培的农作物之一，种植面积约1100万hm ，占世界甘薯种植面积的65％以上，栽培面积和产量均居世界首位。我国每年生产的甘薯藤高达150亿吨以上。除极少部分被利用外大部分被弃置田边或燃烧掉，污染了生态环境造成生产的不便，又造成了资源的浪费。而民间中医常以甘薯藤作为降血脂、降血糖、预防和治疗动脉硬化、心脑血管疾病等的辅助治疗药食材，这与蛹虫草的研究领域功效一致，这也为用甘薯藤参与蛹虫草的培养提供了可行性。

[0005] 目前，人们已经尝试对农业生产副产物的再利用以提高经济价值。例如，专利CN104969773A公开了一种利用甘薯渣发酵获得蛹虫草发酵物或子实体的方法，此发明利用的甘薯渣主要为淀粉渣，替代蛹虫草栽培用粮，生物学转化率相对较低，不利于工厂化栽培，所利用原料用粮替代料为工业废弃物，收益者为生产企业。本申请利用的是甘薯地上部位的藤蔓，功能成分丰富，替代虫草栽培用粮生物学转化率相对较高，藤蔓为农业生产废弃物，受益者是农民，有利于农业生产。

发明内容

[0006] 本申请旨在提供一种利用目前农业种植生产领域和蛹虫草培养领域大量的废弃物质，即甘薯藤和蛹虫草培养基废弃物作为培养基质，进而能够快速、高产量地制备高质量蛹虫草子实体的方法，本申请的工艺简单，培养替代原料丰富易得，成本低，节约生产用粮，避免浪费农业资源，降低环境污染。

[0007] 一方面，本申请提供了一种短周期培育优质蛹虫草子实体的方法，包括以下步骤：

[0008] 步骤一：将蛹虫草保藏菌种接种至一级培养基中培养，获得蛹虫草一级种子；

[0009] 步骤二：将所述蛹虫草一级种子接种至二级培养基中培养，获得蛹虫草二级种子；

[0010] 步骤三：将所述蛹虫草二级种子接种至子实体培养料中，培养至获得蛹虫草子实体；

[0011] 所述一级培养基、二级培养基和子实体培养料中均含有蛹虫草培养基废弃物和甘薯藤，其中，所述一级培养基和二级培养基中的蛹虫草培养基废弃物和甘薯藤的质量比为(10～30)：(4～12)，所述子实体培养料中的蛹虫草培养基废弃物和甘薯藤的质量比为(30～60)： (20～10)。

[0012] 进一步地，所述甘薯藤采用经以下方法处理后的甘薯藤颗粒：将新鲜的甘薯藤烘干至含水量8％～12％，粉碎至4～40目，获得所述甘薯藤颗粒。

[0013] 优选的，所述甘薯藤的处理具体包括：挑选出秋季采完甘薯后新鲜的、无霉变、无腐烂、非木质化的甘薯藤，洗净，淋干水分，放入到粉碎机当中，将甘薯藤粉碎成2‑3cm小段，再将粉碎好的甘薯藤置于鼓风干燥箱中60℃‑80℃烘干至含水量达到8～12％装袋备用。

[0014] 其中，将烘干好的甘薯藤进一步用粉碎机粉碎至可过4‑8目筛，得甘薯藤粗粒(即粒径4‑8目的甘薯藤)；将烘干好的甘薯藤进一步用粉碎机粉碎至可过20‑40目筛，得甘薯藤粉粒(即粒径20‑40目的甘薯藤)。

[0015] 更优选的，在一级培养基和二级培养基中采用粒径较细的甘薯藤粉粒，如此可充分提取甘薯藤中的活性物质，应用于培养基中更利于对蛹虫草菌种培养的驯化；在子实体培养料中采用粒径较粗的甘薯藤粗粒，由于甘薯藤自身的植物组织结构具有很好的透气性，选用较粗粒径的甘薯藤粗粒，可以在保留其自身组织结构的透气性以外，还由于其较粗的粒径，使其在与蛹虫草培养基废弃物混合后，仍能保留较高的孔隙率，同时还能显示出很好的保水效果和缓释功能，一方面可在进行蛹虫草子实体出草培养时特别是在长出子实体原基后，大大提高菌丝生长的换气效果，进而可提高蛹虫草的生长速度，缩短培育周期，另一方面有利于菌丝生长过程中对甘薯藤中营养物质的吸收，进而提高最终蛹虫草子实体的生物学指标和功能指标的质量。

[0016] 进一步地，所述蛹虫草培养基废弃物采用以下方法制备获得：将采集完蛹虫草子实体的培养料粉碎至粒径0.4～0.6cm，烘干至含水量 8％～12％备用。

[0017] 其中，可挑选无霉变、无杂菌污染、无污物、蛹虫草菌丝丰富的子实体的培养料，并挑出子实体残段弃掉，此培养料经过子实体胞外酶酶解降低了韧性，易于断裂。

[0018] 在一种实施方式中，可以选用本领域常规的蛹虫草子实体出草培养料，在培养采集完蛹虫草子实体后，作为本申请所述蛹虫草培养基废弃物使用。

[0019] 在优选的实施方式中，可以将本申请方法中，仅含有农作物营养物的子实体培养料作为新鲜培养料，在培养采集完蛹虫草子实体后，作为本申请所述蛹虫草培养基废弃物使用。

[0020] 优选的，粒径较细(20‑40目)的甘薯藤粉粒和蛹虫草培养基废弃物以其提取液的形式应用于一级培养基和二级培养基中，该提取液包括但不限于其水提液。如此可同时充分提取甘薯藤和蛹虫草培养基废弃物中的活性物质，更利于对蛹虫草菌种培养的驯化。

[0021] 优选的，粒径较粗(4‑8目)的甘薯藤粗粒和蛹虫草培养基废弃物以固体颗粒的形式应用于子实体培养料中。此时可利用甘薯藤粗粒的透气性提高菌丝生长过程中对蛹虫草培养基废弃物中活性物质的吸收，进一步提高最终蛹虫草子实体的质量。

[0022] 进一步地，所述一级培养基、二级培养基和/或子实体培养料中还含有农作物营养物，所述农作物营养物选自土豆、麦粒、大米、玉米中的一种或多种。

[0023] 进一步地，所述一级培养基、二级培养基和/或子实体培养料中还含有营养辅料，所述营养辅料选自葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素B1、琼脂、甘氨酸中的一种或多种。

[0024] 进一步地，所述一级培养基和二级培养基的制备方法包括：将所述农作物营养物、蛹虫草培养基废弃物和甘薯藤颗粒混合后加水煮沸15～30min，过滤得滤液，向所述滤液中加入营养辅料即得，农作物营养物的添加量为30‑200g/L；和/或，

[0025] 所述子实体培养料的制备方法包括：将所述农作物营养物、蛹虫草培养基废弃物和甘薯藤颗粒混合得总质量份为100份的混合物料，加入基于混合物料质量1:1.5～2.0g/ml的营养辅料即得。

[0026] 在优选的实施方式中，上述制备方法，步骤一采用的一级培养基，其组成如下：农作物营养物100g/L、蛹虫草培养基废弃物10‑30g/L、甘薯藤颗粒2‑20g/L煮开20～25min，滤布过滤得滤液，再加入葡萄糖10g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸镁1.5g/L、磷酸二氢钾3g/L、10mg/L 维生素B1、琼脂10g/L，121℃灭菌30min；

[0027] 步骤二采用的二级培养基，其组成如下：农作物营养物100g/L、蛹虫草培养基废弃物10‑30g/L、甘薯藤颗粒2‑20g/L一起煮开20～25 min，滤布过滤得滤液，分别加入葡萄糖10g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸镁1.5g/L、磷酸二氢钾3g/L、10mg/L维生素B1；

[0028] 步骤三采用的子实体培养料，其组成如下：营养液配制：硫酸镁 0.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，甘氨酸0.1g/L；农作物营养物10～90份、蛹虫草培养基废弃物8～80份、甘薯藤颗粒2～30份混合，控制混合物料总量为100质量份，与营养液混合比例为1：1.5～2.0g/ml。

[0029] 进一步地，所述步骤一中的培养方法包括：向一级培养基中无菌接种蛹虫草保藏菌种，18～22℃避光培养。

[0030] 在一种实施方式中，步骤一具体的制备方法如下：将一级培养基溶解充分在分装试管中，121℃灭菌30min冷至室温，将蛹虫草保藏菌种在无菌条件下用接种钩在远离原来接种点划成4×4mm菌丝片，用接种铲铲出菌片置于新鲜一级种斜面中下部，轻微按下，18‑22℃避光培养，待满管后停止培养，低温保存。

[0031] 进一步地，所述步骤二中的培养方法包括：向二级培养基中无菌接种蛹虫草一级种子，于温度18～22℃、转速120～150rpm下避光培养3～5天。

[0032] 在一种实施方式中，步骤二具体的制备方法如下：将二级培养基分装在三角瓶中，121℃灭菌30min冷至室温，将蛹虫草一级种子在无菌条件下用接种钩在远离原来接种点划成2×2mm菌丝片3～4个，用接种铲铲出菌片置于二级种三角瓶中，18～22℃，130‑150rpm培养 3～5天，待菌丝健壮、菌球丰富体积占比达到50‑70％，停止培养。

[0033] 优选的，还可根据生产需要同步实现发酵罐生产三级液体菌种，以满足规模化栽培需要。培养料配制方法与步骤二蛹虫草二级液体种子的培养料配制方法相同，培养条件如下：装料体积占罐内容积的 60％，经实消后降温至22‑24℃按罐内装料体积接入接入蛹虫草二级液体种子，接种量为3～5％，罐压0.02‑0.06Mpa，20～22℃，转速 130～150rpm，发酵时间2～3天，待菌丝健壮、菌球丰富体积占比达到50‑70％，停止培养。

[0034] 进一步地，所述步骤三中的培养方法包括：向子实体培养料中无菌接种6％～8％的蛹虫草二级种子，先于18～22℃避光培养，再进入转色阶段，控制光照强度200～400Lx，空气湿度60％～80％，待菌丝颜色转至橘黄色，扎孔透气，形成蛹虫草子实体原基，控制空气湿度 85％～95％，培养至可采收。

[0035] 另一方面，本申请还提供了一种蛹虫草培养物，所述培养物包括上述方法制备获得的蛹虫草子实体原基。

[0036] 另一方面，本申请还提供了一种利用上述培育方法制备获得的蛹虫草子实体。

[0037] 本发明的有益效果包括以下内容中的至少一项：

[0038] 1、本申请提供的培育方法，利用甘薯藤、蛹虫草培养基废弃物生产蛹虫草的方法，使废弃物中淀粉、蛋白质、糖类、氨基酸等营养物质及蛹虫草胞外酶酶解产生的小分子物质进一步被充分利用，促进了当前农业废弃物资源高效生态循环利用，不仅可以减少资源浪费和环境污染，而且可以节约生产原料用粮，降低生产成本；其中，甘薯藤质轻且富含矿物质、维生素、柔性纤维、黄酮类物质可提高蛹虫草品质，甘薯藤资源丰富、成本低、高营养，是甘薯藤的一个难得的优势，充分利用起来，变废为宝，才能利农惠农，调动农民生产积极性，促进农业生产；同时，利用蛹虫草培养基废弃物，不需远途运输，原位就地取料，方便且降低运输成本，极大促进了蛹虫草产业链的高效可持续性发展；

[0039] 2、本申请提供的方法，对甘薯藤及蛹虫草培养基废弃物采用简单易行的晾晒及低温烘干方式既保证营养少损失又能快速处理，易于存放，避免长期弃置导致的变质污染和损失，集中收集方式将甘薯藤及蛹虫草培养基废料储备，调节生产供料时间，且能满足多种用途；

[0040] 3、本申请提供的方法，降低原料用粮，减少废弃物污染，提高蛹虫草品质。采取的措施主要为在蛹虫草一级菌种、二级菌种培养时优化培养条件，降低土豆、蛋白胨等常规培养营养成分，通过加入甘薯藤蛹虫草培养基废弃物等初步驯化，并提供营养强壮菌种活力，根据生产需要可实现发酵罐规模化三级菌种培养；在子实体培养过程中采用适合的培养条件，降低原料粮食的使用量，以蛹虫草培养基废弃物与甘薯藤的不同比例的添加及科学的培养方法达到生产目的；

[0041] 4、本申请提供的方法，在菌种培养过程用甘薯藤及蛹虫草培养基废弃物替代部分土豆、葡萄糖、蛋白胨等，可使成本降低并使菌种得到驯化，提高活力；

[0042] 5、本申请提供的方法，可改善蛹虫草品相及生物学指标，可提高蛹虫草子实体中黄酮等含量，增强抗氧化能力；

[0043] 6、本申请提供的方法，粗略进行效益分析，以市售蛹虫草子实体干品每公斤70元计、麦粒或大米每公斤2.2元计，蛹虫草子实体生物学转化率80％计，本申请每生产一吨蛹虫草子实体干品，可节粮约3～4吨，处理培养废料约6～7吨，降低原料成本10％以上。

附图说明

[0044] 此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

[0045] 图1为一级蛹虫草菌种的生长情况示意图，其中(a)对应对比例1的一级蛹虫草菌种，(b)对应实施例1的一级蛹虫草菌种；

[0046] 图2为蛹虫草二级液体种子的菌丝显微图，其中(a)对应对比例1，(b)对应实施例1，(c)对应实施例2，(d)对应实施例3， (e)对应实施例4，(f)对应实施例5；

[0047] 图3为蛹虫草子实体原基萌发示意图，其中(a)对应对比例1， (b)对应实施例1，(c)对应实施例2，(d)对应实施例3，(e) 对应实施例4，(f)对应实施例5；

[0048] 图4为蛹虫草子实体生长情况示意图，其中(a)对应对比例1， (b)对应实施例1，(c)对应实施例2，(d)对应实施例3，(e) 对应实施例4，(f)对应实施例5；

[0049] 图5为各示例蛹虫草子实体功能指标示意图。

具体实施方式

[0050] 为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。

[0051] 实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。如无特殊说明，下述实施例中所涉及的原料、仪器及试剂均可通过商业途径购得。

[0052] 在下述实施例中，甘薯藤和蛹虫草培养基废弃物采用如下方法制备获得：

[0053] 一、甘薯藤的处理：

[0054] 挑选出新鲜的、无霉变、无腐烂、非木质化的甘薯藤，洗净，淋干水分，将甘薯藤放入到粉碎机当中，将甘薯藤粉碎成2‑3cm小段，再将粉碎好的甘薯藤置于鼓风干燥箱中60℃‑80℃烘干至含水量达到 8～12％装袋备用；

[0055] 将烘干好的甘薯藤进一步用粉碎机粉碎至可过4‑8目筛，得甘薯藤粗粒(即粒径4‑8目的甘薯藤)；将烘干好的甘薯藤进一步用粉碎机粉碎至可过20‑40目筛，得甘薯藤粉粒(即粒径20‑40目的甘薯藤)。

[0056] 二、蛹虫草培养基废弃物的制备：

[0057] 营养液的配制：硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾2g/L、甘氨酸0.1g/L；

[0058] 固料的配制：将100份麦粒放入500ml容量培养瓶中；

[0059] 向固料中按1：1.6～1.8g/ml的比例加入营养液混合，每瓶的质量为30g；瓶口覆盖聚乙烯膜，用橡皮筋扎紧，将培养瓶放入蒸汽灭菌锅中121℃灭菌60～70min，冷却至室温，获得新鲜培养料；

[0060] 向新鲜培养料在无菌环境下接入蛹虫草种子(蛹虫草保藏菌种，在其他的实施方式中也可以是常规培养基，例如本申请中不含甘薯藤和废弃物的一级培养基或二级培养基培养获得的一级种或二级种)，菌种的接种体积是培养基体积的6～8％，在温度为18～22℃环境下避光培养；待白色菌丝长满覆盖瓶内培养料表面后进入转色阶段进行培养，培养的光照强度为200‑400Lx，空气湿度为65～75％；待菌丝颜色转至橘黄色，用无菌针在培养瓶口均匀扎孔透气，原基突起长出，在空气湿度为85～95％环境下进行培养，待蛹虫草子实体顶端微膨大高至瓶口则进行采收；

[0061] 将采收完蛹虫草子实体所剩下的培养料称为蛹虫草培养基废弃物，并挑选无霉变、无杂菌污染、无污物、蛹虫草菌丝丰富的蛹虫草培养基废弃物，挑出子实体残段弃掉(此培养料经过子实体胞外酶酶解降低了韧性，易于断裂)，再用揉搓机搓碎分散，粒径0.4～0.6cm，置于温度为60～80℃的鼓风干燥箱中烘干至含水量在8～12％范围内，装袋备用。

[0062] 实施例1

[0063] 本实施例中利用甘薯藤及蛹虫草培养基废弃物为主要原料培养蛹虫草的方法包括以下步骤：

[0064] 步骤一、蛹虫草一级种子的制备

[0065] 将100g/L土豆、10g/L蛹虫草培养基废弃物、5g/L甘薯藤粉粒(粒径20‑40目)混合煮开20～25min后，滤布过滤得到滤液，在滤液中加入10g/L葡萄糖、2.5g/L蛋白胨、1.5g/L硫酸镁、3g/L磷酸二氢钾、10mg/L维生素B1、10g/L琼脂，混合均匀后装入试管中，然后将试管放入蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min，冷却至室温，将蛹虫草保藏菌种在无菌条件下用接种钩在远离原来接种点划成4×4 mm菌丝片，用接种铲铲出菌片置于新鲜一级种斜面中下部，轻微按下，在18℃～22℃下避光培养，待满管后停止培养，低温保存，获得蛹虫草一级种子。

[0066] 步骤二、蛹虫草二级液体种子的制备

[0067] 将100g/L土豆、10g/L蛹虫草培养基废弃物、4g/L甘薯藤粉粒 (粒径20‑40目)混合煮开20～25min后，滤布过滤得到滤液，在滤液中加入10g/L葡萄糖、2.5g/L蛋白胨、1.5g/L硫酸镁、3g/L磷酸二氢钾、10mg/L维生素B1，混合均匀后装入三角瓶中，无菌环境下接入步骤一培养的蛹虫草一级种子，置于温度为18～22℃、转速为140 rpm的恒温摇床中，避光培养时间为3.5～4.5天，待菌丝健壮、菌球丰富占比达到50‑70％，停止培养，获得蛹虫草二级液体种子。

[0068] 在本实施例中使用蛹虫草二级液体种子进行出草培养。

[0069] 可选的，还可根据需要，同步实现发酵罐生产蛹虫草三级液体菌种，以满足规模化栽培需要。培养料配制方法与步骤二蛹虫草二级液体种子的培养料配制方法相同，培养条件如下：装料体积占罐内容积的60％，经实消后降温至22‑24℃按罐内装料体积接入接入蛹虫草二级液体种子，接种量为3～5％，罐压0.02‑0.06Mpa，20～22℃.转速 130～150rpm,发酵时间2～3天，待菌丝健壮、菌球丰富体积占比达到 50‑70％，停止培养。该三级液体菌种的生长情况见表2。

[0070] 步骤三、蛹虫草子实体的培养

[0071] 子实体培养料的制备：

[0072] 营养液的配制：硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾2g/L、甘氨酸0.1g/L；

[0073] 固料的配制：将50份麦粒、40份蛹虫草培养基废弃物、10份甘薯藤粗粒(粒径4‑8目)放入500ml容量培养瓶中；

[0074] 向固料中按1：1.6～1.8g/ml的比例加入营养液混合，每瓶的质量为30g；瓶口覆盖聚乙烯膜，用橡皮筋扎紧，将培养瓶放入蒸汽灭菌锅中121℃灭菌60～70min，冷却至室温，获得子实体培养料；

[0075] 向子实体培养料在无菌环境下接入步骤二制备获得的蛹虫草二级液体种子，接种量6～8％，在温度为18～22℃环境下避光培养；待白色菌丝长满覆盖瓶内培养料表面后进入转色阶段进行培养，培养的光照强度为200‑400Lx，空气湿度为65～75％；待菌丝颜色转至橘黄色，用无菌针在培养瓶口均匀扎孔透气，原基突起长出，在空气湿度为85～95％环境下进行培养，待蛹虫草子实体顶端微膨大高至瓶口则进行采收。

[0076] 在一种实施方式中，上述步骤三的蛹虫草子实体培养过程，当菌丝转色后原基突起刚刚形成时根据生产用途可停止培养，即形成蛹虫草子实体原基，此时培养料里菌丝丰富，富含蛋白质、糖类、氨基酸等营养成分，可用于保健品等下游产品开发。

[0077] 实施例2

[0078] 本实施例的制备方法与实施例1大致相同，区别在于，步骤二蛹虫草二级液体种子的制备中蛹虫草培养基废弃物15g/L、甘薯藤粉粒 6g/L；步骤三子实体培养料中固料采用40份麦粒、45份蛹虫草培养基废弃物和15份甘薯藤粗粒。

[0079] 实施例3

[0080] 本实施例的制备方法与实施例1大致相同，区别在于，步骤二蛹虫草二级液体种子的制备中蛹虫草培养基废弃物20g/L、甘薯藤粉粒8g/L；步骤三子实体培养料中固料采用将30份麦粒、50份蛹虫草培养基废弃物和20份甘薯藤粗粒。

[0081] 实施例4

[0082] 本实施例的制备方法与实施例1大致相同，区别在于，步骤二蛹虫草二级液体种子的制备中蛹虫草培养基废弃物25g/L、甘薯藤颗粉粒10g/L；步骤三子实体培养料中固料采用将10份麦粒、70份蛹虫草培养基废弃物和20份甘薯藤粗粒。

[0083] 实施例5

[0084] 本实施例的制备方法与实施例1大致相同，区别在于，步骤二蛹虫草二级液体种子的制备中蛹虫草培养基废弃物30g/L、甘薯藤粉粒 12g/L；步骤三子实体培养料中固料采用将10份麦粒、80份蛹虫草培养基废弃物和10份甘薯藤粗粒。

[0085] 对比例1

[0086] 本对比例与实施例1的制备方法大致相同，区别在于：

[0087] 一级培养基的组成如下：按200g/L土豆煮开20～25min，滤布过滤得滤液，分别加入葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，硫酸镁1.5g/L，磷酸二氢钾3g/L，维生素B1 10 mg/L，琼脂10g/L。

[0088] 二级培养基的组成如下：按200g/L土豆加水，煮开20～25min，滤布过滤得滤液，分别加入葡萄糖20g/L，蛋白胨5.0g/L，硫酸镁 1.5g/L，磷酸二氢钾3g/L，维生素B1 10 mg/L。

[0089] 子实体培养料中，固料采用100份麦粒，其余步骤参数相同。

[0090] 培养结果对比：

[0091] 上述各示例中蛹虫草培养基废弃物主要营养成分如表1所示；所获得的一级蛹虫草种子长势及培养状况如附图1所示；蛹虫草二级液体种子的培养情况如表2及附图2所示；蛹虫草子实体培养状况如表 3‑表5及附图3‑5所示。其中，每个示例同时培育30瓶的蛹虫草子实体，下表中的数据，例如表2中的生长周期、表3‑5中的各项指标，均是取30瓶蛹虫草子实体测试数据平均值。

[0092] 表1

[0093]   粗蛋白 粗纤维 淀粉 钙 总磷 氨基酸含量(mg/g) 184 49 430 0.9 4.6 81.7

[0094] 由图1可见，对比例1及实施例1～5制备获得的蛹虫草一级种子，菌丝粗壮、致密、整齐，质量好。

[0095] 上述各示例中蛹虫草二级液体种子的生长状况如表2所示：

[0096] 表2

[0097]  菌球大小直径/cm 菌球均匀度 悬浮性 生长周期/d
实施例1～5 0.18～0.22 均匀 **** 4.5
三级液体菌种 0.20～0.22 均匀 **** 2.5
对比例1 0.25 较均匀 *** 5.0

[0098] 从表2可看出实施例1～5的二级液体种子以及发酵罐三级液体菌种，菌球稍小于对比例1，菌球均匀度更好，悬浮性好(*越多悬浮性越好)，说明菌种生长状态好，使用时更容易分散，使子实体更易于均匀分布，同时实施例1～5以及发酵罐三级液体菌种的菌种生长周期短于对比例1，说明在甘薯藤和蛹虫草培养基废弃物在一定程度上可促进菌种生长，使菌种质量更好。

[0099] 通过图2可看出无论是实施例1～5还是对比例1，蛹虫草菌丝都较粗壮，有菌丝膨大，有菌丝分支，菌丝分隔，说明繁殖能力强，活力好，从图片可以看出实施例1～5中菌丝较对比例1更丰富，菌种质量更好。

[0100] 上述示例中蛹虫草子实体出草情况如表3所示：

[0101] 表3

[0102]  菌丝萌发/h 覆满料面时间/h 转色/d 出草率％ 原基形成/d
实施例1 24 132 4 100 13
实施例2 24 120 4 100 12
实施例3 24 108 3.5 100 12.5
实施例4 24 132 3.5 100 13
实施例5 24 132 4 100 14
对比例1 28 144 4.5 100 13

[0103] 从表3及图3可看出实施例1～5中子实体菌丝开始萌发都比对比例1的菌丝要快，分别为24h和28h，且覆满料面的时间都比对比例 1时间短，说明蛹虫草菌丝在以薯藤及蛹虫草培养基废弃物替代料上生长速度较快；对比例1的菌丝见光转色时间长，实施例2和3的橘黄色原基形成时间早于对比例1，这说明蛹虫草菌丝在不同比例替代料上长势良好，同时生长周期缩短在一定程度上可减少人力物力，节约能源。

[0104] 上述示例中蛹虫草生物学指标如表4所示：

[0105] 表4

[0106]

[0107] 由表4及图4可看出实施例1～5的子实体直径略低于对比例1，但子实体数量高于对比例1，实施例1～3生物学效率略高于对比例1，这说明甘薯藤及蛹虫草培养基废弃物对子实体产量有一定影响，产量略有增长且畸形率低，实施例中的子实体品相好，商品价值高，同时实施例1～3的生长周期短于对比例1。

[0108] 上述示例中蛹虫草子实体功能指标如表5所示：

[0109] 表5

[0110]

[0111] 其中，表5及图5中的指标检测方法分别为：虫草素采用高效液相色谱法，测试方法包括：准确称取蛹虫草子实体粉末各1.0g，分别置于圆底烧瓶中，加入90％甲醇溶液20mL，加热回流提取45min，放冷，定容至50mL，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液，微孔滤膜过滤，作为供试溶液，色谱柱为C18，流动相为甲醇：水＝15： 85，检测波长为258nm，进样量为5μL，流速为1mL/min。黄酮为亚硝酸钠‑硝酸铝法，总抗氧化能力采用ABTS法，利用货号G0142F 试剂盒准确测得。

[0112] 据以上图表可看出，5个实施例中的蛹虫草子实体中虫草素含量与对比例相近，略有提高；黄酮类含量都明显高于对比例，总抗氧化能力明显高于对比例，综合来看实施例1～5培养的蛹虫草子实体功能指标高于对比例，说明以农业废弃物甘薯藤及蛹虫草培养基废弃物作为替代料提高了蛹虫草子实体品质。但与表4和图4比较发现，从生长周期、生物学效率、功能指标可看出实施例1～3较佳，即一级种子中加入蛹虫草培养基废弃物10g/L和甘薯藤粉粒5g/L，二级种中蛹虫草培养基废弃物加入10～30g/L、甘薯藤粉粒4～12g/L，蛹虫草子实体栽培料中蛹虫草培养基废弃物占30～60份，甘薯藤粗粒占10～20 份时，经过科学的培养方法栽培效果好。实施例4～5栽培效果不理想，有待改进。综合来看，本发明首次将蛹虫草培养基废弃物和甘薯藤成功用于培养蛹虫草，替代培养料用粮，具有一定的经济效益同时兼有更明显的生态效益和社会效益。

[0113] 以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。