具有大斯托克斯位移的红色双光子荧光化合物及其合成与应用

摘要

本发明公开了具有大斯托克斯位移的红色双光子荧光化合物及其合成与应用。所述化合物的结构如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)化合物的化学名称为4‑[(1E)‑2‑[5‑[(1E)‑2‑(9‑丁基‑9H‑咔唑‑3‑基)乙烯基]‑2‑噻吩基]乙烯基]‑1‑(2‑羟乙基)吡啶鎓溴化物。本发明提供的化合物兼具大的斯托克斯位移、红色荧光发射、大的双光子吸收截面、良好的活细胞穿透性和强的内质网靶向性，可应用在制备作为活细胞中内质网靶向的红色双光子荧光成像试剂中。

权利要求

1.一种化合物，其结构如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)化合物的化学名称为4‑[(1E)‑2‑[5‑[(1E)‑

2‑(9‑丁基‑9H‑咔唑‑3‑基)乙烯基]‑2‑噻吩基]乙烯基]‑1‑(2‑羟乙基)吡啶鎓溴化物：(Ⅰ)。

2.一种如权利要求1所述的化合物的合成方法，其特征在于：所述合成方法包括如下步骤：(1) 式(Ⅲ)所示的化合物与式(Ⅳ)所示的化合物发生Wittig反应，制得9‑丁基‑3‑[(1E)‑2‑(2‑噻吩基)乙烯基]‑9H‑咔唑，即相应的式(Ⅴ)所示的化合物；

(2)

式(Ⅴ)所示的化合物与DMF、三氯氧磷经过Vilsmeier反应，制得5‑[(1E)‑2‑(9‑丁基‑

9H‑咔唑‑3‑基)乙烯基]‑2‑噻吩甲醛，即相应的式(Ⅵ)所示的化合物；

(3)

式(Ⅵ)所示的化合物与式(Ⅱ)所示的化合物发生脱水缩合反应，制得相应的式(Ⅰ)所示的化合物；

(Ⅱ)。

3.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤(1)所述的Wittig反应具体按照如下实施：反应瓶中加入式(Ⅳ)化合物、式(Ⅲ)化合物和溶剂，在氮气保护下，缓慢加入碱，加毕，在0～40ºC反应10～24 h，反应结束后，所得反应混合物经分离纯化得到式(Ⅴ)化合物；

所述Wittig反应采用的碱为叔丁醇钾或氢化钠，碱的摩尔用量为式(Ⅳ)化合物摩尔用量的

1.5～4倍；溶剂为无水四氢呋喃，式(Ⅳ)化合物与式(Ⅲ)化合物的摩尔用量比为1 : 1～2。

4.如权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述的步骤(1)按照如下实施：反应瓶中加入式(Ⅳ)化合物、式(Ⅲ)化合物和无水四氢呋喃，在氮气保护下，缓慢滴加叔丁醇钾的无水四氢呋喃溶液，滴毕，在室温下反应16～20 h，接着将反应混合物倒入到冰水中，再用二氯甲烷萃取，获得的有机层经无水硫酸钠干燥后，再经硅胶柱层析分离提纯得到式(Ⅴ)化合物。

5.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤(2)所述的Vilsmeier反应具体按照如下实施：反应瓶中加入式(Ⅴ)化合物、DMF和溶剂，用冰盐浴控温在0～5ºC，缓慢滴加三氯氧磷，滴毕，控制温度在‑5～85 ºC反应5～10 h，反应结束后，反应混合物经分离纯化得到式(Ⅵ)化合物；采用的溶剂为1,2‑二氯乙烷或三氯甲烷，式(Ⅴ)化合物与DMF、三氯氧磷的摩尔用量比为1 : 2～6 : 2～3。

6.如权利要求5所述的合成方法，其特征在于：所述的步骤(2)按照如下实施：反应瓶中加入式(Ⅴ)化合物、DMF和1,2‑二氯乙烷，用冰盐浴控温在0～5ºC，缓慢滴加三氯氧磷，滴毕，加热回流反应6～8 h，接着将反应混合物倒入到冰水中，用氢氧化钠水溶液调节pH至8，再用二氯甲烷萃取，获得的有机层经无水硫酸钠干燥后，再经硅胶柱层析分离提纯得到式(Ⅵ)化合物。

7.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤(3)所述的脱水缩合反应具体按照如下实施：反应瓶中加入式(Ⅵ)化合物、式(Ⅱ)化合物和溶剂，搅拌溶解，再加入碱，然后在

20～140 ºC反应5～20 h，反应结束后，所得反应混合物经分离纯化得到目标式(Ⅰ)化合物；

采用的碱为哌啶、三乙胺或氢氧化钾，碱的摩尔用量为式(Ⅵ)化合物摩尔用量的1.5～4倍；

溶剂为甲醇、乙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、乙腈、DMF或几者的混合，式(Ⅵ)化合物与式(Ⅱ)化合物的摩尔用量比为1 : 1～2。

8.如权利要求7所述的合成方法，其特征在于：所述步骤(3)按照如下实施：反应瓶中加入式(Ⅵ)化合物、式(Ⅱ)化合物和乙醇，搅拌溶解，再加入哌啶，然后加热回流反应8～12 h，接着冷却至室温，抽滤，所得固体经重结晶分离提纯得到目标式(Ⅰ)化合物。

9.如权利要求1所述的式(Ⅰ)所示的化合物在制备作为活细胞中内质网靶向的红色双光子荧光成像试剂中的应用。

说明书

具有大斯托克斯位移的红色双光子荧光化合物及其合成与

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种具有大斯托克斯位移的化合物、合成方法、以及其在制备作为活细胞中内质网靶向的红色双光子荧光成像试剂中的应用。

背景技术

[0002] 双光子吸收是指物质同时吸收两个相同或者不同的光子，通过虚拟中间态到达高能激发态的过程，属于一种三阶非线性光学效应。处在激发态的分子随后发生辐射跃迁而产生的频率上转换荧光被称为双光子荧光。1931年， ‑Mayer M.提出了双光子吸收的存在，并通过二阶微扰理论推导出了双光子过程的跃迁概率，然后到1961年该理论被实验所证实。

[0003] 与服从Stark‑Einstein定律的单光子吸收相比，双光子吸收具备以下几大特点：(1)单光子吸收为线性吸收过程，双光子吸收则为非线性吸收过程；(2)单光子吸收过程是物质分子吸收一个能量高的短波长的光子达到激发态，而双光子吸收过程是物质分子吸收两个能量低的长波长的光子达到激发态；(3)在双光子吸收过程中，物质分子的吸收强度、电子跃迁几率与激发光强度的平方成正比；(4)对于荧光分子，一般用吸收截面来表示该分子吸收光子的能力。吸收截面越大，物质分子对光子的吸收能力越强。通常，单光子吸收截
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面在10 ‑10 GM范围内，因此所需要的光密度较小；而双光子吸收截面一般在1‑10GM范围
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内，所以普通分子发生双光子吸收的概率非常小；(5)双光子吸收发生在焦点处λ (λ为激发波长)的空间范围内，而单光子吸收发生在整个聚焦光路范围内。

[0004] 基于以上特点，以双光子吸收为基础的双光子荧光成像技术具有许多单光子技术无法比拟的优点：(1)双光子荧光是长波激发，短波发射，激发光波长一般位于700‑1000nm，被测样品在该波段激发光中具有小的光损伤、光漂白和光毒性；此外，该波段的光具有良好的穿透性，小的吸收耗散和Rayleigh散射，从而在生物成像中大大提高了被测样品的穿透深度，能够实现深层物质的层析成像；(2)只有入射光的光强达到一定的阈值，才会发生双3
光子吸收。在焦点处λ以外的地方，入射光的光强低于可以产生双光子吸收的阈值，不会发生双光子吸收，从而大大提高了被测样品的三维空间选择性，能够很好地改善成像轴向分辨率以及对比度。因此，双光子荧光成像技术在以荧光为传导信号的主‑客体分子识别过程中，如：生物荧光识别、医学荧光诊断等，具有不可估量的应用潜力和前景。

[0005] 目前，已报道的荧光化合物的发射波长通常处在450‑560nm，当用在生物样品的荧光成像中，会受到生物分子自发荧光的极大干扰。此外，短波长光的组织穿透力弱且能量高。长波长的红色荧光发射不仅能够有效减少光损伤，增强光的透过率和透过深度，而且避开了在蓝光/绿光/黄光区域细胞内的自发荧光干扰，使背景噪音减到最小，从而提高成像的信噪比，可以获得更优的层析成像。

[0006] 荧光发射是吸收过程的逆过程，在大多数情况下，归因于振动弛豫、分子构型改变、溶剂效应等因素，光的发射和吸收之间存在着一定的能量损失，从而荧光发射波长大于吸收波长。斯托克斯位移则定义为发射波长与吸收波长之间的差值。大多数荧光分子表现出小的斯托克斯位移，这使它们容易受到荧光内滤效应的影响。斯托克斯位移大，则可以有效地减少吸收光谱与发射光谱之间的重叠，消除荧光自吸收的干扰，从而显著提高成像的信噪比。

[0007] 内质网是重要的细胞器，指细胞质中由一系列囊腔和细管形成的隔离于细胞质基质的封闭管道系统。这种膜系统结构是蛋白质合成、加工、分选的场所，也是合成脂类物质和储存钙离子的场所。内质网功能与细胞内环境的稳定息息相关。因此，扰乱其内环境的因素诸如蛋白质糖基化受阻、葡萄糖饥饿、钙离子平衡紊乱和内质网缺血缺氧等多种因素均可导致内质网的功能紊乱，从而使蛋白质的合成或修饰遇到障碍，这样会影响蛋白质的折叠功能，使得未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网腔内大量堆积，引发内质网应激。内质网应激与多种疾病有关，例如神经系统变性疾病、心血管类疾病、糖尿病、老年性痴呆、癌症等。因此，荧光成像内质网和长时间的追踪内质网的形态变化对病理学、生物医药和生物化学有着非常重要的意义，但是目前优秀的靶向内质网的双光子荧光试剂非常匮乏。

[0008] 因此，设计并合成出兼具大的斯托克斯位移和红色荧光发射的新型化合物，并使其具备大的双光子吸收截面、良好的活细胞穿透性和强的内质网靶向性，实现其在活细胞中对内质网的双光子荧光成像的实际应用，既有理论意义又有现实意义。

发明内容

[0009] 本发明的首要目的是提供一种化合物，该化合物兼具大的斯托克斯位移、红色荧光发射、大的双光子吸收截面、良好的活细胞穿透性和强的内质网靶向性。

[0010] 本发明的第二个目的是提供一种化合物的合成方法。

[0011] 本发明的第三个目的是提供所述化合物在制备作为活细胞中内质网靶向的红色双光子荧光成像试剂中的应用。

[0012] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

[0013] 第一方面，本发明提供了一种化合物，其结构如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)化合物的化学名称为4‑[(1E)‑2‑[5‑[(1E)‑2‑(9‑丁基‑9H‑咔唑‑3‑基)乙烯基]‑2‑噻吩基]乙烯基]‑1‑(2‑羟乙基)吡啶鎓溴化物：

[0014]

[0015] 第二方面，本发明提供了一种所述式(Ⅰ)所示的化合物的合成方法，包括如下步骤：

[0016] (1)式(Ⅲ)所示的化合物与式(Ⅳ)所示的化合物发生Wittig反应，制得9‑丁基‑3‑[(1E)‑2‑(2‑噻吩基)乙烯基]‑9H‑咔唑，即相应的式(Ⅴ)所示的化合物；

[0017]

[0018]

[0019] (2)式(Ⅴ)所示的化合物与DMF、三氯氧磷经过Vilsmeier反应，制得5‑[(1E)‑2‑(9‑丁基‑9H‑咔唑‑3‑基)乙烯基]‑2‑噻吩甲醛，即相应的式(Ⅵ)所示的化合物；

[0020]

[0021] (3)式(Ⅵ)所示的化合物与式(Ⅱ)所示的化合物发生脱水缩合反应，制得相应的式(Ⅰ)所示的化合物；

[0022]

[0023] 本发明步骤(1)所述的Wittig反应具体按照如下实施：反应瓶中加入式(Ⅳ)化合物、式(Ⅲ)化合物和溶剂，在氮气保护下，缓慢加入碱(优选将碱提前进行溶解，以液体形式缓慢滴加)，加毕，在0～40℃(优选室温)反应10～24h(优选16～20h)，反应结束后，所得反应混合物经分离纯化得到式(Ⅴ)化合物。所述Wittig反应采用的碱一般为叔丁醇钾或氢化钠，在使用时一般先用溶剂将叔丁醇钾预先溶剂，以溶液的形式缓慢加入反应体系，而氰化钠试剂由于市售成品即为溶解在矿物油中的氰化钠分散体系，故无需预溶解，碱的摩尔用量为式(Ⅳ)化合物摩尔用量的1.5～4倍。溶剂一般为无水四氢呋喃，溶剂的摩尔用量为式(Ⅳ)化合物摩尔用量的50～100倍。式(Ⅳ)化合物与式(Ⅲ)化合物的摩尔用量比为1:1～2。反应结束后，所述分离纯化方法优选为：将反应混合物倒入到冰水中，再用二氯甲烷萃取，获得的有机层经无水硫酸钠干燥后，再经硅胶柱层析分离提纯得到式(Ⅴ)化合物，洗脱试剂为石油醚。

[0024] 作为优选，所述的步骤(1)按照如下实施：

[0025] 反应瓶中加入式(Ⅳ)化合物、式(Ⅲ)化合物和无水四氢呋喃，在氮气保护下，缓慢滴加叔丁醇钾的无水四氢呋喃溶液，滴毕，在室温下反应16～20h，接着将反应混合物倒入到冰水中，再用二氯甲烷萃取，获得的有机层经无水硫酸钠干燥后，再经硅胶柱层析分离提纯得到式(Ⅴ)化合物。

[0026] 本发明步骤(2)所述的Vilsmeier反应具体按照如下实施：反应瓶中加入式(Ⅴ)化合物、DMF和溶剂，用冰盐浴控温在0～5℃，缓慢滴加三氯氧磷，滴毕，控制温度在‑5～85℃(优选回流温度)反应5～10h(优选6～8h)，反应结束后，反应混合物经分离纯化得到式(Ⅵ)化合物。采用的溶剂一般为1,2‑二氯乙烷或三氯甲烷，溶剂的摩尔用量为式(Ⅴ)化合物摩尔用量的10～60倍。式(Ⅴ)化合物与DMF、三氯氧磷的摩尔用量比为1:2～6:2～3。反应结束后，所述分离纯化方法优选为：将反应混合物倒入到冰水中，用氢氧化钠水溶液调节pH至8，再用二氯甲烷萃取，获得的有机层经无水硫酸钠干燥后，再经硅胶柱层析分离提纯得到式(Ⅵ)化合物，洗脱试剂为石油醚与乙酸乙酯(体积比为20～30:1)。

[0027] 作为优选，所述的步骤(2)按照如下实施：

[0028] 反应瓶中加入式(Ⅴ)化合物、DMF和1,2‑二氯乙烷，用冰盐浴控温在0～5℃，缓慢滴加三氯氧磷，滴毕，加热回流反应6～8h，接着将反应混合物倒入到冰水中，用氢氧化钠水溶液调节pH至8，再用二氯甲烷萃取，获得的有机层经无水硫酸钠干燥后，再经硅胶柱层析分离提纯得到式(Ⅵ)化合物。

[0029] 本发明步骤(3)所述的脱水缩合反应具体按照如下实施：反应瓶中加入式(Ⅵ)化合物、式(Ⅱ)化合物和溶剂，搅拌溶解，再加入碱，然后在20～140℃(优选回流温度)反应5～20h(优选8～12h)，反应结束后，所得反应混合物经分离纯化得到目标式(Ⅰ)化合物。采用的碱一般为哌啶、三乙胺或氢氧化钾，碱的摩尔用量为式(Ⅵ)化合物摩尔用量的1.5～4倍。溶剂一般为甲醇、乙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、乙腈、DMF或几者的混合，溶剂的摩尔用量为式(Ⅵ)化合物摩尔用量的200～700倍。式(Ⅵ)化合物与式(Ⅱ)化合物的摩尔用量比为1:1～
2。反应结束后，所述分离纯化方法优选为：将反应混合物冷却至室温，抽滤，所得固体经乙醇重结晶分离提纯得到目标式(Ⅰ)化合物。

[0030] 作为优选，所述步骤(3)按照如下实施：

[0031] 反应瓶中加入式(Ⅵ)化合物、式(Ⅱ)化合物和乙醇，搅拌溶解，再加入哌啶，然后加热回流反应8～12h，接着冷却至室温，抽滤，所得固体经乙醇重结晶分离提纯得到目标式(Ⅰ)化合物。

[0032] 本发明中，式(Ⅱ)、式(Ⅲ)和式(Ⅳ)所示的化合物均可通过文献报道的方法进行合成，推荐的合成路线如下：

[0033]

[0034] 本发明提供的式(Ⅰ)化合物是以强给电子性的N‑丁基咔唑作为电子供体(D)，强吸电子性的吡啶鎓作为电子受体(A)，具有优秀电子传输能力的2,5‑二乙烯基噻吩作为π‑共轭桥(π)。在光激发下，这种推‑拉电子构型有利于电子从一端的供体沿共轭桥向另一端的受体发生电荷转移。经密度泛函理论计算证实：在HOMO分子轨道上，电子在咔唑供体上高度富集，而在LUMO分子轨道上，咔唑供体上的电子云密度显著降低，吡啶鎓受体上的电子云密度则明显增加，这种在大π共轭体系中强烈的电子云离域，有利于提高式(Ⅰ)化合物的双光子吸收性能。式(Ⅰ)化合物呈现出D‑π‑A偶极构型，在辐射跃迁时，其引入的咔唑电子供体能够有效提高整个分子的HOMO能级，而引入的吡啶鎓电子受体则能够有效降低LUMO能级，因此导致式(Ⅰ)化合物的发射激发态与基态之间的能隙变窄，从而有利于发射波长红移到红光区。众所周知，活细胞生存在水环境中，式(Ⅰ)化合物在水中的斯托克斯位移高达190nm，因此能够很好地削弱荧光内滤效应，提高细胞成像的信噪比。除此，式(Ⅰ)化合物中包含了亲油性的丁基链和以N‑羟乙基键合的亲水性的吡啶阳离子，从而很好地调变了整个分子的油水分配系数，使其具有良好的细胞膜通透性，而且吡啶阳离子的引入也有利于其靶向到细胞中面积最大的细胞器——内质网。

[0035] 故第三方面，本发明提供了式(Ⅰ)化合物在制备作为活细胞中内质网靶向的红色双光子荧光成像试剂中的应用。

[0036] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供了兼具大的斯托克斯位移、红色荧光发射、大的双光子吸收截面、良好的活细胞穿透性和强的内质网靶向性的化合物，其能应用于活细胞中内质网靶向的红色双光子荧光成像。

附图说明

[0037] 图1为化合物(Ⅰ)在H2O中的吸收和荧光发射光谱。其左纵坐标表示吸光度，右纵坐标表示荧光强度，横坐标表示波长。

[0038] 图2为化合物(Ⅰ)在920nm激发下的开孔Z‑扫描实验结果和拟合曲线。其纵坐标表示归一化透过率，横坐标表示样品距离焦点的位移。

[0039] 图3为化合物(Ⅰ)对OVCAR‑8活细胞的双光子荧光成像。(a)为细胞明场，(b)为双光子荧光成像，(c)为细胞明场与双光子荧光成像的叠加，标尺为20μm。

[0040] 图4为化合物(Ⅰ)和内质网商用染料(ER‑Tracker Red)对HeLa活细胞的共定位荧光成像。(a)为化合物(Ⅰ)的荧光成像，(b)为ER‑Tracker Red的荧光成像，(c)为化合物(Ⅰ)和ER‑Tracker Red的荧光成像的叠加，标尺为20μm。具体实施方式：

[0041] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将进一步通过实施例对技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中所用材料、试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

[0042] 实施例1化合物(Ⅴ)

[0043] 反应瓶中加入2.51g(10mmol)化合物(Ⅳ)、5.27g(12mmol)化合物(Ⅲ)和40mL无水四氢呋喃，在氮气保护和室温下，缓慢滴加2.24g(20mmol)叔丁醇钾在20mL无水四氢呋喃中的溶液，滴毕，在室温下反应20h，接着将反应混合物倒入到冰水中，再用二氯甲烷萃取，获得的有机层经无水硫酸钠干燥后，再经硅胶柱层析分离[洗脱剂：石油醚]，得到2.28g米白1
色化合物(Ⅴ)。m.p.107‑109℃；H NMR(DMSO‑d6,500MHz)δ：8.38(d,J＝1.4Hz,1H)，8.17(d,J＝7.6Hz,1H)，7.71(dd,J1＝8.6Hz,J2＝1.4Hz,1H)，7.61(d,J＝8.2Hz,1H)，7.60(d,J＝
8.6Hz,1H)，7.47(d,J＝16.1Hz,1H)，7.46(t,J＝7.6Hz,1H)，7.43(d,J＝5.1Hz,1H)，7.22(t,J＝7.4Hz,1H)，7.20(d,J＝3.5Hz,1H)，7.13(d,J＝16.1Hz,1H)，7.08(dd,J1＝5.1Hz,J2＝3.5Hz,1H)，4.40(t,J＝7.0Hz,2H)，1.73‑1.79(m,2H)，1.27‑1.35(m,2H)，0.89(t,J＝
7.4Hz,3H)。

[0044] 实施例2化合物(Ⅴ)

[0045] 反应瓶中加入2.51g(10mmol)化合物(Ⅳ)、6.59g(15mmol)化合物(Ⅲ)和50mL无水四氢呋喃，再加入1.20g(30mmol)60％氢化钠，然后在室温下反应16h，接着将反应混合物倒入到冰水中，再用乙酸乙酯萃取，获得的有机层经无水硫酸钠干燥后，再经硅胶柱层析分离[洗脱剂：石油醚]，得到2.07g米白色化合物(Ⅴ)。

[0046] 实施例3化合物(Ⅵ)

[0047] 反应瓶中加入3.97g(12mmol)实施例1和实施例2合成的化合物(Ⅴ)、5.26g(72mmol)DMF和40mL 1,2‑二氯乙烷，用冰盐浴控温在0～5℃，缓慢滴加3.68g(24mmol)三氯氧磷，滴毕，加热回流反应6h，接着将反应混合物倒入到冰水中，用30％的氢氧化钠水溶液调节pH至8，再用二氯甲烷萃取，获得的有机层经无水硫酸钠干燥后，再经硅胶柱层析分离1
[洗脱剂：V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝25:1]，得到2.63g黄色化合物(Ⅵ)。m.p.144‑146℃；H NMR(DMSO‑d6,500MHz)δ：9.87(s,1H)，8.48(d,J＝1.4Hz,1H)，8.18(d,J＝7.7Hz,1H)，7.98(d,J＝3.9Hz,1H)，7.79(dd,J1＝8.6Hz,J2＝1.4Hz,1H)，7.65(d,J＝8.6Hz,1H)，7.63(d,J＝
8.2Hz,1H)，7.57(d,J＝16.1Hz,1H)，7.48(t,J＝7.7Hz,1H)，7.47(d,J＝16.1Hz,1H)，7.41(d,J＝3.9Hz,1H)，7.25(t,J＝7.4Hz,1H)，4.42(t,J＝7.0Hz,2H)，1.73‑1.79(m,2H)，1.27‑
1.35(m,2H)，0.89(t,J＝7.4Hz,3H)。

[0048] 实施例4化合物(Ⅵ)

[0049] 反应瓶中加入3.97g(12mmol)化合物(Ⅴ)、1.75g(24mmol)DMF和30mL三氯甲烷，用冰盐浴控温在0～5℃，缓慢滴加3.68g(24mmol)三氯氧磷，滴毕，加热回流反应8h，接着将反应混合物倒入到冰水中，用30％的氢氧化钠水溶液调节pH至8，再用二氯甲烷萃取，获得的有机层经无水硫酸钠干燥后，再经硅胶柱层析分离[洗脱剂：V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝25:1]，得到2.29g黄色化合物(Ⅵ)。

[0050] 实施例5化合物(Ⅰ)

[0051] 反应瓶中加入0.36g(1mmol)化合物(Ⅵ)、0.26g(1.2mmol)化合物(Ⅱ)和15mL乙醇，搅拌溶解，再加入0.17g(2mmol)哌啶，然后加热回流反应9h，接着冷却至室温，析出的固1
体抽滤，滤饼经乙醇重结晶，得到0.32g红色化合物(Ⅰ)。m.p.253‑255℃；HNMR(DMSO‑d6,
500MHz)δ：8.82(d,J＝6.8Hz,2H)，8.45(d,J＝1.4Hz,1H)，8.23(d,J＝15.9Hz,1H)，8.20(d,J＝6.8Hz,2H)，8.19(d,J＝7.7Hz,1H)，7.77(dd,J1＝8.6Hz,J2＝1.4Hz,1H)，7.65(d,J＝
8.6Hz,1H)，7.63(d,J＝8.2Hz,1H)，7.55(d,J＝16.1Hz,1H)，7.49(t,J＝7.7Hz,1H)，7.48(d,J＝3.8Hz,1H)，7.30(d,J＝3.8Hz,1H)，7.29(d,J＝16.1Hz,1H)，7.25(t,J＝7.5Hz,1H)，
7.13(d,J＝15.9Hz,1H)，5.26(t,J＝5.3Hz,1H)，4.53(t,J＝4.8Hz,2H)，4.42(t,J＝7.0Hz,
2H)，3.86(q,J＝4.9Hz,2H)，1.74‑1.80(m,2H)，1.28‑1.35(m,2H)，0.89(t,J＝7.4Hz,3H)；
13
C NMR(DMSO‑d6,125MHz)δ：152.63，147.42，144.32，140.47，140.17，138.31，133.96，
133.49，131.83，127.20，127.17，126.03，124.86，122.84，122.51，122.05，121.18，120.40，
119.10，118.72，109.69，109.57，61.85，60.01，42.14，30.70，19.73，13.68；FT‑IR(KBr)ν：
‑1
3422，3034，2957，2928，2873，1639，1593，1468，1439，1212，1173，951，871，747cm ；HRMS+
(ESI)：m/zcalcd for C31H31N2OS[M‑Br]：479.2157；found：479.2154。

[0052] 实施例6化合物(Ⅰ)

[0053] 反应瓶中加入0.36g(1mmol)化合物(Ⅵ)、0.33g(1.5mmol)化合物(Ⅱ)和20mL甲醇，搅拌溶解，再加入0.26g(3mmol)哌啶，然后加热回流反应10h，接着冷却至室温，析出的固体抽滤，滤饼经乙醇重结晶，得到0.27g红色化合物(Ⅰ)。

[0054] 实施例7吸收与荧光发射光谱测试

[0055] 生物体内的细胞均生活在水环境中，因此表征化合物(Ⅰ)在H2O中的吸收与荧光发射光谱非常重要。其吸收光谱用ShimadzuUV‑2550型紫外‑可见分光光度计测量，荧光发射光谱用RF‑5301PC型荧光分光光度计测量，具体结果见图1。化合物(Ⅰ)中存在着羟乙基，与水分子易于形成氢键，在H2O中的最大吸收波长为469nm。化合物(Ⅰ)的发射激发态与基态之间的能隙比较小，在H2O中的最大发射波长为659nm，发射出红色荧光，这在生物成像时能够增大生物样品的穿透深度，减少光损伤和自发荧光干扰。化合物(Ⅰ)在H2O中的斯托克斯位移很大，达到了190nm，从而使它的发射光谱和吸收光谱重叠得非常少，这在生物成像时，可以显著降低荧光自吸收现象，增大信噪比，从而提高成像的准确度和灵敏度。

[0056] 实施例8双光子吸收截面测试

[0057] 表征物质双光子吸收性能的重要参数是双光子吸收截面。化合物(Ⅰ)的双光子吸收截面采用开孔Z‑扫描法测试。Z‑扫描法具有实验光路简单、测量灵敏度高等优点。测试时，以钛宝石飞秒激光器(Chameleon Ultra II，680‑1080nm，80MHz，140fs)作为激发光源，激光束经过透镜聚焦，待测样品在透镜焦点前后沿着激光束传播的方向(Z轴)移动，入射光通过样品后的透射光经过分束镜分束，再经过透镜聚焦后被能量计接收，从而得到样品在Z轴上不同位置处的开孔Z‑扫描信号。将测量得到的多个数据点用以下公式(1)拟合，从而推导出双光子吸收系数(β)，然后再根据公式(2)计算出双光子吸收截面(σ)。

[0058]

[0059] 式中，T(z)为透过率， 其中β为双光子吸收系数，I0为焦点处入射光峰值光强，Leff为样品池的有效厚度，z为样品距离焦点的位移， 为高斯光束衍射常数，其中ω0为入射光束腰半径，λ为入射光波长。

[0060]

[0061] 式中，h为普朗克常数，v为入射光频率，NA为阿伏伽德罗常数，c为样品浓度。

[0062] 图2为化合物(Ⅰ)在920nm激发下的开孔Z‑扫描实验结果和拟合曲线。图中，点是归一化的实验数据，实线是拟合曲线，根据拟合结果得出它的双光子吸收系数为0.021cm GW‑1，然后由公式(2)计算出双光子吸收截面为753GM。因此，化合物(Ⅰ)展现出了良好的双光子吸收性能。

[0063] 实施例9在活细胞中双光子荧光成像

[0064] 将人卵巢癌细胞(OVCAR‑8)接种到成像专用培养皿中，在含有10％胎牛血清和1％青霉素‑链霉素的RPMI 1640培养基中培养24h。然后加入10μM化合物(Ⅰ)，在37℃、5％CO2条件下孵育细胞0.5h，接着移去培养基，用PBS缓冲溶液洗涤2‑3次，采用Olympus BX61W1‑FV1000双光子共聚焦激光扫描显微镜进行双光子荧光成像，激发波长为800nm，荧光发射信号收集通道为575‑630nm。

[0065] 图3为化合物(Ⅰ)对OVCAR‑8活细胞的双光子荧光成像。结果表明：化合物(Ⅰ)具有良好的活细胞穿透性，能够成功进入到活细胞内部。

[0066] 实施例10在活细胞中共定位荧光成像

[0067] 将人宫颈癌细胞(HeLa)接种到成像专用培养皿中，在含有10％胎牛血清和1％青霉素‑链霉素的DMEM培养基中培养24h。然后加入10μM化合物(Ⅰ)，在37℃、5％CO2条件下孵育细胞0.5h，接着移去培养基，用PBS缓冲溶液洗涤2‑3次，再加入1μM内质网商用染料(ER‑Tracker Red)，在37℃、5％CO2条件下继续孵育细胞15min，用PBS缓冲溶液洗涤2‑3次后进行共定位荧光成像。ER‑Tracker Red的激发波长为580nm，荧光发射信号收集通道为560‑660nm，化合物(Ⅰ)的激发波长为800nm，荧光发射信号收集通道为575‑630nm。

[0068] 图4为化合物(Ⅰ)和内质网商用染料(ER‑Tracker Red)对HeLa活细胞的共定位荧光成像。结果表明：化合物(Ⅰ)和ER‑Tracker Red两者发射的荧光高度重叠，皮尔森相关系数达到0.95，从而确证了化合物(Ⅰ)对内质网的靶向性，其能够发射红色双光子荧光点亮活细胞中的内质网区域。

[0069] 以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请的保护范围，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。