基于花菁染料的靶向性比率pH荧光探针的制备和应用转让专利
申请号 : CN202210495626.9
文献号 : CN115160338B
文献日 : 2023-05-12
发明人 : 李春艳 , 顾青松 , 费俊杰
申请人 : 湘潭大学
摘要 :
本发明涉及基于花菁染料的靶向性比率pH荧光探针的制备和应用，该荧光探针的结构式为：本发明提供了以花菁荧光染料、三水合乙酸钠等为原料合成该荧光探针的制备方法；该荧光探针是一种具有近红外发射、高选择性和能够靶向细胞的比率pH荧光探针。首先，该荧光探针对pH表现出很高的灵敏度，探针在酸性条件下645nm的荧光显著减弱，758nm处荧光显著增强；其次，该荧光探针对pH表现出很好的选择性，不受其他常见无机离子、活性氧、活性氮、活性硫、氨基酸以及生物硫醇的干扰；此外，该荧光探针已成功用于细胞中的pH成像，可以检测细胞中的pH水平。
权利要求 :
1.一种基于花菁染料的靶向性比率pH荧光探针，即Cy‑Biotin‑O，其特征在于，结构如下：
2.根据权利要求1所述的一种基于花菁染料的靶向性比率pH荧光探针的制备方法，其特征在于，反应步骤如下：在15～25℃下，将1当量的Cy‑Biotin‑Cl用10～20mL无水DMF溶解后加入50mL的圆底烧瓶中，接着，将3～5当量的三水合乙酸钠加入上述体系；氮气保护下，升温至80～100℃，搅拌5～7h；反应完成后，冷却至室温；粗产物用盐水和二氯甲烷萃取，取有机相在减压条件下除去溶剂，用体积比为30:1～10:1的CH2Cl2/CH3OH洗脱剂进行柱层析纯化，得到红色固体化合物Cy‑Biotin‑O，即为所述的荧光探针，其中，Cy‑Biotin‑Cl的结构如下：
3.根据权利要求1所述的一种基于花菁染料的靶向性比率pH荧光探针在制备探针中的应用，其特征在于，所述荧光探针应用于细胞内pH的检测。
说明书 :
基于花菁染料的靶向性比率pH荧光探针的制备和应用
技术领域
[0001] 本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及基于花菁染料的靶向性比率pH荧光探针的制备和应用。
背景技术
[0002] 细胞内pH在多种生命活动中起着关键作用，包括受体介导的信号转导、细胞生长和凋亡、离子转运和体内平衡、细胞内酶活性会因pH值的变化而降低甚至失活等(R.T.Kennedy,L.Huang,and C.A.Aspinwall，J.Am.Chem.Soc.,1996,118,1795‑1796；A.J.Janecki,M.H.Montrose,P.Zimniak,A.Zweibaum,C.M.Tse,S.Khurana,M.Donowitz,J Biol Chem.,1998,273,8790‑8798；D.Lagadic‑Gossmann,M.Rissel,M.Galisteo,+
A.Guillouzo,Br J Pharmacol.,1999,128,1673‑1682)。随着葡萄糖代谢的增加，癌症中H的产生和排泄通常会增加(R.Van‑Sluis,Z.M.Bhujwalla,N.Raghunand,P.Ballesteros,Magn Reson Med.,1999,41,743‑750；J.L.Wike‑Hooley,J.Haveman,H.S.Reinhold,Radiother Oncol.,1984,2,343‑366)。与生理条件下的正常组织相比，恶性肿瘤的细胞内pH较低(P.A.Schornack,R.J.Gillies,Neoplasia.,2003,5,135–145；M.Stubbs,P.M.McSheehy,J.R.Griffiths,C.L.Bashford,Mol Med Today.,2000,6,15‑19)，因此，pH被认为是重要的癌症标志物。由于pH在生理环境中的变化小，发展一种高灵敏度检测pH的策略具有重要意义。
A.Guillouzo,Br J Pharmacol.,1999,128,1673‑1682)。随着葡萄糖代谢的增加，癌症中H的产生和排泄通常会增加(R.Van‑Sluis,Z.M.Bhujwalla,N.Raghunand,P.Ballesteros,Magn Reson Med.,1999,41,743‑750；J.L.Wike‑Hooley,J.Haveman,H.S.Reinhold,Radiother Oncol.,1984,2,343‑366)。与生理条件下的正常组织相比，恶性肿瘤的细胞内pH较低(P.A.Schornack,R.J.Gillies,Neoplasia.,2003,5,135–145；M.Stubbs,P.M.McSheehy,J.R.Griffiths,C.L.Bashford,Mol Med Today.,2000,6,15‑19)，因此，pH被认为是重要的癌症标志物。由于pH在生理环境中的变化小，发展一种高灵敏度检测pH的策略具有重要意义。
[0003] 目前，已有多种方法可用于pH的测定，如H+渗透微电极法、核磁共振波谱法以及光学显微镜法等(W.Ma,L.Yan,X.He,T.Qing,Y.Lei,Z.Qiao,D.He,K.Huang,K.Wang,Anal.Chem.,2018,90,1889‑1896)。但是，这些技术通常需要使用高精度的仪器，并且样品的处理过程比较复杂，从而限制了其在活细胞水平上进行pH分析。相比于这些传统的方法，荧光探针具有响应速度快、信噪比高、非侵入性以及时空分辨率高的优点(K.K.Yu,K.Li,J.T.Hou,J.Yang,Y.M.Xie,X.Q.Yu,Polym.Chem.,2014,5,5804‑5812；Q.Yao,S.Lu,F.Lin,T.Zhao,L.Zhao,X.Chen,Sens.Actuators B Chem.,2017,250,484‑490)，非常适合生物样品中pH的检测。到目前为止，有一些检测pH的荧光探针被报道(F.Galindo,M.I.Burguete,L.Vigara,S.V.Luis,N.Kabir,J.Gavrilovic,Angew Chem Int Edit.,2005,44,6504‑6508；Y.Saito,S.Miyamoto,A.Suzuki,K.Matsumoto,T.Ishihara,I.Saito,Bioorg Med Chem Lett.,2012,22,2753‑2756；W.Liu,R.Sun,J.F.Ge,Y.J.Xu,Y.Xu,J.M.Lu,Anal.Chem.,2013,15,7419‑7425；L.L.Wu,Y.Wang,T.D.James,N.Q.Jia,C.Huang,Chem Commun.,2018,54,5518‑5521)。但是，这些pH探针存在一些不足：(1)分析波长较短，因此容易被活体内生物子产生的自发荧光信号干扰，且组织穿透能力较弱，从而限制了在生物体内的应用；(2)探针激活后只有一个波长的荧光变化，在复杂的生理环境中难以实现定量分析；(3)不能主动靶向细胞和组织，难以在特定组织聚集，分散在各处的探针会降低检测效率并使背景荧光进一步增强。因此，设计和合成具有长波长和靶向能力的比率pH荧光探针是非常有意义的。
[0004] 花菁染料是目前荧光探针领域中应用比较广泛的一类染料，它具有摩尔吸光系数大、光稳定性高等优势，最重要的是，具有近红外发射性能。近红外发射能够穿透更深的组织，不易受到生物自体荧光的干扰，对生物成像更有利。生物素是一种很好的靶向肿瘤细胞的结构，据报道，各种癌细胞，如宫颈癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌，都过度表达生物素受体(N.U.Deshpande,M.Jayakannan,Biomacromolecules.,2018,19,3572‑3585；K.Li,L.Qiu,Q.Liu,G.Lv,X.Zhao,S.Wang,J.Lin,J.Photochem.Photobiol.,2017,174,243‑250；Y.Singh,K.K.Durga‑Rao‑Viswanadham,A.Kumar‑Jajoriya,J.G.Meher,K.Raval,S.Jaiswal,J.Dewangan,H.K.Bora,S.K.Rath,J.Lal,Mol.Pharmaceutics.,2017,14,2749‑
2765)，在探针中引入生物素结构是实现肿瘤特异性分布的一种有效策略，探针在细胞和组织的特异性分布有望提升细胞中pH检测的灵敏度和信噪比。但是，现在还没有能同时靶向细胞和比率检测pH的荧光探针。因此，设计和合成一种基于花菁染料的靶向性比率pH荧光探针，作为检测细胞中pH的有效工具，是非常必要的。
2765)，在探针中引入生物素结构是实现肿瘤特异性分布的一种有效策略，探针在细胞和组织的特异性分布有望提升细胞中pH检测的灵敏度和信噪比。但是，现在还没有能同时靶向细胞和比率检测pH的荧光探针。因此，设计和合成一种基于花菁染料的靶向性比率pH荧光探针，作为检测细胞中pH的有效工具，是非常必要的。
发明内容
[0005] 根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了一种基于花菁染料的靶向性比率pH荧光探针
[0006] 本发明的技术方案是，一种基于花菁染料的靶向性比率pH荧光探针，其结构式如下：
[0007]
[0008] 一种基于花菁染料的靶向性比率pH荧光探针的制备方法。步骤如下：
[0009] 在15～25℃下，将1当量的Cy‑Biotin‑Cl用10～20mL无水DMF溶解后加入50mL的圆底烧瓶中，接着，将3～5当量的三水合乙酸钠加入上述体系；氮气保护下，升温至80～100℃，搅拌5～7h；反应完成后，冷却至室温；粗产物用盐水和二氯甲烷萃取，取有机相在减压条件下除去溶剂，用体积比为30:1～10:1的CH2Cl2/CH3OH洗脱剂进行柱层析纯化，得到红色固体化合物Cy‑Biotin‑O，即为所述的荧光探针。
[0010] 本发明的有益效果是，一种基于花菁染料的靶向性比率pH荧光探针的良好的光谱响应性能。首先，研究该探针的荧光光谱性质。荧光探针本身在645nm有荧光发射，758nm没有荧光；将pH调至酸性后，645nm的荧光明显减弱，在758nm处出现了明显的近红外荧光发射。并且随着酸性的增强，探针645nm处的荧光逐渐减弱，758nm处的近红外荧光强度不断增强。接着，研究探针的紫外吸收光谱。探针本身在540nm附近有吸收带，pH调至酸性后，540nm的吸收明显减小，在716nm附近出现新的吸收峰。然后，研究探针的选择性。考察了探针与无2+ 2+ + + 3+ ‑ ‑ ‑
机离子(Mg ,Ca ,K ,Na ,Fe )，活性氧(ClO ,H2O2,·OH)，活性氮(NO2 ,NO3)，活性硫(H2S,
2‑
SO3 )，常见氨基酸(Phe,Lys,Leu,Val,Trp,Ile,Met,Thr)以及生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)的荧光响应情况。结果发现，只有酸性环境能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。以上结果表明，此荧光探针可以灵敏地检测溶液的酸性而不受其他检测物的影响。
机离子(Mg ,Ca ,K ,Na ,Fe )，活性氧(ClO ,H2O2,·OH)，活性氮(NO2 ,NO3)，活性硫(H2S,
2‑
SO3 )，常见氨基酸(Phe,Lys,Leu,Val,Trp,Ile,Met,Thr)以及生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)的荧光响应情况。结果发现，只有酸性环境能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。以上结果表明，此荧光探针可以灵敏地检测溶液的酸性而不受其他检测物的影响。
[0011] 基于花菁染料的靶向性比率pH荧光探针的应用。在肝癌细胞中加入Cy‑Biotin‑O和不同pH值的尼日利亚霉素，检测两个通道的荧光。发现在pH＝7.4时，通道1(580～680nm)有强荧光，通道2(700～775nm)没有荧光产生；随着pH的降低，通道1的荧光逐渐减弱，通道2的荧光逐渐增强。这些结果说明探针Cy‑Biotin‑O能够比率检测细胞内的pH，为监控人体内pH相关病变提供了一种可靠的手段。
附图说明
[0012] 图1为荧光探针的合成路线。
[0013] 图2为荧光探针在不同pH下的荧光光谱图。
[0014] 横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。(A)550～750nm荧光光谱图，激发波长为540nm；(B)720～900nm荧光光谱图，激发波长为716nm。荧光探针的浓度为10μM，pH值分别为
4.12,4.30,4.50,4.72,4.93,5.09,5.31,5.44,5.59,5.82,6.02,6.24,6.44,6.67,6.84,
7.03,7.24,7.37,7.50。
4.12,4.30,4.50,4.72,4.93,5.09,5.31,5.44,5.59,5.82,6.02,6.24,6.44,6.67,6.84,
7.03,7.24,7.37,7.50。
[0015] 图3为荧光探针对不同pH荧光线性响应图。
[0016] 横坐标为pH值，纵坐标为758nm和645nm荧光强度比值的对数。
[0017] 图4为荧光探针在不同pH下的紫外可见吸收光谱图。
[0018] 荧光探针的浓度为10μM，pH值为4.12,4.30,4.50,4.72,4.93,5.09,5.31,5.44,5.59,5.82,6.02,6.24,6.44,6.67,6.84,7.03,7.24,7.37,7.50。
[0019] 图5为荧光探针的选择性图。
[0020] 荧光探针的浓度为10μM，pH为4.12和7.37。1:Blank；2:Mg2+；3:Ca2+；4:K+；5:Na+；6:3+ ‑ ‑ ‑ 2‑
Fe ；7:ClO ；8:H2O2；9:·OH；10:NO2 ；11:NO3 ；12:H2S；13:SO3 ；14:Phe；15:Lys；16:Leu；
17:Val；18:Trp；19:Ile；20:Met；21:Thr；22:Cys；23:Hcy；24:GSH，各种分析物浓度为200μM。
Fe ；7:ClO ；8:H2O2；9:·OH；10:NO2 ；11:NO3 ；12:H2S；13:SO3 ；14:Phe；15:Lys；16:Leu；
17:Val；18:Trp；19:Ile；20:Met；21:Thr；22:Cys；23:Hcy；24:GSH，各种分析物浓度为200μM。
[0021] 图6为荧光探针在不同pH下响应时间的测定。
[0022] 荧光探针的浓度为10μM，pH值为5.44,6.02,6.44,7.24。
[0023] 图7为细胞毒性试验。
[0024] 横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为细胞的存活率。
[0025] 图8荧光探针在不同pH下的细胞成像图。
[0026] 细胞在不同pH下用荧光探针Cy‑Biotin‑O进行成像。(A)通道1，不同pH下580‑680nm范围的荧光成像，激发波长为560nm；通道2，不同pH下700‑775nm范围的荧光成像，激发波长为640nm；(B)通道2和通道1荧光强度的比值与细胞pH的关系。
具体实施方式
[0027] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。
[0028] 实施例1：
[0029] 荧光探针的合成
[0030] 合成路线如图1。pH荧光探针(Cy‑Biotin‑O)的合成：在20℃下，将Cy‑Biotin‑Cl(211mg,0.25mmol)用15mL无水DMF溶解后加入50mL的圆底烧瓶中，接着，将三水合乙酸钠(136mg,1mmol)加入上述体系，氮气保护下，升温至90℃，搅拌6h；反应完成后，冷却至室温；粗产物用盐水和二氯甲烷萃取，取有机相在减压条件下除去溶剂，用体积比为20:1的
1
CH2Cl2/CH3OH洗脱剂进行柱层析纯化，得到红色固体化合物Cy‑Biotin‑O，即为荧光探针。H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.97–7.90(m,2H),7.32(d,J＝7.3Hz,2H),7.19(t,J＝7.7Hz,2H),
6.90(t,J＝7.1Hz,4H),6.44(s,1H),6.37(s,1H),5.56–5.38(m,2H),4.28(d,J＝6.4Hz,
1H),4.11(s,1H),3.87–3.70(m,4H),3.22–3.00(m,4H),2.80(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),
2.58–2.53(m,4H),2.08(t,J＝7.5Hz,2H),1.74(s,4H),1.55(s,12H),1.31(d,J＝8.6Hz,
13
4H),1.15(t,J＝7.0Hz,5H). C NMR(100MHz,DMSO‑d6)δ184.5,172.0,162.7,161.4,161.2,
143.7,143.3,138.9,138.8,132.0,131.8,127.8,127.8,125.9,125.7,121.8,120.4,
107.2,107.0,92.1,91.8,61.0,59.2,55.4,54.9,45.9,36.2,35.3,28.2,28.1,26.2,25.4,+
25.3,22.2,10.9.HRMS(ESI‑MS)for C45H58N5O3S:m/z found,[M+H] 748.4253(calcd,
748.4260)。
1
CH2Cl2/CH3OH洗脱剂进行柱层析纯化，得到红色固体化合物Cy‑Biotin‑O，即为荧光探针。H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.97–7.90(m,2H),7.32(d,J＝7.3Hz,2H),7.19(t,J＝7.7Hz,2H),
6.90(t,J＝7.1Hz,4H),6.44(s,1H),6.37(s,1H),5.56–5.38(m,2H),4.28(d,J＝6.4Hz,
1H),4.11(s,1H),3.87–3.70(m,4H),3.22–3.00(m,4H),2.80(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),
2.58–2.53(m,4H),2.08(t,J＝7.5Hz,2H),1.74(s,4H),1.55(s,12H),1.31(d,J＝8.6Hz,
13
4H),1.15(t,J＝7.0Hz,5H). C NMR(100MHz,DMSO‑d6)δ184.5,172.0,162.7,161.4,161.2,
143.7,143.3,138.9,138.8,132.0,131.8,127.8,127.8,125.9,125.7,121.8,120.4,
107.2,107.0,92.1,91.8,61.0,59.2,55.4,54.9,45.9,36.2,35.3,28.2,28.1,26.2,25.4,+
25.3,22.2,10.9.HRMS(ESI‑MS)for C45H58N5O3S:m/z found,[M+H] 748.4253(calcd,
748.4260)。
[0031] 实施例2：
[0032] 荧光探针溶液配制
[0033] 探针溶液的制备：称取一定量探针溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，配成4×10‑4M的探针溶液。十二烷基硫酸钠储备溶液的制备：将一定量的十二烷基硫酸钠超声溶解在二次蒸馏水中，配成0.2M的十二烷基硫酸钠储备溶液。将0.25mL的探针溶液、0.25mL的十二烷基硫‑5酸钠储备溶液加入10mL容量瓶，用不同pH值的PBS缓冲溶液定容。得到含有1.0×10 M荧光‑3
探针、5.0×10 M十二烷基硫酸钠的不同pH待测溶液。
探针、5.0×10 M十二烷基硫酸钠的不同pH待测溶液。
[0034] 实施例3：
[0035] 荧光探针在不同pH下荧光光谱的测定
[0036] 图2为荧光探针在不同pH下的荧光光谱，荧光探针的浓度为10μM，pH值分别为4.12,4.30,4.50,4.72,4.93,5.09,5.31,5.44,5.59,5.82,6.02,6.24,6.44,6.67,6.84,
7.03,7.24,7.37,7.50。荧光激发波长为540nm时，发射波长范围为550～750nm；荧光激发波长为716nm时，发射波长范围为720～900nm。激发和发射狭缝宽度均为5nm，所用的荧光测定仪器为日立F4600荧光分光光度计。从图中可以看出，荧光探针在pH＝7.50条件下荧光发射位于645nm，758nm几乎没有荧光；在pH值为7.50～4.12时，随着酸性的增强，在758nm处出现+
了明显的近红外发射峰，645nm的荧光发射逐渐减弱。这是由于H诱导Cy‑Biotin‑O质子化以获得具有大π共轭系统的Cy‑Biotin‑OH，从而产生近红外荧光。并且，随着酸性的增强，探针分子758nm的近红外荧光强度不断增强，645nm的荧光逐渐减弱。图3为探针在不同pH下的线性响应图。758nm和645nm荧光强度比值的对数跟pH呈现线性关系。这说明该探针可以很好地检测酸性环境的pH。
7.03,7.24,7.37,7.50。荧光激发波长为540nm时，发射波长范围为550～750nm；荧光激发波长为716nm时，发射波长范围为720～900nm。激发和发射狭缝宽度均为5nm，所用的荧光测定仪器为日立F4600荧光分光光度计。从图中可以看出，荧光探针在pH＝7.50条件下荧光发射位于645nm，758nm几乎没有荧光；在pH值为7.50～4.12时，随着酸性的增强，在758nm处出现+
了明显的近红外发射峰，645nm的荧光发射逐渐减弱。这是由于H诱导Cy‑Biotin‑O质子化以获得具有大π共轭系统的Cy‑Biotin‑OH，从而产生近红外荧光。并且，随着酸性的增强，探针分子758nm的近红外荧光强度不断增强，645nm的荧光逐渐减弱。图3为探针在不同pH下的线性响应图。758nm和645nm荧光强度比值的对数跟pH呈现线性关系。这说明该探针可以很好地检测酸性环境的pH。
[0037] 实施例4：
[0038] 荧光探针在不同pH下的紫外可见吸收光谱的测定
[0039] 图4为荧光探针在不同pH下的紫外可见吸收光谱图，荧光探针的浓度为10μM，pH值分别为4.12,4.3,4.5,4.72,4.93,5.09,5.31,5.44,5.59,5.82,6.02,6.24,6.44,6.67,6.84,7.03,7.24,7.37,7.50。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为安捷伦Cary60紫外可见分光光度计。从图中可以看出，探针本身在540nm附近有吸收带，pH调至酸性后，540nm的吸收明显减小，在716nm附近出现新的吸收峰。
[0040] 实施例5：
[0041] 荧光探针对pH测定的选择性
[0042] 图5为荧光探针pH测定的选择性图。考察在pH为4.1和7.4条件下，10μM的荧光探针2+ 2+ + + 3+ ‑
溶液中加入生物体内常见的无机离子(Mg ,Ca ,K ,Na ,Fe )，活性氧(ClO ,H2O2,·OH)，活‑ ‑ 2‑
性氮(NO2 ,NO3)，活性硫(H2S,SO3 )，常见氨基酸(Phe,Lys,Leu,Val,Trp,Ile,Met,Thr)以及生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)(200μM)的荧光响应情况。从图中可以看出，只有酸性能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。这些结果表明，荧光探针对pH有很好的选择性。
溶液中加入生物体内常见的无机离子(Mg ,Ca ,K ,Na ,Fe )，活性氧(ClO ,H2O2,·OH)，活‑ ‑ 2‑
性氮(NO2 ,NO3)，活性硫(H2S,SO3 )，常见氨基酸(Phe,Lys,Leu,Val,Trp,Ile,Met,Thr)以及生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)(200μM)的荧光响应情况。从图中可以看出，只有酸性能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。这些结果表明，荧光探针对pH有很好的选择性。
[0043] 实施例6：
[0044] 荧光探针在不同pH下响应时间的测定
[0045] 我们研究了荧光探针对pH的响应时间，其结果如图6。从图中可以看出，该探针对pH的响应时间为30s，这能够满足在实际样品中进行实时监测的要求。
[0046] 实施例7：
[0047] 荧光探针在活细胞中的应用
[0048] 首先，我们做了细胞毒性试验，如图7所示。当加入0～30μM荧光探针，肝癌细胞的成活率均在90％以上。这可以说明，该荧光探针毒性较小，可应用于检测活细胞内的pH。然后，我们研究荧光探针在活细胞中的应用，选择肝癌细胞进行共聚焦显微成像，结果如图8所示。使用不同pH的尼日利亚霉素调节细胞pH并用荧光探针Cy‑Biotin‑O进行染色。通道1收集了580～680nm范围的荧光；通道2收集了700～775nm范围的荧光。pH为7.4时，细胞在通道1有强荧光，通道2几乎没有荧光；随着pH的降低，通道1的荧光逐渐减弱，通道2荧光逐渐增强(图8A)。图8B为通道2和通道1荧光强度比值与细胞pH的关系图。这些结果说明探针Cy‑Biotin‑O能够灵敏地检测细胞内的pH，这为监控人体内pH相关病变提供了一种可靠的手段。