一种猪鼻支原体培养基

摘要

本发明提供了一种猪鼻支原体培养基及其制备方法，培养基的组分包括MEM维生素溶液500～900ml，PPLO肉汤粉3～10g，水解乳蛋白0～5g，无水葡萄糖0～10g，N‑乙酰神经氨酸0.1～1g，酪蛋白氨基酸水解物2～5g。本发明还提供了一种猪鼻支原体培养基的制备方法，培养基中血清添加量由15％降至5％，并简化了培养基配制流程，可以保证在不影响活菌数得情况下，将猪鼻支原体总蛋白含量提升3～5倍，本发明获得的高纯度猪鼻支原体灭活抗原，可直接用于疫苗制备。

权利要求

1.一种猪鼻支原体培养基，其特征在于，所述培养基的组分为MEM维生素溶液900ml，PPLO肉汤粉3g，无水葡萄糖5g，N‑乙酰神经氨酸0.3g，酪蛋白氨基酸水解物3g；

所述的培养基还需加入5% 15%的猪血清。

~

2.根据权利要求1所述猪鼻支原体培养基，其特征在于，所述培养基的制备方法为：

1）称取PPLO肉汤粉3g，无水葡萄糖5g，N‑乙酰神经氨酸0.3g，酪蛋白氨基酸水解物3g，溶解于100ml注射用水中，配制成基础营养液；

2）加入900ml 1×MEM维生素溶液混合，用1mol/L NaOH溶液调节pH值至7.5±0.2，再用

0.22μm滤器过滤除菌，2‑8℃保存；

3）按5% 15%（v/v）比例向基础培养液中添加灭活补体的无菌猪血清，配制成完全培养~基。

3.一种使用如权利要求1所述的猪鼻支原体培养基的发酵培养方法。

4.根据权利要求3所述的猪鼻支原体培养基的发酵培养方法，其特征在于，所述发酵培养方法采用发酵罐培养，培养基总量为发酵罐容积的60 70%，溶氧控制在20%±5%，搅拌转~速100 150r/min，溶氧与转速级联控制，发酵培养总时间不超过48h。

~

5.根据权利要求4所述的猪鼻支原体培养基的发酵培养方法，其特征在于，所述发酵罐的搅拌桨为三叶扇形搅拌桨。

说明书

一种猪鼻支原体培养基

技术领域

[0001] 本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种猪鼻支原体培养基。

背景技术

[0002] 猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis，Mhr)是引发猪多发性浆膜炎(心包炎、胸膜炎、腹膜炎等)和关节炎的主要病原之一，猪鼻支原体通常感染3～10周龄左右的猪，但对7周龄左右的猪感染力最强，可使猪只出现精神沉郁、被毛粗乱、咳嗽、腹式呼吸、跛行、关节肿胀等临床症状，引发严重的多发性浆膜炎和多发性关节炎，导致保育猪生长迟缓、饲料转化率降低，对生猪养殖造成较大经济损失。猪鼻支原体感染后会增加猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒发病的严重程度，并干扰猪肺炎支原体的分离。

[0003] 目前多使用KM2培养基、A26培养基、支原体液体培养基等培养猪鼻支原体，但上述培养基配制过程繁琐，添加成分比较多，血清用量一般在20％～30％，并且猪鼻支原体总蛋白产量较低，每升猪鼻支原体培养物含猪鼻支原体总蛋白约为20～40mg，经济成本较高，不适于在大规模生产中使用。因此，开发一种高效，操作简单，适于大规模生产的猪鼻支原体培养基对于猪鼻支原体疫苗研发和相关疾病预防具有重要意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供了一种猪鼻支原体培养基。

[0005] 本发明的目的还在于提供了一种猪鼻支原体培养基的制备方法。

[0006] 本发明的目的还在于提供了一种高效的猪鼻支原体的培养工艺，可使活菌数达到10
7.15×10 CCU50/ml，猪鼻支原体总蛋白产量能达到60～120mg/L。

[0007] 为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 一种猪鼻支原体培养基，所述培养基的组分包括MEM维生素溶液，PPLO肉汤粉，水解乳蛋白，无水葡萄糖，N‑乙酰神经氨酸，酪蛋白氨基酸水解物。

[0009] 所述培养基的组分包括MEM维生素溶液500～900ml，PPLO肉汤粉3～10g，水解乳蛋白0～5g，无水葡萄糖0～10g，N‑乙酰神经氨酸0.1～1g，酪蛋白氨基酸水解物2～5g。

[0010] 所述培养基的组分包括MEM维生素溶液900ml，PPLO肉汤粉3g，无水葡萄糖5g，N‑乙酰神经氨酸0.3g，酪蛋白氨基酸水解物3g。

[0011] 所述培养基还需加入5％～15％的猪血清。

[0012] 所述培养基的制备方法为：

[0013] 1)称取PPLO肉汤粉3g，无水葡萄糖5g，N‑乙酰神经氨酸0.3g，酪蛋白氨基酸水解物3g，溶解于100ml注射用水中，配制成基础营养液；

[0014] 2)加入900ml 1×MEM维生素溶液混合，用1mol/L NaOH溶液调节pH值至7.5±0.2，再用0.22μm滤器过滤除菌，2‑8℃保存。

[0015] 3)按5％～15％(v/v)比例向基础培养液中添加灭活补体的无菌猪血清，配制成完全培养基。

[0016] 一种采用上述制备方法的猪鼻支原体发酵培养工艺。

[0017] 所述发酵培养工艺采用发酵罐培养，培养基总量为发酵罐容积的60～70％，溶氧控制在20％±5％，搅拌转速100‑200r/min，溶氧与转速级联控制，发酵培养总时间不超过48h。

[0018] 所述发酵培养工艺采用发酵罐培养，所述发酵罐的搅拌桨为三叶扇形搅拌桨。

[0019] 相对于现有技术，本发明具有以下优势：

[0020] 本发明提供了一种猪鼻支原体培养基的配方和制备方法，该配方可使血清添加量10
由15％降至5％，使猪鼻支原体在发酵培养24～48h，活菌数达到7.15×10 CCU50/ml，总蛋白浓度达到60～120mg/L，降低了成本，简化了配制流程，获得了高纯度猪鼻支原体灭活抗原，满足猪鼻支原体疫苗生产需求。

[0021] 常规细菌类培养基中一般含有氨基酸、胆固醇、糖类以及其他微量元素等，营养成分不足或不能被支原体所利用时，会导致支原体生长缓慢，产量下降。但培养支原体的培养基并不是营养越高越好，当酵母粉等营养成分过多时还会抑制支原体生长。

具体实施方式

[0022] 以下具体说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。

[0023] 以下实施例中使用的试剂、培养基、宿主菌等生物原料均来自商业化产品。

[0024] 实施例1猪鼻支原体培养基(RPMR)不同组分添加量的对比试验

[0025] 1、RPMR‑1培养基配制及比较

[0026] (1)RPMR‑1.1培养基配制：

[0027] 1)称取PPLO肉汤粉10g，水解乳蛋白5g，无水葡萄糖10g，溶解于500ml注射用水中，配制成营养液(简称A液)。

[0028] 2)将500ml配制好的A液和500ml 1×MEM维生素溶液混合，用1mol/L NaOH溶液调节pH值至7.5±0.2，再用0.22μm滤器过滤除菌，2‑8℃保存。

[0029] 3)按20％(v/v)比例向基础培养液中添加灭活补体的无菌猪血清，配制成RPMR‑1.1完全培养基。

[0030] (2)RPMR‑1.2培养基配制：与RPMR‑1.1培养基成分一致，仅调整A液体积为300ml，与700ml 1×MEM维生素溶液混合。

[0031] (3)RPMR‑1.3培养基配制：与RPMR‑1.1培养基成分一致，仅调整A液体积为100ml，与900ml 1×MEM维生素溶液混合。

[0032] 2、RPMR‑2培养基配制及比较

[0033] (1)RPMR‑2.1培养基配制：配制方法同RPMR‑1.3培养基，仅在其基础上添加N‑乙酰神经氨酸1g。

[0034] (2)RPMR‑2.2培养基配制：配制方法同RPMR‑1.3培养基，仅在其基础上添加酪蛋白氨基酸水解物5g。

[0035] (3)RPMR‑2.3培养基配制：配制方法同RPMR‑1.3培养基，仅在其基础上添加酪蛋白氨基酸水解物5g，添加N‑乙酰神经氨酸1g。

[0036] 3、RPMR‑3培养基配制及比较

[0037] (1)RPMR‑3.1培养基配制：配制方法同RPMR‑2.3培养基，仅在其基础上将水解乳蛋白添加量调整为3g。

[0038] (2)RPMR‑3.2培养基配制：配制方法同RPMR‑2.3培养基，仅在其基础上将水解乳蛋白添加量调整为1g。

[0039] (3)RPMR‑3.3培养基配制：配制方法同RPMR‑2.3培养基，仅在其基础上将水解乳蛋白添加量调整为0g。

[0040] 4、RPMR‑4培养基配制及比较

[0041] (1)RPMR‑4.1培养基配制：配制方法同RPMR‑3.3培养基，仅在其基础上将PPLO肉汤添加量调整为5g。

[0042] (2)RPMR‑4.2培养基配制：配制方法同RPMR‑3.3培养基，仅在其基础上将PPLO肉汤添加量调整为3g。

[0043] (3)RPMR‑4.3培养基配制：配制方法同RPMR‑3.3培养基，仅在其基础上将PPLO肉汤添加量调整为0g。

[0044] 5、RPMR‑5培养基配制及比较

[0045] (1)RPMR‑5.1培养基配制：配制方法同RPMR‑4.2培养基，仅在其基础上将无水葡萄糖添加量调整为5g。

[0046] (2)RPMR‑5.2培养基配制：配制方法同RPMR‑4.2培养基，仅在其基础上将无水葡萄糖添加量调整为3g。

[0047] (3)RPMR‑5.3培养基配制：配制方法同RPMR‑4.2培养基，仅在其基础上将无水葡萄糖添加量调整为0g。

[0048] 6、RPMR‑6培养基配制及比较

[0049] (1)RPMR‑6.1培养基配制：配制方法同RPMR‑5.1培养基，仅在其基础上将N‑乙酰神经氨酸0.5g，含酪蛋白氨基酸水解物4g。

[0050] (2)RPMR‑6.2培养基配制：配制方法同RPMR‑5.1培养基，仅在其基础上将N‑乙酰神经氨酸0.3g，含酪蛋白氨基酸水解物3g。

[0051] (3)RPMR‑6.3培养基配制：配制方法同RPMR‑5.1培养基，仅在其基础上将N‑乙酰神经氨酸0.1g，含酪蛋白氨基酸水解物2g。

[0052] 7、RPMR‑7培养基配制及比较

[0053] (1)RPMR‑7.1培养基配制：配制方法同RPMR‑6.1培养基，仅在其基础上将猪血清添加量调整为15％。

[0054] (2)RPMR‑7.2培养基配制：配制方法同RPMR‑6.1培养基，仅在其基础上将猪血清添加量调整为10％。

[0055] (3)RPMR‑7.3培养基配制：配制方法同RPMR‑6.1培养基，仅在其基础上将猪血清添加量调整为5％。

[0056] 8、不同含量RPMR培养基培养猪鼻支原体

[0057] (1)菌种复苏：取冻干的猪鼻支原体CVCC361株，按1:10比例用RPMR‑1.1完全培养基进行复苏，37℃静置培养48～72h，待培养物颜色呈橘黄色，pH值6.9±0.1时收获菌液，纯粹检验合格作为复苏菌种。

[0058] (2)一级种子制备：取复苏或传代菌种按1:10比例接种于RPMR‑1.1完全培养基中，37℃培养30～48h，待培养物颜色呈橘黄色，pH值6.9±0.1时收获菌液，纯粹检验合格作为一级种子。

[0059] (3)二级种子制备：取一级种子按1:10比例接种于RPMR‑1.1完全培养基中，37℃、50r/min培养30～48h，待培养物颜色呈橘黄色，轻微浑浊，pH值6.9±0.1时收获菌液，纯粹检验合格作为二级种子。

[0060] (4)分别用不同含量RPMR培养基(RPMR‑1～RPMR‑7)培养猪鼻支原体[0061] 分别取猪鼻支原体二级种子，按10％比例接种于1L不透气锥形瓶中，不同含量RPMR培养基体积为容器体积的1/5，37℃静置培养48h。

[0062] (5)活菌计数(CCU50)：对以上猪鼻支原体培养物进行10倍比稀释至10‑11，分别从‑7 ‑8 ‑9 ‑10 ‑1110 、10 、10 、10 、10 ，每管中各取0.2mL加入到装有1.8mL培养基的小管中，每个稀释度设6个重复，共计30支小管，置37℃静置培养。2周后进行结果判定，统计各个稀释度培养基变色(pH变化值≥0.5)的小管数量，按照Reed和Muench法计算半数变色单位(CCU50)。

[0063] 表1不同营养成分RPMR培养基对比

[0064]

[0065] 实施例2

[0066] 不同培养方式培养猪鼻支原体，具体包括：

[0067] 1、RPMR培养基配制：

[0068] (1)A液配制：称取PPLO肉汤粉3g，无水葡萄糖5g，N‑乙酰神经氨酸0.3g，酪蛋白氨基酸水解物3g，溶解于100ml注射用水中，配制成营养液(简称A液)。

[0069] (2)将100ml配制好的A液和900ml 1×MEM维生素溶液混合，用1mol/L NaOH溶液调节pH值至7.5±0.2，再用0.22μm滤器过滤除菌，2‑8℃保存。

[0070] (3)完全培养基配制：按7％(v/v)比例向基础培养液中添加灭活补体的无菌猪血清，配制成RPMR完全培养基。

[0071] 2、用RPMR培养基在不同培养方式下培养猪鼻支原体

[0072] (1)菌种复苏：取冻干的猪鼻支原体CVCC361株，按1:10比例用RPMR完全培养基进行复苏，37℃静置培养48～72h，待培养物颜色呈橘黄色，pH值6.9±0.1时收获菌液，纯粹检验合格作为复苏菌种。

[0073] (2)一级种子制备：取复苏或传代菌种按1:10比例接种于RPMR完全培养基中，37℃培养30～48h，待培养物颜色呈橘黄色，pH值6.9±0.1时收获菌液，纯粹检验合格作为一级种子。

[0074] (3)二级种子制备：取一级种子按1:10比例接种于RPMR完全培养基中，37℃、50r/min培养30～48h，待培养物颜色呈橘黄色，轻微浑浊，pH值6.9±0.1时收获菌液，纯粹检验合格作为二级种子。

[0075] (4)猪鼻支原体不同培养方式活菌数和总蛋白浓度对比

[0076] 1)静置培养：取猪鼻支原体二级种子，按10％比例接种于5L不透气锥形瓶中，RPMR培养基体积为容器体积的1/5，37℃静置培养48h。

[0077] 2)摇瓶培养：取猪鼻支原体二级种子，按10％比例接种于5L不透气锥形瓶中，RPMR培养基体积为容器体积的1/5，37℃、100r/min培养48h。

[0078] 3)发酵培养：取猪鼻支原体二级种子，按10％比例接种于10L发酵罐中，使用3叶扇形搅拌桨，RPMR培养基体积为容器体积的60％，37℃、DO控制在20％±5％，转速100‑150r/min，转速与溶氧级联控制，待pH值下降至7.1±0.1时，用1mol/L NaOH溶液自动调节pH值，并继续培养10h后停止调节pH值，至pH值降至6.8±0.1时收获菌液，培养时间不超过48h。

[0079] 4)活菌计数(CCU50)：对以上猪鼻支原体培养物进行10倍比稀释至10‑11，分别从10‑7 ‑8 ‑9 ‑10 ‑11、10 、10 、10 、10 ，每管中各取0.2mL加入到装有1.8mL培养基的小管中，每个稀释度设6个重复，共计30支小管，置37℃静置培养。2周后进行结果判定，统计各个稀释度培养基变色(pH变化值≥0.5)的小管数量，按照Reed和Muench法计算半数变色单位(CCU50)。

[0080] 5)菌液浓缩及灭活：先分别用100KD膜包对菌液进行10倍浓缩，再12000r/min离心40min，用无K+的PBS溶液重选至原体积的1/50，将浓缩50倍的菌液在37℃、50r/min条件下，用4％(m/v)的BEI溶液灭活24h，BEI终浓度为0.1％，灭活后向灭活菌液中加入50％(m/V)的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2％，室温50r/min阻断1h，将灭活阻断后的菌液进行超声处理，条件为超声功率350W，超声5s，间歇10s，总时长10min。

[0081] 6)蛋白浓度测定：用商品化的总蛋白浓度测定试剂盒(BCA试剂盒)分别测定超声后菌液的总蛋白浓度。

[0082] 3、不同培养方式下猪鼻支原体活菌数及总蛋白浓度

[0083] 活菌计数(CCU50)结果见表2，总蛋白浓度测定结果见表3。

[0084] 表2不同培养方式下猪鼻支原体CCU50测定结果

[0085]

[0086] 表3不同培养方式下猪鼻支原体浓缩纯化及蛋白浓度结果

[0087]

[0088] 分别用静置、摇瓶和发酵培养的方式，配合RPMR培养基对猪鼻支原体进行培养，活9 10 10
菌数(CCU50)分别为5.00×10CCU50/ml、2.86×10 CCU50/ml和7.17×10 CCU50/ml，50倍浓缩菌液蛋白浓度分别为1376.28mg/L、3962.56mg/L、3632.56mg/L，从表2和表3结果来看，发酵培养和摇瓶培养活菌数均较高，摇瓶和发酵培养的菌液蛋白浓度为静置培养的2倍以上，摇瓶的产量最高，但考虑到实际生产条件，发酵培养更适于大规模生产。

[0089] 实施例3不同培养基的效果对比实验

[0090] 比较RPMR培养基、KM2培养基、A26培养基培和支原体液体培养基养猪鼻支原体的差异性，具体包括：

[0091] 1、RPMR培养基配制：

[0092] (1)A液配制：称取PPLO肉汤粉3g，无水葡萄糖5g，N‑乙酰神经氨酸0.3g，酪蛋白氨基酸水解物3g，溶解于100ml注射用水中，配制成营养液(简称A液)。

[0093] (2)将100ml配制好的A液和900ml 1×MEM维生素溶液混合，用1mol/L NaOH溶液调节pH值至7.5±0.2，再用0.22μm滤器过滤除菌，2‑8℃保存。

[0094] (3)完全培养基配制：按7％(v/v)比例向基础培养液中添加灭活补体的无菌猪血清，配制成RPMR完全培养基。

[0095] 2、KM2培养基配制(参考兽药质量标准2017年版生物制品卷)

[0096] (1)每1000ml培养基中含Eagle氏液500ml、青霉素200单位/ml、1％水解乳蛋白液290ml、鲜酵母浸出汁10ml、酚红0.02g、灭活猪血清200ml。除血清外其他成分均过滤除菌，血清56℃灭活30min后使用，用无菌1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.4～7.6，4℃保存。

[0097] (2)酵母浸出液制备(参考兽用生物制品规程2000版)

[0098] 取新鲜酵母500g加双蒸水1500ml搅拌均匀，充分溶解后煮沸15min，快速冷却，4000r/min离心15min，提取上清；再煮沸15min，快速冷却，用K型滤板过滤，再用0.22μm滤器过滤除菌或116℃高压灭菌20min，2‑8℃保存。

[0099] 3、A26培养基配制(参考猪支原体肺炎诊断技术，NY/T1186‑2006)[0100] (1)1％水解乳蛋白Hank's液500ml、牛心消化汤250ml、犊牛血清200ml、50％葡萄糖20ml、酵母浸出液10ml、青霉素20万IU、1％酚红2ml、1％辅酶I10ml，未添加醋酸铊溶液，以上各种成分分别经灭菌或除菌后混合，在无菌条件下，用灭菌的氢氧化钠溶液调节pH至7.6。

[0101] (2)牛心消化汤配制(参考兽用生物制品规程2000版)

[0102] 牛心1000g、无水碳酸钠13.2g、胰浸液33ml、氯仿10ml、盐酸26.5ml、去离子水1600ml。

[0103] 4、支原体液体培养基(参考中国兽药典)

[0104] 称取PPLO肉汤粉21g、含1个结晶水葡萄糖5g、10％精氨酸溶液、10倍浓缩MEM培养液、酵母浸出粉5g、8万单位/ml青霉素、猪血清100ml、1％酚红溶液1ml，注射用水定容至1000ml，未添加醋酸铊溶液，将上述成分混合溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.6～7.8，过滤除菌，‑20℃以下保存。

[0105] 5、不同培养基培养猪鼻支原体

[0106] (1)菌种复苏：取冻干的猪鼻支原体CVCC361株，按1:10比例用RPMR完全培养基进行复苏，37℃静置培养48～72h，待培养物颜色呈橘黄色，pH值6.9±0.1时收获菌液，纯粹检验合格作为复苏菌种。

[0107] (2)一级种子制备：取复苏或传代菌种按1:10比例接种于RPMR完全培养基中，37℃培养30～48h，待培养物颜色呈橘黄色，pH值6.9±0.1时收获菌液，纯粹检验合格作为一级种子。

[0108] (3)二级种子制备：取一级种子按1:10比例接种于RPMR完全培养基中，37℃、50r/min培养30～48h，待培养物颜色呈橘黄色，轻微浑浊，pH值6.9±0.1时收获菌液，纯粹检验合格作为二级种子。

[0109] (4)4种培养基10L发酵罐培养猪鼻支原体比较

[0110] 分别取猪鼻支原体二级种子，按10％比例接种于含RPMR培养基、KM2培养基、A26培养基和支原体液体培养基的10L发酵罐中，使用3叶扇形搅拌桨，培养基体积均为容器体积的60％，37℃、DO控制在20％±5％，转速100～150r/min，转速与溶氧级联控制，待pH值下降至7.1±0.1时，用1mol/L NaOH溶液自动调节pH值，并继续培养10h后停止调节pH值，至pH值降至6.8±0.1时收获菌液，培养时间不超过48h。

[0111] (5)活菌计数(CCU50)：对以上猪鼻支原体培养物进行10倍比稀释至10‑11，分别从‑7 ‑8 ‑9 ‑10 ‑1110 、10 、10 、10 、10 ，每管中各取0.2mL加入到装有1.8mL培养基的小管中，每个稀释度设6个重复，共计30支小管，置37℃静置培养。2周后进行结果判定，统计各个稀释度培养基变色(pH变化值≥0.5)的小管数量，按照Reed和Muench法计算半数变色单位(CCU50)。

[0112] (6)菌液浓缩及灭活：先分别用100KD膜包对菌液进行10倍浓缩，再12000r/min离心40min，用无K+的PBS溶液重悬至原体积的1/50，将浓缩50倍的菌液在37℃、50r/min条件下，用4％(m/v)的BEI溶液灭活24h，BEI终浓度为0.1％，灭活后向灭活菌液中加入50％(m/V)的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2％，室温50r/min阻断1h，将灭活阻断后的菌液进行超声处理，条件为超声功率350W，超声5s，间歇10s，总时长10min。

[0113] (7)蛋白浓度测定：用商品化的总蛋白浓度测定试剂盒(BCA试剂盒)分别测定超声后菌液的总蛋白浓度。

[0114] 6、不同培养培养基培养猪鼻支原体活菌数及总蛋白浓度

[0115] 总蛋白浓度测定结果见表4，活菌计数(CCU50)结果见表5。

[0116] 表4不同培养培养基发酵培养猪鼻支原体浓缩纯化及蛋白浓度结果

[0117]

[0118] 表5不同培养基发酵培养猪鼻支原体CCU50测定结果

[0119]

[0120] 分别用RPMR、KM2、A26和支原体液体培养基，配合本发明发酵工艺对猪鼻支原体进10 9 8
行培养，活菌数(CCU50)分别为3.78×10 CCU50/ml、1.16×10CCU50/ml、7.15×10 CCU50/ml
9
和1.58×10 CCU50/ml，50倍浓缩菌液蛋白浓度分别为3873.54mg/L、1817.52mg/L、
1152.66mg/L和1600.72mg/L，从结果来看，不同培养基发酵培养猪鼻支原体活菌数差别在‑10
20～50倍左右，RPMR培养基血清添加比例最低，效果最好，活菌数能达到1×10 以上，蛋白浓度差异在2～3倍左右。

[0121] 实施例4

[0122] 比较猪鼻支原体发酵过程中三叶扇形搅拌桨与六平叶搅拌桨的差异，具体包括：

[0123] 1、RPMR培养基配制：

[0124] (1)A液配制：称取PPLO肉汤粉3g，无水葡萄糖5g，N‑乙酰神经氨酸0.3g，酪蛋白氨基酸水解物3g，溶解于100ml注射用水中，配制成营养液(简称A液)。

[0125] (2)将100ml配制好的A液和900ml 1×MEM维生素溶液混合，用1mol/L NaOH溶液调节pH值至7.5±0.2，再用0.22μm滤器过滤除菌，2‑8℃保存。

[0126] (3)完全培养基配制：按7％(v/v)比例向基础培养液中添加灭活补体的无菌猪血清，配制成RPMR完全培养基。

[0127] 2、用不同搅拌桨的发酵罐培养猪鼻支原体

[0128] (1)菌种复苏：取冻干的猪鼻支原体CVCC361株，按1:10比例用RPMR完全培养基进行复苏，37℃静置培养48～72h，待培养物颜色呈橘黄色，pH值6.9±0.1时收获菌液，纯粹检验合格作为复苏菌种。

[0129] (2)一级种子制备：取复苏或传代菌种按1:10比例接种于RPMR完全培养基中，37℃培养30～48h，待培养物颜色呈橘黄色，pH值6.9±0.1时收获菌液，纯粹检验合格作为一级种子。

[0130] (3)二级种子制备：取一级种子按1:10比例接种于RPMR完全培养基中，37℃、50r/min培养30～48h，待培养物颜色呈橘黄色，轻微浑浊，pH值6.9±0.1时收获菌液，纯粹检验合格作为二级种子。

[0131] (4)发酵罐培养猪鼻支原体比较

[0132] 分别取猪鼻支原体二级种子，按10％比例接种于含RPMR培养基的两个发酵罐中，其中一个发酵罐使用3叶扇形搅拌桨，另一个发酵罐使用六平叶搅拌桨，培养基体积均为容器体积的60％，37℃、DO控制在20％±5％，转速100～150r/min，转速与溶氧级联控制，待pH值下降至7.1±0.1时，用1mol/L NaOH溶液自动调节pH值，并继续培养10h后停止调节pH值，至pH值降至6.8±0.1时收获菌液，培养时间不超过48h。

[0133] (5)活菌计数(CCU50)：对以上猪鼻支原体培养物进行10倍比稀释至10‑11，分别从‑7 ‑8 ‑9 ‑10 ‑1110 、10 、10 、10 、10 ，每管中各取0.2mL加入到装有1.8mL培养基的小管中，每个稀释度设6个重复，共计30支小管，置37℃静置培养。2周后进行结果判定，统计各个稀释度培养基变色(pH变化值≥0.5)的小管数量，按照Reed和Muench法计算半数变色单位(CCU50)。

[0134] (6)菌液浓缩及灭活：先分别用100KD膜包对菌液进行10倍浓缩，再12000r/min离心40min，用无K+的PBS溶液重选至原体积的1/50，将浓缩50倍的菌液在37℃、50r/min条件下，用4％(m/v)的BEI溶液灭活24h，BEI终浓度为0.1％，灭活后向灭活菌液中加入50％(m/V)的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2％，室温50r/min阻断1h，将灭活阻断后的菌液进行超声处理，条件为超声功率350W，超声5s，间歇10s，总时长10min。

[0135] (7)蛋白浓度测定：用商品化的总蛋白浓度测定试剂盒(BCA试剂盒)分别测定超声后菌液的总蛋白浓度。

[0136] 3、不同培养培养基培养猪鼻支原体活菌数及总蛋白浓度

[0137] 总蛋白浓度测定结果见表6，活菌计数(CCU50)结果见表7。

[0138] 表6不同培养培养基发酵培养猪鼻支原体浓缩纯化及蛋白浓度结果

[0139]

[0140] 分别用三叶扇形搅拌桨和六平叶搅拌桨的发酵罐对猪鼻支原体进行培养，活菌数10 10
(CCU50)分别为7.15×10 CCU50/ml、2.20×10 CCU50/ml，50倍浓缩菌液蛋白浓度分别为
3951.96mg/L和2906.76mg/L，从表6和表7结果来看，在相同条件下，不同搅拌桨发酵猪鼻支‑10
原体活菌数均能达到1×10 以上，三叶扇形搅拌桨培养猪鼻支原体效果较好，蛋白浓度能提高3.4倍左右。

[0141] 表7不同培养基发酵培养猪鼻支原体CCU50测定结果

[0142]