一种能高效生产单磷酸类脂A疫苗佐剂的重组大肠杆菌

摘要

本发明公开了一种能高效生产单磷酸类脂A疫苗佐剂的重组大肠杆菌，属于基因工程和合成生物学领域。本发明敲除了大肠杆菌MG1655基因组上O‑抗原基因簇gnd‑galF，核心糖基因簇rfaD‑waaQ，肠共同抗原基因簇rfe‑rffM，克拉酸基因簇wcaM‑wza和磷脂转运系统mlaA、mlaC和pldA基因，并过表达弗朗西斯菌染色体中的FnlpxE和沙门氏菌染色体中的SepagP，SepagL基因得到重组菌MW012/pWEPL。通过简单的发酵，MW012/pWEPL菌株能高效合成单磷酸六酰化类脂A(MPL)，MPL在全部类脂A中的比例高达到75％。

权利要求

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌敲除了大肠杆菌基因组上的O‑抗原基因簇、核心糖基因簇、肠共同抗原基因簇、克拉酸基因簇以及磷脂转运系统相关基因，并过表达了来自弗朗西斯菌基因组中的脱磷酸酶和沙门氏菌基因组中的十六酰基转移酶和脱酰基酶；

所述O‑抗原基因簇wbbL‑galF包含13个基因，分别为gnd、wbbL、wbbK、wbbJ、wbbI、rfc、glf、rfbX、rfbC、rfbA、rfbD、rfbB、galF，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_416533.1"、"NP_416534.1"、"NP_416536.1"、"NP_416537.1"、"NP_416538.1"、"NP_416539.1"、"NP_

416540.1"、"NP_416541.1"、"NP_416542.1"、"NP_416543.1"、"NP_416544.1"、"NP_

416545.1"、"NP_416546.1"；

所述核心糖基因簇rfaD‑waaQ包含14个基因，分别为rfaD、waaF、waaC、waaU、waaL、waaZ、waaY、waaJ、waaR、waaB、waaS、waaP、waaG、waaQ，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_

418076.1"、"NP_418077.1"、"NP_418078.1"、"NP_418079.1"、"NP_418080.1"、"NP_

418081.1"、"NP_418082.1"、"NP_418083.1"、"NP_418084.1"、"NP_418085.1"、"NP_

418086.1"、"NP_418087.1"、"NP_418088.1"、"NP_418089.1"；

所述肠共同抗原基因簇rfe‑rffM包含12个基因，分别为rfe、wzzE、wecB、wecC、rffG、rffH、rffC、wecE、wzxE、wecF、wzyE、rffM，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_418231.1"、"NP_418232.1"、"YP_026253.1"、"YP_026254.1"、"YP_026255.1"、"NP_418236.1"、"YP_

026256.1"、"NP_418238.1"、"NP_418239.1"、"YP_026257.1"、"NP_418241.1"、"NP_

418242.1"；

所述克拉酸基因簇wcaM‑wza包含20个基因，分别为wza、wzb、wzc、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、gmd、fcl、gmm、wcaI、manC、manB、wcaJ、wzx、wcaK、wcaL、wcaM共20个基因，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_416566.1"、"NP_416565.1"、"NP_416564.1"、"NP_

416563.1"、"NP_416562.1"、"NP_416561.1"、"NP_416560.1"、"NP_416559.1"、"NP_

416558.1"、"NP_416557.1"、"NP_416556.1"、"NP_416555.1"、"NP_416554.1"、"NP_

416553.1"、"NP_416552.1"、"NP_416551.1"、"NP_416550.1"、"NP_416549.1"、"NP_

416548.1"、"NP_416547.1"；

所述磷酸转运系统相关基因为mlaA、mlaC和pldA，序列的NCBI登录号为"NP_

416848.1"、"NP_417659.1"、"NP_418265.1"；

所述来自弗朗西斯菌lpxE基因的序列的NCBI登录号为"WP_159184080.1"；

所述来自沙门氏菌pagP和pagL基因的序列的NCBI登录号分别为"NP_459620.1"、" NP_

416848.1"。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。

3.一种高效生产单磷酸类脂A 的方法，其特征在于，所述方法为利用权利要求1所述的重组大肠杆菌发酵生产单磷酸类脂A。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌接种至培养基中进行培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，从培养2 18h后的重组大肠杆菌中提取单~磷酸类脂A。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述培养基含有4 6 g/L酵母粉，8 12 ~ ~g/L 蛋白胨，8 12 g/L NaCl。

~

7.权利要求1所述的重组大肠杆菌在生产单磷酸类脂A疫苗佐剂中的应用。

说明书

一种能高效生产单磷酸类脂A疫苗佐剂的重组大肠杆菌

技术领域

[0001] 本发明涉及一种能高效生产单磷酸类脂A疫苗佐剂的重组大肠杆菌，属于基因工程和合成生物学领域。

[0002] 脂多糖(LPS)作为大肠杆菌细胞外膜的主要组成成分，其亲水性糖链可以阻挡疏水性物质进入细胞，维持细胞稳定性，为细胞提供保护；其类脂A结构可以被宿主体内免疫细胞(如单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞)上的病原体识别受体TLR4(Toll‑like receptor4)识别。当LPS被哺乳动物细胞表面的受体TLR4识别而激活先天性免疫系统时，毒性高的LPS可引起促炎症因子过量释放，引发热休克甚至死亡；而低毒性的LPS或其衍生物能有效激活先天性免疫系统但不会产生过量炎症分子。因此低毒性的LPS或其衍生物可作为免疫系统激活剂而被开发成疫苗或疫苗佐剂。

[0003] 类脂A是LPS的生物活性中心也是宿主免疫细胞TLR4的识别位点，其磷酸基团个数、脂肪酸链数量及长度均直接影响促炎性细胞因子释放的种类和数量。有些结构的类脂A会诱导产生过量的细胞因子，从而引发严重的内毒素休克，而有些结构的类脂A则会引起温和的炎症反应，产生适量的细胞因子，诱发Th1型反应，吸引和激活巨噬细胞和树突状细胞，帮助宿主清除入侵的微生物。因此，不同结构的类脂A有不同的免疫功能，有些结构的类脂A可用作疫苗佐剂，增强免疫反应的强度和持续时间。疫苗佐剂对于疫苗免疫应答的产生和增强具有重要作用。目前应用最广泛的疫苗佐剂是铝佐剂。它是一种吸附剂，能从溶液中强烈吸附蛋白质抗原，形成沉淀。当其接种到机体内后可形成一个“抗原库”，缓慢释放抗原，充分延长了抗原的作用时间，能诱导产生高水平的抗体应答，但是不能诱导产生较强的T细胞免疫。而T细胞免疫却是预防治疗某些疾病时迫切需要的，比如疟疾、肺结核、AIDS。因此，设计出能激发强烈Th1型细胞免疫应答的疫苗佐剂是目前的研究热点。

[0004] 单磷酸类脂A(MPL)是一种能增强免疫应答的类脂A分子衍生物，正在被开发成为具有广阔应用前景的新一代疫苗佐剂。商业化MPL目前只能依靠对沙门氏菌突变株Salmonella Minnesota R595类脂A结构进行化学处理获得，其成本高，产物复杂。

发明内容

[0005] 为了解决上述存在的技术问题，本发明在大肠杆菌中敲除基因组上四个与LPS相关的基因簇gnd‑galF，rfaD‑waaQ，rfe‑rffM和wcaM‑wza和磷脂转运系统基因mlaA、mlaC和pldA得到LPS精简菌株MW012。随后将携带弗朗西斯菌染色体中的lpxE和沙门氏菌染色体中的pagP和pagL基因的质粒pWEPL转化到LPS精简菌株MW012中，得到重组菌MW012/pWEPL。通过薄层层析(TLC)和液质联用(LC‑MS)方法分析从MW012/pWEPL中分离出来的类脂A，结果表明，MW012/pWEPL中主要产生两种单磷酸脂A，一种为六酰基化，另一种为五酰基化。更重要的是，类脂A疫苗佐剂中最有效的成分六酰基化单磷酸脂类A的比例达到75％。本发酵构建的大肠杆菌菌株MW012/pWEPL为生产类脂A疫苗佐剂MPL提供了良好的替代选择。

[0006] 本发明的第一个目的是提供一种高效生产MPL的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌敲除了大肠杆菌基因组上的O‑抗原基因簇、核心糖基因簇、肠共同抗原基因簇和克拉酸基因簇以及磷脂转运系统中的mlaA、mlaC和pldA基因，并过表达了来自弗朗西斯菌基因组中的脱磷酸酶(LpxE)和沙门氏菌基因组中的十六酰基转移酶(PagP)和脱酰基酶(PagL)。

[0007] 在一种实施方式中，所述O‑抗原基因簇为gnd‑galF。

[0008] 在一种实施方式中，所述O‑抗原基因簇gnd‑galF包含13个基因，分别为gnd、wbbL、wbbK、wbbJ、wbbI、rfc、glf、rfbX、rfbC、rfbA、rfbD、rfbB、galF，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_416533.1"、"NP_416534.1"、"NP_416536.1"、"NP_416537.1"、"NP_416538.1"、"NP_416539.1"、"NP_416540.1"、"NP_416541.1"、"NP_416542.1"、"NP_416543.1"、"NP_
416544.1"、"NP_416545.1"、"NP_416546.1"。

[0009] 在一种实施方式中，所述核心糖基因簇为rfaD‑waaQ。

[0010] 在一种实施方式中，所述核心糖基因簇rfaD‑waaQ包含14个基因，分别为rfaD、waaF、waaC、waaU、waaL、waaZ、waaY、waaJ、waaR、waaB、waaS、waaP、waaG、waaQ，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_418076.1"、"NP_418077.1"、"NP_418078.1"、"NP_418079.1"、"NP_418080.1"、"NP_418081.1"、"NP_418082.1"、"NP_418083.1"、"NP_418084.1"、"NP_
418085.1"、"NP_418086.1"、"NP_418087.1"、"NP_418088.1"、"NP_418089.1"。

[0011] 在一种实施方式中，所述肠共同抗原基因簇为rfe‑rffM。

[0012] 在一种实施方式中，所述肠共同抗原基因簇rfe‑rffM包含12个基因，分别为rfe、wzzE、wecB、wecC、rffG、rffH、rffC、wecE、wzxE、wecF、wzyE、rffM，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_418231.1"、"NP_418232.1"、"YP_026253.1"、"YP_026254.1"、"YP_026255.1"、"NP_418236.1"、"YP_026256.1"、"NP_418238.1"、"NP_418239.1"、"YP_026257.1"、"NP_418241.1"、"NP_418242.1"。

[0013] 在一种实施方式中，所述克拉酸基因簇为wcaM‑wza。

[0014] 在一种实施方式中，所述克拉酸基因簇wcaM‑wza包含20个基因，分别为wza、wzb、wzc、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、gmd、fcl、gmm、wcaI、manC、manB、wcaJ、wzx、wcaK、wcaL、wcaM共20个基因，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_416566.1"、"NP_416565.1"、"NP_416564.1"、"NP_416563.1"、"NP_416562.1"、"NP_416561.1"、"NP_416560.1"、"NP_416559.1"、"NP_416558.1"、"NP_416557.1"、"NP_416556.1"、"NP_416555.1"、"NP_
416554.1"、"NP_416553.1"、"NP_416552.1"、"NP_416551.1"、"NP_416550.1"、"NP_
416549.1"、"NP_416548.1"、"NP_416547.1"。

[0015] 在一种实施方式中，所述磷脂转运系统mlaA、mlaC和pldA基因序列的NCBI上登录号为"NP_416848.1"、"NP_417659.1"、"NP_418265.1"。

[0016] 在一种实施方式中，所述来自弗朗西斯菌lpxE基因的序列的NCBI登录号为"WP_159184080.1"；所述来自沙门氏菌pagP和pagL基因的序列的NCBI登录号分别为"NP_
459620.1"、"NP_416848.1"。

[0017] 在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌MG1655。

[0018] 本发明的第二个目的提供一种构建上述重组大肠杆菌的方法，所述方法是敲除大肠杆菌基因组上的O‑抗原基因簇、核心糖基因簇、肠共同抗原基因簇、克拉酸基因簇中的基因，以及磷脂转运系统中的mlaA、mlaC和pldA基因，并过表达来自弗朗西斯菌基因组中的脱磷酸酶(LpxE)和沙门氏菌基因组中的十六酰基转移酶(PagP)和脱酰基酶(PagL)。

[0019] 在一种实施方式中，弗朗西斯菌来源的lpxE和沙门氏菌来源的pagP、pagL连接在表达质粒pWSK29上。

[0020] 本发明的第三个目的是提供一种高效生产MPL的方法，所述方法为将上述重组大肠杆菌接种于发酵培养基中，进行发酵生产。

[0021] 在一种实施方式中，所述发酵培养基含有4～6g/L酵母粉，8～12g/L蛋白胨，8～12g/L NaCl。

[0022] 在一种实施方式中，所述发酵的反应条件为温度37℃，180～220rpm。

[0023] 本发明的第四个目的是提供所述的重组大肠杆菌在生物医药领域中的应用。

[0024] 本发明的第五个目的是提供所述的重组大肠杆菌在生产类脂A疫苗佐剂中的应用。

[0025] 有益效果：

[0026] (1)本发明在大肠杆菌中敲除大肠杆菌基因组上四个与LPS相关的基因簇以及磷脂转运系统中的mlaA、mlaC和pldA基因得到LPS精简菌株MW012，精简菌株MW012生长状态良好，其LPS结构为Kdo2‑lipid A，是LPS最简结构。

[0027] (2)将携带弗朗西斯菌来源的lpxE和沙门氏菌来源的pagP、pagL的质粒pWEPL转化到LPS精简菌株MW012中，得到重组菌MW012/pWEPL。重组菌MW012/pWEPL中主要产生两种单磷酸脂A，一种为六酰基化，另一种为五酰基化，且更重要的是，类脂A疫苗佐剂中最有效的成分六酰基化单磷酸脂类A的比例达到75％。

[0028] (3)本发明构建的重组大肠杆菌MW012/pWEPL菌株生长情况良好，类脂A结构简单，提取方法简便。相比于现有的从Salmonella Minnesota R595通过化学处理得到MPL，本发明菌株MW012/pWEPL是一种易于培养、生长迅速、降低生产风险的大肠杆菌。

[0029] (4)本发明所提供的这种微生物转化方法发酵条件简单、发酵时间短、提取工艺简单，不需要化学处理，即可提取出有效成分。

附图说明

[0030] 图1为敲除流程图；X为目的基因簇gnd‑galF、rfaD‑waaQ、rfe‑rffM、wcaM‑wza、mlaA、mlaC和pldA。

[0031] 图2为LPS精简菌株MW012的构建流程图；a：本发现涉及到的敲除基因簇；b：敲除的具体流程。

[0032] 图3为SDS‑PAGE分析菌株MW012的LPS结构。

[0033] 图4为LC‑MS分析菌株MW012的LPS结构。

[0034] 图5为表达质粒的构建；表达弗朗西斯菌来源的lpxE和沙门氏菌来源的pagP、pagL的质粒pWEPL的构建。

[0035] 图6为菌株MG1655、MW012和MW012/pEPL的生长曲线。

[0036] 图7为TLC分析MW012/pWEPL菌株类脂A结构。

[0037] 图8为LC‑MS分析MW012/pWEPL菌株类脂A结构。

[0038] 图9为MG1655和MG1655/pWEPL菌株中类脂A的TLC分析。

[0039] 图10为MG1655/pWEPL菌株中类脂A的LC‑MS分析。

具体实施方式

[0040] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0041] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。

[0042] 下述实施例中涉及的培养基如下：

[0043] 培养基均使用ddH2O配制，配制完成后121℃灭菌15～20min。

[0044] LB培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10。

[0045] LBA培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，Amp 0.05。

[0046] 据质粒上携带的抗性基因选择添加相应的抗生素。

[0047] 表1下述实施例涉及的引物序列(下划线部分为N20序列)

[0048]

[0049]

[0050] 表2下述实施例中涉及的菌株和质粒

[0051]

[0052] 实施例1：敲除质粒的构建

[0053] 采用CRISPR/Cas9敲除系统敲除大肠杆菌中与LPS相关的四个基因簇和磷脂转运系统中的mlaA、mlaC和pldA基因，需要构建7个敲除质粒：pT1、pT2、pT3、pT4、pTargetF‑m laA、pTargetF‑mlaC和pTargetF‑pldA，这些质粒的构建过程具体为：

[0054] (1)选取20nt与目的基因靶序列互补的N20序列，具体N20序列分别为引物pT1、pT2、pT3、pT4、pTargetF‑mlaA、pTargetF‑mlaC和pTargetF‑pldA的下划线序列，将这些序列修饰到质粒pTargetF正向引物的5’端，分别得到正向引物pT1‑F、pT2‑F、pT3‑F、pT4‑F、pTar getF‑mlaA‑F、pTargetF‑mlaC‑F和pTargetF‑pldA‑F。

[0055] 以质粒pTargetF为模板，正向引物pT1‑F、pT2‑F、pT3‑F、pT4‑F、pTargetF‑mlaA‑F、pT argetF‑mlaC‑F和pTargetF‑pldA‑F分别同反向引物pTargetF‑R进行PCR扩增出引入了N20序列的开环质粒。将PCR扩增产物进行电泳验证并纯化回收。

[0056] (2)由于回收产物中可能含有模板质粒pTargetF，会影响后续实验，因此向回收产物中加入DpnⅠ，在37℃反应2h，对模板质粒进行消化。

[0057] (3)使用T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)对消化模板质粒后的回收产物进行磷酸化，37℃反应30min，然后65℃热失活10min。

[0058] (4)向磷酸化后的反应体系中加入1μL T4 DNA连接酶，于22℃反应4h，获得连接液。反应结束后，取出大肠杆菌JM109感受态细胞于冰上融化，将连接液加入感受态细胞中并轻轻吹吸混匀，冰浴30min。然后将感受态细胞于42℃水浴中热激90s，冰浴2min，迅速加入1mL LB培养基。37℃，100rpm复苏1h，然后涂布在添加50mg/L的奇霉素(Spe)的LB平板上，37℃倒置培养，以筛选敲除转化子。以pTargetF为阴性对照，对转化子进行菌落PCR，验证敲除质粒是否成功构建。将正确的转化子接至添加奇霉素(Spe)的LB液体试管中，提取质粒得到敲除质粒pTargetF‑gene(pT1(敲除O‑抗原基因簇)、pT2(敲除核心多糖基因簇)、pT3(敲除克拉酸基因簇)、pT4(敲除肠共同抗原基因簇)、pTargetF‑mlaA、pTargetF‑mlaC和pTargetF‑pldA)。

[0059] 实施例2：LPS精简菌株MW012的构建

[0060] 采用CRISPR/Cas9敲除系统敲除野生型大肠杆菌MG1655与LPS相关的四个基因簇和磷脂转运系统中的mlaA、mlaC和pldA基因，获得LPS精简菌株MW012。具体敲除流程如下(图1)：

[0061] (1)大肠杆菌电转敲除感受态细胞MG1655/pCas的制备

[0062] 将质粒pCas转化到大肠杆菌MG1655中，得到含有pCas质粒的重组大肠杆菌MG1655/pCas，将大肠杆菌MG1655/pCas在添加30mg/L卡那霉素(Kan)的LB固体平板上活化，+接种到LB(Kan)试管过夜培养得到种子液；将种子液按1％(v/v)转接至25mL LB(Kan+)培养基中，于30℃，200rpm条件下培养至OD600＝0.2，加入500μL L‑阿拉伯糖溶液诱导，继续培养至OD600＝0.5，冰浴30min；4℃，4000rpm离心10min收集菌体，用预冷的10％甘油溶液洗涤菌体三次；加入300μL 10％甘油溶液重悬菌体，分装到无菌的1.5mL EP管中，80μL/管。

[0063] (2)同源臂敲除片段的构建

[0064] 提取大肠杆菌MG1655的基因组，以基因组为模板，用敲除目的基因簇gnd‑galF的同源臂引物U1‑F/U1‑R和D1‑F/D1‑R分别扩增得到上游同源臂和下游同源臂，胶回收，并用引物对U1‑F/D1‑R进行重叠PCR，得到同源臂敲除片段1；用敲除目的基因簇rfaD‑waaQ的同源臂引物U2‑F/U2‑R，D2‑F/D2‑R分别扩增得到上游同源臂和下游同源臂，胶回收，并用引物对U2‑F/D2‑R进行重叠PCR，得到同源臂敲除片段2；用敲除目的基因簇wza‑wcaM的同源臂引物U3‑F/U3‑R，D3‑F/D3‑R分别扩增得到上游同源臂和下游同源臂，胶回收，并用引物对U3‑F/D3‑R进行重叠PCR，得到同源臂敲除片段3；用敲除目的基因簇rfe‑rffM的同源臂引物U4‑F/U4‑R，D4‑F/D4‑R分别扩增得到上游同源臂和下游同源臂，胶回收，并用引物对U4‑F/D4‑R进行重叠PCR，得到同源臂敲除片段4；用敲除目的基因簇mlaA的同源臂引物U5‑F/U5‑R，D5‑F/D5‑R分别扩增得到上游同源臂和下游同源臂，胶回收，并用引物对U5‑F/D5‑R进行重叠PCR，得到同源臂敲除片段5；用敲除目的基因簇mlaC的同源臂引物U6‑F/U6‑R，D6‑F/D6‑R分别扩增得到上游同源臂和下游同源臂，胶回收，并用引物对U6‑F/D6‑R进行重叠PCR，得到同源臂敲除片段6；用敲除目的基因簇pldA的同源臂引物U7‑F/U7‑R，D7‑F/D7‑R分别扩增得到上游同源臂和下游同源臂，胶回收，并用引物对U7‑F/D7‑R进行重叠PCR，得到同源臂敲除片段7。

[0065] (3)基因的电转敲除

[0066] 用无水乙醇洗涤电击杯三次并吹干，预冷20min。将步骤(1)的大肠杆菌MG1655/pCas感受态细胞置于冰上融化，加入实施例1中的100ng敲除质粒pTargetF‑gene(pT1、pT2、pT3、pT4、pTargetF‑mlaA、pTargetF‑mlaC和pTargetF‑pldA)和步骤(2)中的500ng相应的同源臂敲除片段，轻轻吹吸混匀，吸至电击杯的槽中。将电击杯冰浴10min，擦干后电击。然后迅速向电击杯中加入1mL LB培养基，吸出全部菌液至1.5mL EP管中，30℃，100rpm复苏1.5h，在含有30mg/L的Kan和50mg/L Spe的LB平板涂布，并在30℃培养箱中倒置培养。以MG1655为阴性对照，用上游同源臂的正向引物和下游同源臂的反向引物对转化子筛选出正确的转化子。

[0067] (4)敲除质粒pTargetF‑gene和温敏质粒pCas的去除

[0068] 将步骤(3)中正确的敲除转化子接至添加30mg/L的Kan和1mM的IPTG的LB试管中，通过IPTG诱导去除敲除质粒pTargetF‑gene的酶表达，30℃振荡培养12h，在LB(Kan+)平板上划线分离单菌落。筛选出对壮观霉素敏感的单菌落，即得到去除pTargetF‑gene敲除质粒的突变菌株，接至LB(Kan+)试管保种，可直接制备感受态进行连续敲除。将去除敲除质粒的突变菌株接至LB试管，42℃振荡培养，在LB平板上划线分离单菌落。筛选出对卡那霉素敏感的单菌落，即得到去除pCas的无抗突变菌株，接至LB试管保种。

[0069] 采用CRISP/Cas9的敲除方法成功将四个与LPS相关的基因簇gnd‑galF、rfaD‑waaQ、w za‑wcaM、rfe‑rffM和3个与磷脂转运相关的mlaA、mlaC和pldA基因从大肠杆菌MG1655的基因组上依次敲除，获得了LPS精简菌株MW012(图2)。

[0070] 所述基因簇gnd‑galF包含gnd、wbbL、wbbK、wbbJ、wbbI、rfc、glf、rfbX、rfbC、rfbA、rfbD、rfbB、galF共13个基因；

[0071] 所述基因簇rfaD‑waaQ包含rfaD、waaF、waaC、waaU、waaL、waaZ、waaY、waaJ、waaR、waaB、waaS、waaP、waaG、waaQ共14个基因；

[0072] 所述基因簇wza‑wcaM包含wza、wzb、wzc、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、gmd、fcl、gmm、wcaI、manC、manB、wcaJ、wzx、wcaK、wcaL、wcaM共20个基因；

[0073] 所述基因簇rfe‑rffM包含rfe、wzzE、wecB、wecC、rffG、rffH、rffC、wecE、wzxE、wec F、wzyE、rffM共12个基因。

[0074] 实施例3：菌株MW012脂多糖(LPS)的提取与结构验证

[0075] (1)LPS提取纯化方法：将菌株以初始OD600为0.02接种至500mL LB培养基中，37℃培养18h后，离心20min，倒掉上清，收集菌体沉淀。向菌体沉淀中加入20mL水充分悬浮，再加入20mL 68℃预热的90％苯酚，在68℃恒温水浴锅中震荡1h。震荡后冷却至室温，离心20min分相，吸取上相至离心管中，4℃静置12h后，将上清液转移至透析袋中，透析24h。真空冻干得LOS粗样。向LOS粗样中加入9mL水，1mL反应缓冲液(100mM Tris‑HCl，25mM MgCl2，1mM CaCl2，pH 7.5)，适量DNase I和RNase A，37℃静置4h(精密天平称量LOS粗样，1mg脂多糖加入1μg酶)。向反应后的溶液中再加入适量的蛋白酶K，37℃静置12h(1mg脂多糖加入1μg酶)。为去除残余的蛋白质，向离心管中加入5mL水饱和苯酚，混合均匀。离心30min分相，吸取上相至透析袋中，在水中透析24h，每隔4h更换一次水，去除溶液中残存的苯酚。将透析袋中的液体倒至离心管中，真空冷冻干燥，得到LOS半纯品。将LOS半纯品复溶于氯仿和甲醇(2:1，v/v)混合液中，12000rpm离心20min，倒掉上清。重复上述操作，吹干复溶于水中，真空冷冻干燥，即得到LOS纯品。

[0076] (2)SDS‑PAGE法分析LPS：配制20g/L的LOS溶液。在15μL的LOS溶液中加入5μL 4×SDS上样缓冲液(50M Tris‑HCL、2％SDS、10％蔗糖和0.01％溴酚蓝，pH 6.8)后，沸水浴加热10min，待样品冷却至室温后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将20μL溶液全部加入凝胶孔中。浓缩胶电流设置为15mA，待条带跑至分离胶于浓缩胶界面时，将电流调至25mA。待样品条带跑至距离胶最底部大约5mm时关闭电源，停止电泳。室温下，使用固定液(30％乙醇和10％乙酸)固定凝胶20min；使用氧化液(30％乙醇、10％乙酸和0.7％过碘酸)处理20min；振荡水洗涤凝胶1h，每隔20min换水，充分水洗。使用银氨溶液(56mL、0.1M NaOH加入4mL浓氨水，补水至230mL，再逐滴加入10mL 20％AgNO3溶液，溶液应呈清亮透明状，若出现沉淀则需重新配制，银氨溶液需要现用现配)处理凝胶10min；振荡水洗涤凝胶30min，每隔10min换一次水。
加入显色液(0.05g/L柠檬酸和0.02％甲醛)处理至LPS条带显现出来为止。为防止过度染色，在显现出明显的LPS条带时，立即加入7％冰醋酸，终止反应。

[0077] 结果表明，如图3所示，泳道1为野生型大肠杆菌MG1655菌株LOS的电泳图，MG1655菌株LPS只有core‑kdo2‑lipid A一种结构；泳道2为LPS精简菌株MW012的LPS结构，菌株MW012的LPS结构中只存在Kdo2‑lipid A结构，因此其迁移速度较快。通过LC‑MS进一步分析从MW012菌株中提取的LPS结构。在LC‑MS图谱中主要有三个主要的峰，分别为1797.2、2157.5和2395.7，分别对应lipid A、kdo2‑1‑dephospho‑lipid A和kdo2‑1‑dephospho‑2‑palmitoyl‑lipid A。这说明在MW012菌株的LPS结构中有相当一部分类脂A发生了棕榈酰基化，这进一步表明MW012是非常合适的MPL高效生产菌株。

[0078] 实施例4：表达质粒pWEPL的构建

[0079] 第一步，以弗朗西斯菌基因组为模板，利用引物FnlpxE‑F和FnlpxE‑R进行PCR扩增一段720bp的基因片段，并进行电泳验证及纯化回收；分别用SacI内切酶对载体pWSK29进行酶切反应，反应温度为37℃，时间30min，随后将酶切产物回收并进行电泳验证；将回收后的酶切产物和基因片段混合参照一步克隆试剂盒使用说明书在37℃下反应30min，获得反应液；反应结束后，取出大肠杆菌JM109感受态细胞于冰上融化，将反应液加入感受态中并轻轻吹吸混匀，冰浴30min；然后将感受态于42℃水浴中热激90s，冰浴2min，迅速加入1mL LB培养基；37℃，100rpm复苏1h，然后涂布在添加50mg/L的氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃倒置培养，以筛选敲除转化子；以pWSK29为阴性对照，对转化子进行菌落PCR，验证质粒是否成功构建；将正确的转化子接至添加氨苄青霉素(Amp)的LB液体试管中，提取质粒得到质粒pWE。

[0080] 第二步，以沙门氏菌基因组为模板，利用引物SepagP‑F和SepagP‑R进行PCR扩增一段570bp的基因片段，并进行电泳验证及纯化回收；利用HindIII内切酶对质粒pWE进行酶切反应，反应温度为37℃，时间30min，随后将酶切产物分别回收并进行电泳验证；将回收后的酶切产物和基因片段混合参照一步克隆试剂盒使用说明书在37℃下反应30min，获得反应液；将反应液转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在添加50mg/L的氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃倒置培养，以筛选敲除转化子；以pWE为阴性对照，对转化子进行菌落PCR，验证质粒是否成功构建；将正确的转化子接至添加氨苄青霉素(Amp)的LB液体试管中，提取质粒得到质粒pWEP。

[0081] 第三步，以沙门氏菌基因组为模板，利用引物SepagL‑F和SepagL‑R进行PCR扩增一段705bp的基因片段，并进行电泳验证及纯化回收；利用XhoI内切酶对质粒pWEP进行酶切反应，反应温度为37℃，时间30min，随后将酶切产物分别回收并进行电泳验证；将回收后的酶切产物和基因片段混合参照一步克隆试剂盒使用说明书在37℃下反应30min，获得反应液；将反应液转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在添加50mg/L的氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃倒置培养，以筛选敲除转化子；以pWEP为阴性对照，对转化子进行菌落PCR，验证质粒是否成功构建；将正确的转化子接至添加氨苄青霉素(Amp)的LB液体试管中，提取质粒得到质粒pWEPL。质粒图谱如图4所示。

[0082] 实施例5：重组菌株MW012/pWEPL的构建

[0083] (1)大肠杆菌MW012感受态细胞的制备

[0084] 接种实施例2中的大肠杆菌MW012于LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养，将种子液按2％(v/v)接种量转接到50mL LB液体培养基，37℃，200rpm培养至OD600＝0.4‑0.6，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的0.01M的CaCl2洗涤3次，最后用1mL 0.01M的CaCl2悬浮，加入1mL30％甘油混匀，每管200μL分装至预冷的无菌EP管中。

[0085] (2)转化

[0086] 将100‑200ng的实施例4中的质粒pWEPL加入步骤(1)制备的大肠杆菌MW012感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2～3min，加入1mL LB培养基复苏，37℃孵育2h，涂布50μg/mL氨苄霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取转化子于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养种子液。得到重组菌株MW012/pWEPL。

[0087] 实施例6：大肠杆菌MG1655、MW012和MW012/pEPL生长性能测定

[0088] 将待测菌株在平板上划线(野生型大肠杆菌在LB平板上划线，重组菌在LBA平板上划线)，挑取单菌落接种到5mL的种子培养基中过夜培养。第二天将种子培养基以初始OD600＝0.02接种于50mL LB培养基中，每个菌株三个平行。每隔2小时取样并测定样品在600nm处的吸光值，待菌株生长至平稳期后再测两个时间点。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标作折线图即为生长曲线。

[0089] 结果表明，如图5所示，菌株MG1655在LB培养基中生长到12h达到稳定期，其最高OD600的值为4.29；菌株MW012在LB培养基中生长到12h达到稳定期，其最高OD600的值为2.99；菌株MW012/pWEPL在LB培养基中生长到12h达到稳定期，其最高OD600的值为2.56。结果表明重组菌与野生菌在LB培养基中有相同的生长趋势，但生长性能有所降低。

[0090] 实施例7：重组菌株MW012/pWEPL类脂A结构的提取与结构验证

[0091] 实施例6中大肠杆菌类脂A结构的提取采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法。将过夜培养的菌液按初始OD600＝0.02转接到200mL LB液体培养基中，37℃培养至OD600＝1时8000r/min离心10min收集菌体。菌株MW012/pWEPL发酵结束前中需加入25Mm EDTA。ddH2O洗涤菌体一次后用Bligh‑Dyer一相体系(氯仿/甲醇/水，1:2:0.8，v/v/v)悬浮菌体，磁力搅拌1h，2000r/min离心20min分相，使用一相体系洗涤细胞碎片2‑3次；加入27mL 12.5mmol/L的醋酸钠(pH 4.5)溶液，超声震荡10min，100℃水浴30min裂解糖链。冷至室温后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh‑Dyer二相体系(氯仿/甲醇/水，2:2:1.8，v/v/v)，2000r/min离心
10min，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发；最后加入氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)将类脂A洗出；
使用氮吹仪将有机溶剂吹干，类脂A保存在‑20℃备用。

[0092] 类脂A溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，将样品点于gel 60TLC板上，展层剂为氯仿/甲醇/水/氨水(40:25:4:2，v/v/v/v)。层析结束后吹干板上残留的展层剂，用溶于乙醇的10％硫酸进行碳化，置于加热板上，180℃显色。

[0093] 类脂A溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在WATERS SYNAPT  Q‑TOF Mass Spectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用阴离子检测模式，检测范围小于m/z 2500。使用MassLynx V4.1software软件获取和分析数据。

[0094] 结果表明：如图6所示，泳道1为对照组，是从菌株MG1655/pWEPL提取的类脂A，四个条带从上到下分别代表：1‑Dephospho‑2‑palmitoyl‑lipid A、MPL、1‑Dephospho‑lipid A和1‑Dephospho‑3‑Deacyl‑lipid A；泳道2为从菌株MW012/pEPL提取的类脂A，只有两种结构，从上到下分别为MPL和1‑Dephospho‑3‑Deacyl‑lipid A，其中MPL的比例高达75％。通过LC‑MS分析从菌株MW012/pWEPL提取的类脂A。在LC‑MS图谱中主要有二个主要的峰，分别为1490.1和1728.3，分别对应1‑dephospho‑3‑deacyl‑lipid A和MPL。在对1728.3峰进行二级质谱分析表明，一级质谱中1500.1峰为1728.3峰的碎片峰，其是在LC‑MS的过程中生成的。
这些结果说明在重组菌MW012/pWEPL能高效合成MPL。

[0095] 对比例1

[0096] MPL高产菌株需满足的条件之一是菌株必须具备能使类脂A结构发生高度棕榈酰基化的能力。而类脂A结构发生棕榈酰基化需要满足两个条件：需要PagP蛋白(质粒pWEPL中包含了PagP蛋白)，需要破坏细菌外膜的脂质不对称性结构从而让磷脂有效的定位在外膜。而菌株MW012在敲除了O‑抗原、核心多糖、克拉酸和肠共同抗原基因簇后外膜的脂质不对称已经受到了干扰，在此基础上又敲除了磷脂转运系统相关的mlaA、mlaC和pldA基因，从而让磷脂能够稳定的定位于外膜外层。

[0097] 比如：在野生型菌株MG1655中直接表达pWEPL，数据如下：野生型MG1655中直接表达pWEPL虽然可以产生MPL，但产量极低(图9和图10)。

[0098] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。