一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其构建方法和应用转让专利
申请号 : CN202110369372.1
文献号 : CN115161287B
文献日 : 2024-03-01
发明人 : 周磊 , 王扬 , 杨汉春 , 盖新娜 , 张永宁 , 韩军 , 郭鑫
申请人 : 中国农业大学
摘要 :
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其构建方法和应用。所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒为：基因序列中含有HiBiT序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒。本发明通过将HiBiT序列插入猪繁殖与呼吸综合征病毒的序列中，构建得到了一种具有荧光酶特性，同时可以正常增殖的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒。该重组猪繁殖与呼吸综合征病毒具备较好的遗传稳定性，通过该重组病毒可以准确快速地实现病毒的定量检测和抗病毒药物的筛选。
权利要求 :
1.一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于，所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒为：基因序列中含有HiBiT序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒；
所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒在Nsp2基因编码区的325‑335aa位点含有HiBiT序列；所述猪繁殖与呼吸综合征病毒为猪繁殖与呼吸综合征JXwn06毒株。
2.根据权利要求1所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，其特征在于，所述HiBiT序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1或2所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法，其特征在于，包括：构建猪繁殖与呼吸综合征重组病毒的克隆质粒；
将所述猪繁殖与呼吸综合征重组病毒的克隆质粒导入细胞中进行病毒拯救；
所述猪繁殖与呼吸综合征重组病毒的克隆质粒为包括HiBiT序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒序列；
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述细胞为MARC‑145、3D4/21、BHK‑
21、PK‑15或Vero中的一种或多种。
5.根据权利要求3或4所述构建方法，其特征在于，所述包括HiBiT序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒序列为：在Nsp2基因编码区的325‑335aa位点包括HiBiT序列的，猪繁殖与呼吸综合征重组病毒序列。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒。
7.权利要求1或2所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，或权利要求6所述试剂盒在抗重组猪繁殖与呼吸综合征病毒药物筛选中的应用。
8.利要求1或2所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，或权利要求6所述试剂盒在定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒滴度中应用；
所述应用不涉及疾病诊断与治疗。
说明书 :
一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其构建方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其构建方法和应用。
背景技术
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus,PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，临床上主要以妊娠母猪的流产、早产、产死胎、木乃伊胎和弱仔，以及各生产阶段猪的呼吸道疾病为特征，该病的暴发严重影响养猪生产经济效益。特别是2006年高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic PRRSV,HP‑PRRSV)的出现和广泛流行，引发严重型PRRS(Atypical PRRS)，临床上以高热、高发病率和高死亡率为特征，给养猪业造成了重大经济损失。自2013年以来，从北美传入的类NADC30毒株，已在田间广泛流行，逐渐成为田间主流毒株，且研究表明当前商品化疫苗与类NADC30缘关系较远，交叉保护效果不理想，且其与田间毒株的重组加剧了我国PRRSV毒株的多样性和复杂性，极大的增加了养猪生产中PRRS的防控难度。因此，了解猪繁殖与呼吸综合病毒的生物学特性，寻求抵抗病毒入侵、复制和增殖的策略是我们亟需解决的问题。
[0003] 构建携带荧光报告基因的标签病毒一直是研究病毒的生命周期、定量其复制增殖水平的重要手段。但是大多数荧光蛋白或荧光素酶由于分子量大等原因，插入到病毒基因组容易引发致死性突变，即使成功拯救，病毒的复制增殖也容易受到影响，且荧光标签在传代的过程中容易丢失。
[0004] 目前，还没有构建基于NanoLuc互补荧光素酶报告系统(NanoBiT)的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的相关报道。
发明内容
[0005] 为了解决现有技术存在问题，本发明提供一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒及其构建方法和应用。本发明将HiBiT序列引入猪繁殖与呼吸综合征病毒中得到一种具有荧光酶特性，同时可以正常增殖的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，通过该重组病毒可以准确快速地实现病毒的定量检测和抗病毒药物的筛选。
[0006] 第一方面，本发明提供一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒，所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒为：基因序列中含有HiBiT序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒。
[0007] 进一步地，所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒在Nsp2基因编码区的12‑22aa、325‑335aa、338‑348aa、419‑429aa位点中任一个位点，或在ORF7羧基端含有HiBiT序列。
[0008] 进一步地，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒为猪繁殖与呼吸综合征JXwn06毒株。
[0009] 进一步地，所述HiBiT序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010] 第二方面，本发明提供所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法，包括：
[0011] 构建猪繁殖与呼吸综合征重组病毒的克隆质粒；
[0012] 将所述猪繁殖与呼吸综合征重组病毒的克隆质粒导入细胞中进行病毒拯救；
[0013] 所述猪繁殖与呼吸综合征重组病毒的克隆质粒为包括HiBiT序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒序列。
[0014] 进一步地，所述包括HiBiT序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒序列为：
[0015] 在Nsp2基因编码区的12‑22aa、325‑335aa、338‑348aa、419‑429aa位点中任一个位点，或在ORF7羧基端包括HiBiT序列的，猪繁殖与呼吸综合征重组病毒序列。
[0016] 进一步地，所述细胞为MARC‑145、3D4/21、BHK‑21、PK‑15或Vero中的一种或多种。
[0017] 本发明进一步提供一种试剂盒，所述试剂盒包括所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒。
[0018] 本发明进一步提供所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒在抗病毒药物筛选中的应用。
[0019] 本发明进一步提供所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒在定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒滴度中的应用。
[0020] 本发明进一步提供Remdesivir在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。
[0021] 进一步地，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒为所述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒。
[0022] 本发明具备如下有益效果：
[0023] 本发明通过在猪繁殖与呼吸综合征病毒的序列中插入HiBiT序列，制备得到具有荧光酶特性，同时增殖能力可以和野生病毒相近的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒。该重组猪繁殖与呼吸综合征病毒具有良好的遗传稳定性，细胞中连续传代8次，荧光信号依然稳定，而且经验证其HiBiT标签未发生丢失、突变。本发明提供的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的TCID50和荧光强度呈良好的正相关，可以用于定量检测病毒滴度和抗病毒药物的筛选。
附图说明
[0024] 图1为本发明实施例1提供的重组毒株RvJX‑Nsp212‑HiBiT、RvJX‑Nsp2325‑HiBiT、RvJX‑Nsp2338‑HiBiT和RvJX‑Nsp2419‑HiBiT的全长cDNA克隆质粒的构建策略示意图；其中置换位置分别为PRRSV JXw06基因组1372‑1404；2311‑2343；2350‑2382；2593‑2625四个区域。
[0025] 图2为本发明实施例2提供的重组毒株RvJX‑ORF7‑HiBiT全长cDNA克隆质粒pWSK‑JXwn‑ORF7‑HiBiT的构建策略。
[0026] 图3为本发明实施例3提供的RvJX‑Nsp212‑HiBiT、RvJX‑Nsp2325‑HiBiT、RvJX‑Nsp2338‑HiBiT、RvJX‑Nsp2419‑HiBiT以及RvJX‑ORF7‑HiBiT在MARC‑145细胞上产生的CPE示意图(100×)；其中A为RvJX‑Nsp212‑HiBiT，B为RvJX‑Nsp2325‑HiBiT，C为RvJX‑Nsp2338‑HiBiT，D为RvJX‑Nsp2419‑HiBiT，E为RvJX‑ORF7‑HiBiT，F为对照组。
[0027] 图4为本发明实施例4提供的RvJX‑Nsp212‑HiBiT、RvJX‑Nsp2325‑HiBiT、RvJX‑Nsp2338‑HiBiT、RvJX‑Nsp2419‑HiBiT以及RvJX‑ORF7‑HiBiT的IFA鉴定结果(200×)；其中，A为RvJX‑Nsp212‑HiBiT，B为RvJX‑Nsp2325‑HiBiT，C为RvJX‑Nsp2338‑HiBiT，D为RvJX‑Nsp2419‑HiBi T，E为RvJX‑ORF7‑HiBiT，F为对照组。
[0028] 图5为本发明实施例5提供的重组病毒的荧光强度；Mock为不接毒的细胞对照，RvJXwn为亲本毒的对照。
[0029] 图6为本发明实施例6提供的P3代重组病毒的增殖和荧光特性分析结果；其中，A为病毒滴度统计结果，B为荧光强度统计结果。
[0030] 图7为本发明实施例7提供的重组病毒RvJX‑Nsp2325‑HiBiT的增殖和荧光动态曲线统计图；其中A为重组病毒RvJX‑Nsp2325‑HiBiT的增殖曲线，B为重组病毒RvJX‑Nsp2325‑HiBiT的荧光强度变化曲线。
[0031] 图8为本发明实施例8提供的重组病毒RvJX‑Nsp2325‑HiBiT的遗传稳定性分析结果；其中A为重组病毒RvJX‑Nsp2325‑HiBiT P3‑P8代荧光强度的变化，B为重组病毒RvJX‑Nsp2325‑HiBiT P3‑P8代增殖能力的变化，C为重组病毒RvJX‑Nsp2325‑HiBiT P8代的测序鉴定结果。
[0032] 图9为本发明实施例9提供的重组病毒RvJX‑Nsp2325‑HiBiT应用于抗病毒药物筛选的结果示意图；其中，A为在重组病毒RvJX‑Nsp2325‑HiBiT的体外培养液中加入多种抗病毒药物后的荧光强度变化结果，B为在重组病毒RvJX‑Nsp2325‑HiBiT的体外培养液中加入多种抗病毒药物后的病毒滴度变化结果；其中，p＞0.05(ns)为差异不显著，p＜0.05(*)为差异显著，p＜0.01(**)，p＜0.001(***)和p＜0.0001(****)为差异极显著。
具体实施方式
[0033] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0034] 本发明涉及的MARC‑145细胞用DMEM培养基培养。JXwn06毒株野生型全长cDNA克隆载体pWSK‑JXwn、克隆毒株RvJXwn公开于文献(Zhou L,Zhang J,Zeng J,Yin S,Li Y,Zheng L,Guo X,Ge X,Yang HC.2009.The 30‑amino‑acid deletion in the Nsp2 of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerging in China is not related to its virulence.J Virol.83(10):5156‑5167)；DMT酶、pEASY Blunt克隆质粒和大肠杆菌感受态Trans T1均购自北京全式金生物技术有限公司；HiBiT Lytic Detection System试剂购自于Promega(Promega Corporation,Wisconsin,USA)生物科技有限公司；PRRSV N蛋白单克隆抗体N35保藏编号为CGMCC NO.3238，公开于中国专利CN101661042B中。
[0035] 实施例1重组病毒RvJX‑Nsp212‑HiBiT，RvJX‑Nsp2325‑HiBiT，RvJX‑Nsp2338‑HiBiT,RvJX‑Nsp2419‑HiBiT全长cDNA克隆质粒的构建
[0036] 参考PRRSV JXwn06全基因组序列(GenBank收录号EF641008)，设计引物用于PRRSV重组毒株RvJX‑Nsp212‑HiBiT，RvJX‑Nsp2325‑HiBiT，RvJX‑Nsp2338‑HiBiT,RvJX‑Nsp2419‑HiBiT全长cDNA克隆的构建(表1)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，用无核酸酶的水配成使用浓度。
[0037] 表1 RvJX‑Nsp212‑HiBiT等全长cDNA克隆构建用引物
[0038]
[0039]
[0040] 注：波浪线处为限制性内切酶识别序列，横线为HiBiT序列
[0041] 重组毒株RvJX‑Nsp212‑HiBiT等全长cDNA克隆质粒的构建策略见图1。用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(高保真DNA聚合酶)(Takara,大连，中国)扩增目的片段，按照产品说明书构建50μL反应体系，扩增条件为：94℃5min，98℃30s，55℃10s，72℃2min。其中，以pWSK‑JXwn的A片段中间质粒pEASY‑Blunt‑JXw n‑A (简称pEB‑JA)为模板，分别用两对引物JAF/HiBiT12‑R&HiBi T12‑F/JAR，JAF/HiBiT325‑R&HiBiT325‑F/JAR，JAF/HiBiT338‑R&HiBiT338‑F/JAR和JAF/HiBiT419‑R&HiBiT419‑F/JAR扩增含有HiBi T的左右臂；以回收的左右臂作为模板，JAF/JAR为引物，利用融合PCR分别将对应的两个片段拼接成一个插入HiBiT基因的JXwn A片段，命名pEB‑JA‑Nsp212‑HiBiT，pEB‑JA‑Nsp2325‑HiBiT，pEB‑JA‑Nsp2338‑HiBiT和pEB‑JA‑Nsp2419‑HiBiT。将测序正确的pEB‑JA‑Nsp212‑HiBiT等对应的菌液于锥形瓶中扩大培养，中提质粒。用Sw aI和BstBI对中间质粒(pEB‑JA‑Nsp212‑HiBiT等)及全长质粒(pWSK‑JXwn)进行双酶切，回收纯化相应片段后用T4连接酶连接，完成PRRSV重组质粒的构建，命名为pWSK‑JXwn‑Nsp212‑HiBiT，pWSK‑JXwn‑Nsp2325‑HiBiT，pWSK‑JXwn‑Nsp2338‑HiBiT和pWSK‑JXwn‑Nsp2419‑HiBiT。上述实验用到的限制性内切酶均购自NEB公司(NEW England Biolabs,USA),T4 DNA连接酶和质粒提取试剂盒购自Promega公司(Promega Corporation,Wisconsin,USA),Trans T1感受态细胞购自全式金生物科技有限公司(北京，中国)。
[0042] 使用W3F/W4F及跨片段引物W5F/R进行测序鉴定表明，感染性克隆全长质粒已经构建成功，并且互补荧光素酶小亚基序列(Hi BiT)已经成功插入到PRRSV基因组中。
[0043] 实施例2重组病毒RvJX‑ORF7‑HiBiT全长cDNA克隆质粒的构建
[0044] 参考PRRSV JXwn06全基因组序列(GenBank收录号EF641008)，设计引物用于PRRSV重组毒株RvJX‑ORF7‑HiBiT全长cDNA克隆的构建(表2)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，用无核酸酶的水配成使用浓度。
[0045] 表2 RvJX‑ORF7‑HiBiT全长cDNA克隆构建用引物
[0046]
[0047] 注：波浪线为TRS2序列，横线为HiBiT序列
[0048] 重组毒株RvJX‑ORF7‑HiBiT全长cDNA克隆质粒的构建策略见图2。首先，设计突变PCR的上下游引物Mutagenic‑ORF7‑F/R,并以pWSK‑JXwn的D片段中间质粒pJET‑JXwn‑D(简称pJET‑JD)为模板扩增，将两个酶切位点AflⅡ和MluⅠ引入ORF7与3’UTR之间。PCR产物直接用DMT酶消化4h,得到具有多克隆位点的D片段质粒，命名为pJET‑JD‑AflⅡ‑MluⅠ。将测序正确的pJET‑JD‑AflⅡ‑MluⅠ扩大培养，中提。设计包含HiBiT、TRS2和AflⅡ‑MluⅠ酶切位点序列的上下游引物AflⅡ‑TRS2‑HiBiT‑MluⅠ‑F/R，退火形成双链。再用AflⅡ和MluⅠ对质粒pJET‑JD‑AflⅡ‑MluⅠ及双链AflⅡ‑TRS2‑HiBiT‑MluⅠ进行双酶切，回收纯化相应片段后用T4连接酶连接，完成pJET‑JD的改造，命名为pJET‑JD‑ORF7‑HiBiT。将测序正确的pJET‑JD‑ORF7‑HiBiT对应的菌液于锥形瓶中扩大培养，中提质粒。用AscI和PacI对中间质粒(pJET‑JD‑ORF7‑HiBiT)及全长质粒(pWSK‑JXwn)进行双酶切，回收纯化相应片段后用T4连接酶连接，完成PRRSV重组质粒的构建，命名为pWSK‑JXwn‑ORF7‑HiBiT。上述实验用到的限制性内切酶均购自NEB公司(NEW England Biolabs,USA),T4 DNA连接酶和质粒提取试剂盒购自Promega公司(Promega Corporation，Wisconsin，USA)，Trans T1感受态细胞和DMT酶购自全式金生物科技有限公司(北京，中国)。
[0049] 使用W14F及跨片段引物W11F进行测序鉴定，表明感染性克隆全长质粒已经构建成功，并且互补荧光素酶小亚基序列(HiBiT)和转录调控序列TRS2已经成功插入到PRRSV基因组中。
[0050] 实施例3重组病毒RvJX‑Nsp212‑HiBiT，RvJX‑Nsp2325‑HiBiT，RvJX‑Nsp2338‑HiBiT,RvJX‑Nsp2419‑HiBiT和RvJX‑ORF7‑HiBiT的拯救
[0051] 将MARC‑145细胞铺于6孔细胞培养板中，待其细胞密度达到80％～90％时进行转染。按照Lipofectamine LTX(Invitrogen life tech nologies,NY,USA)转染试剂的说明书，在无菌1.5ml EP管中加入300μL的Opti‑MEM，然后加入2.5μg的全长感染性克隆质粒和PL US Reagents 2.5μL，充分混匀后，室温静置5min。再加入Lipofect amine LTX 5μL，充分混匀后，室温静置20min。然后将该混合液缓慢地滴加在细胞培养板中，在37℃，5％CO2培养箱中培养3d～5d。待出现PRRSV明显的CPE后，‑80反复冻融取上清接种于单层MA RC‑145细胞上，进行连续传代，每代3‑5d。获得的拯救病毒即为RvJX‑Nsp212‑HiBiT，RvJX‑Nsp2325‑HiBiT，RvJX‑Nsp2338‑HiBiT,Rv JX‑Nsp2419‑HiBiT和RvJX‑ORF7‑HiBiT。
[0052] 在转染4‑5d后，MARC‑145细胞出现了PRRSV典型的CPE。将拯救的以JXwn06为骨架，在Nsp2高变区或ORF7羧基端插入NanoLuc荧光素酶部分序列的重组毒株命名为RvJX‑Nsp212‑HiBiT，RvJX‑Nsp2325‑HiBiT，RvJX‑Nsp2338‑HiBiT,RvJX‑Nsp2419‑HiBiT和Rv JX‑ORF7‑HiBiT。重组病毒在MARC‑145细胞上连续传代3次后出现的CPE情况，如图3所示。
[0053] 实施例4重组病毒RvJX‑Nsp212‑HiBiT，RvJX‑Nsp2325‑HiBiT，RvJX‑Nsp2338‑HiBiT,RvJX‑Nsp2419‑HiBiT和RvJX‑ORF7‑HiBiT的鉴定
[0054] 拯救病毒的间接免疫荧光鉴定：将所拯救病毒接种于已经形成100％单层MARC‑145细胞的24孔细胞培养板中，在37℃的温箱中感作1h后，弃掉上清，补加500μL新鲜的含
5％FBS的DMEM培养基，培养48h～60h。然后加入200μL预冷的无水乙醇，室温下固定30min；
弃掉乙醇，用PBS洗三遍，每次3min；然后加入PRRSV的N蛋白单克隆抗体(1:1000稀释)，每孔
200μL，37℃温箱中孵育60min；再用PBS洗涤三遍，每次3min；然后加入FIT C标记的山羊抗小鼠IgG(1:200稀释)，每孔200μL，37℃温箱中孵育60min；再用PBS洗三遍，每次3min；接着加入DAPI染液，每孔200μL，室温孵育5min；最后，在倒置荧光显微镜下观察N蛋白的特异性黄绿色荧光。
5％FBS的DMEM培养基，培养48h～60h。然后加入200μL预冷的无水乙醇，室温下固定30min；
弃掉乙醇，用PBS洗三遍，每次3min；然后加入PRRSV的N蛋白单克隆抗体(1:1000稀释)，每孔
200μL，37℃温箱中孵育60min；再用PBS洗涤三遍，每次3min；然后加入FIT C标记的山羊抗小鼠IgG(1:200稀释)，每孔200μL，37℃温箱中孵育60min；再用PBS洗三遍，每次3min；接着加入DAPI染液，每孔200μL，室温孵育5min；最后，在倒置荧光显微镜下观察N蛋白的特异性黄绿色荧光。
[0055] 如图4所示，重组病毒RvJX‑Nsp212‑HiBiT，RvJX‑Nsp2325‑HiBi T，RvJX‑Nsp2338‑HiBiT,RvJX‑Nsp2419‑HiBiT和RvJX‑ORF7‑HiBiT感染的细胞浆内可见到明亮的特异性荧光信号，对照细胞无可见的荧光。
[0056] 实施例5重组病毒RvJX‑Nsp212‑HiBiT，RvJX‑Nsp2325‑HiBi T，RvJX‑Nsp2338‑HiBiT,RvJX‑Nsp2419‑HiBiT和RvJX‑ORF7‑HiBi T的荧光性分析
[0057] 待转染的感染性克隆质粒后出现典型细胞病变时，‑80℃反复冻融取上清。分别将收集的重组病毒和亲本病毒液滴加在黑色或不透光的96孔板中，每孔50μL，并恢复至室温。按照说明书配置 HiBiT Lytic Reagent，恢复室温等体积加入到每孔病毒液
中，震荡混匀(300～600rpm)3‑10min。待样品充分混匀后，在带有发光检测模块(Luminescence module)的多功能读数仪下读数。
中，震荡混匀(300～600rpm)3‑10min。待样品充分混匀后，在带有发光检测模块(Luminescence module)的多功能读数仪下读数。
[0058] 如图5所示，与亲本毒RvJXwn相比，携带NanoLuc荧光素酶部分序列的重组病毒RvJX‑Nsp212‑HiBiT，RvJX‑Nsp2325‑HiBiT，Rv JX‑Nsp2338‑HiBiT,RvJX‑Nsp2419‑HiBiT和RvJX‑ORF7‑HiBiT表现出明亮的荧光，说明HiBiT在重组病毒中成功表达，并且可以通过外源添加互补亚基LgBiT恢复NanoLuc荧光素酶活性。
[0059] 实施例6重组病毒RvJX‑Nsp212‑HiBiT，RvJX‑Nsp2325‑HiBiT，RvJX‑Nsp2338‑HiBiT,RvJX‑Nsp2419‑HiBiT和RvJX‑ORF7‑HiBiT的增殖和荧光特性分析
[0060] 将重组病毒RvJX‑Nsp212‑HiBiT等和RvJX‑ORF7‑HiBiT传至第三代后，测定其TCID50。再把这些重组病毒稀释成相同滴度，各取50μL加入黑色或不透光的96孔板中，利用HiBiT Lyti c Detection System试剂盒测定其荧光强度。如图6所示，比较各重组病毒的滴度和荧光强度，确认RvJX‑Nsp2325‑HiBiT是本系统中荧光酶催化活性发挥最好的重组病毒。
[0061] 实施例7绘制重组毒株RvJX‑Nsp2325‑HiBiT增殖和荧光动态曲线分析
[0062] 将重组病毒RvJX‑Nsp2325‑HiBiT用DMEM培养基稀释成MOI＝0.1，接种于单层MARC‑145细胞的24孔板中，并分别于接毒后12h、24h、36h、48h、60h和72h收样，冻融后取上清，用间接免疫荧光测定重组病毒在各时相的TCID50。每个样品的毒价重复测定三次。同时取12h、
24h、36h、48h、60h和72h收集的病毒样品，每孔50μL滴加在96孔板中，再加入等体积的HiBiT Lyti c Reagent在室温下充分震荡混匀10min后，在发光检测仪下读
数。每个样品的荧光强度重复测定三次。
24h、36h、48h、60h和72h收集的病毒样品，每孔50μL滴加在96孔板中，再加入等体积的HiBiT Lyti c Reagent在室温下充分震荡混匀10min后，在发光检测仪下读
数。每个样品的荧光强度重复测定三次。
[0063] 绘制重组病毒增殖和荧光动态曲线，如图7所示，重组病毒Rv JX‑Nsp2325‑HiBiT的荧光强度和病毒滴度呈良好的正相关，并且在接毒后的36h达到峰值，而亲本病毒无特异性荧光。
[0064] 实施例8重组病毒RvJX‑Nsp2325‑HiBiT的遗传稳定性分析
[0065] 将P3代重组毒株RvJX‑Nsp2‑HiBiT接种于生长良好的MARC‑145单层细胞，37℃孵育1h后加入2％DMEM培养液，培养3‑5d，至约80％细胞出现CPE时收获病毒，反复冻融3次；取细胞冻融液1mL，重复以上步骤，进行传代，直至传至8代(P8)。取各代次的病毒液，分别测定毒价和荧光强度，每个样品重复测定三次。用鉴定引物W3F测定P8代病毒基因组序列，确认Nsp2高变区的HiBi T标签是否丢失或突变。
[0066] 图8说明，经过多次连续的体外传代，重组病毒对MARC‑145细胞适应能力显著提高，其复制增殖能力与亲本毒相似。并且，重组病毒的荧光信号在传代中保持稳定，基因组测序验证其HiBiT标签未发生丢失、突变。
[0067] 实施例9重组病毒RvJX‑Nsp2325‑HiBiT抗病毒药物筛选的初步应用
[0068] 研究表明，Remdesivir、Sofosbuvir、EIDD‑2801和Ribavirin具有广谱的抗病毒效应。本实验中首先将重组病毒RvJX‑Nsp2325‑HiBi T以MOI＝0.1接种于长满单层MARC‑145细胞的48孔板中，感作1h后，再分别加入含有不同浓度的四种抗病毒药物(10μM/L、50μM/L、100μM/L)的2％DMEM，培养36h后收取样品，‑80℃冻融取上清。最后同时测定所收集病毒液的TCID50和荧光强度，验证两者趋势是否保持一致。
[0069] 如图9所示，在重组病毒RvJX‑Nsp2325‑HiBiT的体外培养中加入Remdesivir的荧光强度下降最明显，近1000倍，加入EIDD‑2801和Ribavirin的荧光强度下降较小，而加入Sofosbuvir几乎没有变化，并且右图的TCID50与左图的荧光强度趋势基本保持一致，说明该重组病毒荧光值的高低能有力代表病毒滴度的变化。另外，如表3所示，基于重组病毒荧光值的抗病毒药物筛选策略与传统的TCID50相比，时间和效率大幅提升，能有效用于抗病毒药物的高通量筛选。
[0070] 表3基于重组病毒荧光值或传统TCID50的抗病毒药物筛选策略对比
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[0073] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。