一株特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株及其在提升中药提取物产率中的应用

摘要

本发明属于中药提取技术领域，公开了一株特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)1号菌株及其在提升中药提取物产率中的应用。所述特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株于2021年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23988，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株能显著提升异枝江蓠、杜仲、黄芪、甘草、枸杞等中药提取物的产率，提高中药的利用度。

权利要求

1.一株特呈岛蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）1号菌株，其特征在于，所述特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株于2021年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 23988。

2.权利要求1所述特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株在提升中药多糖产率中的应用，其特征在于，所述中药为异枝江蓠、杜仲、黄芪、甘草、枸杞中的一种或几种。

3.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂含有权利要求1所述特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株和/或其菌液和/或其培养液。

4.权利要求3所述微生物制剂在提升中药多糖产率中的应用，其特征在于，所述中药为异枝江蓠、杜仲、黄芪、甘草、枸杞中的一种或几种。

5.一种提升中药多糖产率的方法，其特征在于，使用权利要求1所述特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株或权利要求3所述微生物制剂对中药进行预处理；所述中药为异枝江蓠、杜仲、黄芪、甘草、枸杞中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述预处理为：将中药粉碎、灭菌，再将权利要求1所述特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株或权利要求3所述微生物制剂均匀喷洒在中药粉末表面，再进行培养。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述培养为在35～40℃下培养70～75h。

说明书

一株特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株及其在提升中药提取物产

率中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于中药提取技术领域，更具体地，涉及一株特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株及其在提升中药提取物产率中的应用。

背景技术

[0002] 中药提取物作为国际天然医药保健品市场上的一种新的产品形态，是现代中药先进技术的载体，目前常用的提取方法(如煎煮法、回流法、浸渍法、渗漉法等)在保留有效成分、去除无效成分方面，存在着有效成分损失大、周期长、工序多、提取率不高等缺点。

[0003] 中药多糖作为中药提取物之一，是指从中药中提取得到的一类活性多糖，一般不包括淀粉和纤维素，通常可用于维持生物活性物质或提升机体生理功能，具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗衰老等作用。随着中药研究领域的发展，超声波由于其独特的机械效应、热学效应及空化效应，已经作为一种新技术被广泛应用到中药有效成分的提取中，特别在中药多糖提取分离的应用中已展示出明显的优势，然而，对中药材直接进行超声提取，所得多糖产率较低。

[0004] 现有技术中公开了可用于防治棉花黄萎病、立枯丝核病的蜡样芽孢杆菌，也公开了可用于促进植株根系生长的蜡样芽孢杆菌，但尚未有蜡样芽孢杆菌在提升中药提取物产率等方面的相关报道。

发明内容

[0005] 本发明针对现有技术中存在的缺陷或不足，旨在提供一株特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株，以提升中药提取物的产率，进而提高中药的利用度。

[0006] 本发明的第一目的是提供一株特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株。

[0007] 本发明的第二个目的是提供上述特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株在提升中药提取物产率中的应用。

[0008] 本发明的第三个目的是提供一种微生物制剂。

[0009] 本发明的第四个目的是提供上述微生物制剂在提升中药提取物产率中的应用。

[0010] 本发明的第五个目的是提供一种提升中药提取物产率的方法。

[0011] 本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

[0012] 本发明提供了一株特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株，该特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株于2021年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23988，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0013] 本发明从广东省湛江市特呈岛沿海沙滩的白螺内脏样品中分离、筛选得到1号菌株，并通过形态鉴定和分子鉴定确定1号菌株属于蜡样芽孢杆菌，命名为特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株。

[0014] 本发明所述特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株能显著提升异枝江蓠、杜仲、黄芪、甘草、枸杞等中药提取物的产率，提高中药的利用度。因此，上述特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株在提升中药提取物产率中的应用应在本发明的保护范围之内。

[0015] 优选地，所述提升中药提取物产率包括但不限于提升中药多糖的产率。

[0016] 优选地，所述中药包括但不限于异枝江蓠、杜仲、黄芪、甘草、枸杞。

[0017] 本发明还提供了一种微生物制剂，该微生物制剂含有上述特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株和/或其菌液和/或其培养液，并提供了上述微生物制剂在提升中药提取物产率中的应用。优选地，所述中药包括但不限于异枝江蓠、杜仲、黄芪、甘草、枸杞。

[0018] 此外，本发明提供了一种提升中药提取物产率的方法，该方法使用上述特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株或上述微生物制剂对中药进行预处理。

[0019] 优选地，所述预处理为：将中药粉碎、灭菌，再将上述特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株或上述微生物制剂均匀喷洒在中药粉末表面，再进行培养。

[0020] 进一步优选地，所述培养为在35～40℃下培养70～75h。

[0021] 本发明具有以下有益效果：

[0022] 本发明所述特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株能显著提升异枝江蓠、杜仲、黄芪、甘草、枸杞等中药提取物的产率，提高中药的利用度。

附图说明

[0023] 图1为特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株的单菌落图；

[0024] 图2为凝胶电泳结果。

具体实施方式

[0025] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0026] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0027] 一、培养基的制备：

[0028] (1)营养肉汤培养基：

[0029] 称取18g营养肉汤粉(10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g氯化钠)，置于锥形瓶中，加入1000mL蒸馏水，在60℃下水浴加热15min、混匀，每支小试管中倒入10mL，在121℃灭菌
30min，放置24小时，备用。

[0030] (2)羧甲基纤维素钠培养基：

[0031] 将5g CMC‑Na、2g(NH4)2SO4、0.5g蛋白胨、0.25g MgSO4·7H20、0.5g KH2PO4、0.5g琼脂加入到500mL蒸馏水中，在60℃下水浴加热15min、混匀，并在121℃下灭菌30m in，灭菌后取出置于紫外线照射过的超净工作台中，每个平板培养皿中倒入15mL，放置24小时，备用。

[0032] (3)琼脂平板：

[0033] 称取32g营养琼脂粉(蛋白胨10g、牛肉浸出粉3g、氯化钠5g、琼脂14g)置于锥形瓶中，加入1000mL蒸馏水，在60℃下水浴加热15min、混匀，在121℃灭菌30min，灭菌后取出置于紫外线照射过的超净工作台中，每个平板培养皿中倒入15mL，放置24小时，备用。

[0034] 实施例1特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株的分离、纯化和保藏[0035] 一、特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株的分离、纯化

[0036] 1、样品采集：

[0037] 在广东省湛江市特呈岛沿海沙滩采集6个白螺，取其内脏收集到6份样品。

[0038] 2、菌株分离：

[0039] 将样品研磨后，加入到生理盐水中充分震荡，在1000r/min条件下离心5min，离心所得上清液即为待检样品液。将2％待测样品液接种于营养肉汤培养基中，置于80℃水浴锅中加热30min，取出后迅速冷却，将该培养物划线接种于营养琼脂平板上，置于35℃温箱中培养24h，共获得3株分离菌。

[0040] 3、菌株挑选：

[0041] 将3株分离菌接种于10mL的营养肉汤培养基，在35℃下培养24h，再在4000r/min条件下离心30min，离心所得上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤后，即得到待测菌液。用淀粉‑碘比色法分别测定待测菌液的淀粉酶活性，用福林‑酚比色法测定待测菌液的蛋白酶活性，用纤维素酶试剂盒(格锐思生物公司)待测菌液的纤维素酶活性，结果如表1所示。

[0042] 酶活力单位定义如下所示。淀粉酶活性：100mL消化酶在37℃、30min内水解10mg淀粉为1个淀粉酶活力单位；蛋白酶活性：每毫升消化酶在37℃下每分钟水解酪素产生1μg酪氨酸为1个蛋白酶活力单位；纤维素酶活性：每毫升消化酶在37℃下每分钟催化产生1μg还原糖定义为1个酶活力单位。

[0043] 表1

[0044]

[0045] 通过测定3株分离菌的淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶活性，发现1号菌株的综合酶活性最高，对其进行菌种鉴定。

[0046] 4、菌株鉴定：

[0047] (1)菌落形态鉴定

[0048] 用三点法在琼脂固体培养基中培养1号菌株，发现该菌株的单个菌落形态如图1所示。该菌落呈直径3～6cm的大菌落；表面高起，边缘和形状不规则，似溶蜡状。

[0049] (2)菌株分子鉴定

[0050] 以1号菌株总DNA为模板 ，使用细菌通用引物 (27F(5 ′‑3 ′) ：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R(5′‑3′)：GGTTACCTTGTTACGACTT)进行PCR扩增(扩增体系(50μL)：上下游引物各2μL，DNA模板4.1μL、4.2μL，Green Tagmix酶25μL，ddH2O补充至50μL；扩增程序：98℃2min；95℃10s、57℃15s、68℃90s，共40个循环)，将得到的PCR扩增产物进行凝胶电泳(结果如图2所示)，并采用ABI 3730XL测序仪进行测序，得到1号菌株的16S rRNA(27F)如SEQ ID NO.1所示。

[0051] SEQ ID NO.1：

[0052] GGGGCTATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCGTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGTGCATGGTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGTTAAGTCCCGCACGAGCGCAACCCTTGATCTAGTGCCATCATAGCTGGCACTCTAGGGTGACTGCCGTGACGACGGAGATGTGGATGACGTTCAATCATCATGCCCTTATACCTGGGCTACACACACGTGGCGTAACAATGTGAACG

[0053] 将测得的1号菌株的16S rRNA在NCBI Blast网站上进行同源性比对，发现1号菌株与蜡样芽孢杆菌的相似性高达99％以上。

[0054] 综上，结合菌落形态和菌株分子鉴定结果，可以确定1号菌株属于蜡样芽孢杆菌，命名为特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株。

[0055] 5、特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株的保藏

[0056] 特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株于2021年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23988，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0057] 实施例2特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株可提升异枝江蓠中多糖的产率

[0058] 一、实验方法

[0059] S1.用接种环取一环特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株，接种于营养肉汤培养基中，置于37℃恒温培养箱中，培养24小时后，得到培养液(取营养肉汤培养基9
进行菌种计数，测得培养基中细菌量为2×10CFU/mL)；

[0060] S2.将15g异枝江蓠打磨粉碎，过20目筛，置于锥形瓶中，在121℃下灭菌30min，冷却，分为两组(普通组、特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组)，每组5g；普通组不做预处理；在特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组中，将5mL S1所得培养液均匀喷洒在异枝江蓠粉末表面；并将两组分别置于37℃恒温培养箱中培养72h；

[0061] S3.分别在两组中取5g异枝江蓠粉末加入到100mL蒸馏水中，浸泡1h，在功率100W、温度70℃下连续超声20min，超声结束后过60目筛，在离心机中以5000r/min的转速离心10min，得到离心残渣1和上清液1。再将离心残渣1参照前述过程进行连续两次的浸泡、超声、过筛、离心，得到离心所得上清液2‑3。分别将上清液1‑3蒸煮浓缩至20mL，加入无水乙醇
100mL，4℃下静置24h，过滤后得到沉淀固形物1‑3，合并沉淀固形物1‑3，置于干燥箱中脱水干燥，完全干燥后称重并记录数据。

[0062] 二、实验结果

[0063] 普通组异枝江蓠的多糖产率为8％，特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组中异枝江蓠的多糖产率为36％。与普通组相比，特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组异枝江蓠的多糖产率提高了350％。

[0064] 实施例3特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株可提升杜仲中多糖的产率

[0065] 一、实验方法

[0066] S1.用接种环取一环特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株，接种于营养肉汤培养基中，置于37℃恒温培养箱中，培养24小时后，得到培养液；

[0067] S2.将150g杜仲打磨粉碎，过20目筛，置于锥形瓶中，在121℃下灭菌30min，冷却，分为两组(普通组、特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组)，每组50g；普通组不做预处理；在特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组中，将5mL S1所得培养液均匀喷洒在杜仲粉末表面；并将两组分别置于37℃恒温培养箱中培养72h；

[0068] S3.分别在两组中取50g杜仲粉末加入到1000mL蒸馏水中，浸泡1h，在功率100W、温度70℃下连续超声40min，超声结束后过60目筛，在离心机中以5000r/min的转速离心10min，得到离心残渣1和上清液1。再将离心残渣1参照前述过程进行连续两次的浸泡、超声、过筛、离心，得到离心所得上清液2‑3。分别将上清液1‑3蒸煮浓缩至50mL，加入无水乙醇
250mL，4℃下静置24h，过滤后得到沉淀固形物1‑3，合并沉淀固形物1‑3，置于干燥箱中脱水干燥，完全干燥后称重并记录数据。

[0069] 二、实验结果

[0070] 普通组杜仲的多糖产率为11.8％，特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组中杜仲的多糖产率为31.9％。与普通组相比，特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组杜仲的多糖产率提高了170％。

[0071] 实施例4特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株可提升黄芪中多糖的产率

[0072] 一、实验方法

[0073] S1.用接种环取一环特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株，接种于营养肉汤培养基中，置于37℃恒温培养箱中，培养24小时后，得到培养液；

[0074] S2.将150g黄芪打磨粉碎，过20目筛，置于锥形瓶中，在121℃下灭菌30min，冷却，分为两组(普通组、特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组)，每组50g；普通组不做预处理；在特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组中，将5mL S1所得培养液均匀喷洒在黄芪粉末表面；并将两组分别置于37℃恒温培养箱中培养72h；

[0075] S3.分别在两组中取50g黄芪粉末加入到1000mL蒸馏水中，浸泡1h，在功率65W、温度60℃下连续超声40min，超声结束后过60目筛，在离心机中以3000r/min的转速离心10min，得到离心残渣1和上清液1。再将离心残渣1参照前述过程进行连续两次的浸泡、超声、过筛、离心，得到离心所得上清液2‑3。分别将上清液1‑3蒸煮浓缩至50mL，加入无水乙醇
200mL，4℃下静置24h，过滤后得到沉淀固形物1‑3，合并沉淀固形物1‑3，置于干燥箱中脱水干燥，完全干燥后称重并记录数据。

[0076] 二、实验结果

[0077] 普通组黄芪的多糖产率为9.4％，特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组中黄芪的多糖产率为15.2％。与普通组相比，特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组黄芪的多糖产率提高了62％。

[0078] 实施例5特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株可提升甘草中多糖的产率

[0079] 一、实验方法

[0080] S1.用接种环取一环特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株，接种于营养肉汤培养基中，置于37℃恒温培养箱中，培养24小时后，得到培养液；

[0081] S2.将150g甘草打磨粉碎，过20目筛，置于锥形瓶中，在121℃下灭菌30min，冷却，分为两组(普通组、特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组)，每组50g；普通组不做预处理；在特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组中，将5mL S1所得培养液均匀喷洒在甘草粉末表面；并将两组分别置于37℃恒温培养箱中培养72h；

[0082] S3.分别在两组中取50g甘草粉末加入到1000mL蒸馏水中，浸泡1h，在功率100W、温度70℃下连续超声40min，超声结束后过60目筛，在离心机中以5000r/min的转速离心10min，得到离心残渣1和上清液1。再将离心残渣1参照前述过程进行连续两次的浸泡、超声、过筛、离心，得到离心所得上清液2‑3。分别将上清液1‑3蒸煮浓缩至50mL，加入无水乙醇
250mL，4℃下静置24h，过滤后得到沉淀固形物1‑3，合并沉淀固形物1‑3，置于干燥箱中脱水干燥，完全干燥后称重并记录数据。

[0083] 二、实验结果

[0084] 普通组甘草的多糖产率为21.6％，特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组中甘草的多糖产率为27％。与普通组相比，特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组甘草的多糖产率提高了53％。

[0085] 实施例6特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株可提升枸杞提取物的产率

[0086] 一、实验方法

[0087] S1.用接种环取一环特呈岛蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)1号菌株，接种于营养肉汤培养基中，置于37℃恒温培养箱中，培养24小时后，得到培养液；

[0088] S2.将15g枸杞打磨粉碎，过20目筛，置于锥形瓶中，在121℃下灭菌30min，冷却，分为两组(普通组、特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组)，每组5g；普通组不做预处理；在特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组中，将5mL S1所得培养液均匀喷洒在枸杞粉末表面；并将两组分别置于37℃恒温培养箱中培养72h；

[0089] S3.分别在两组中取5g枸杞粉末加入到100mL蒸馏水中，浸泡1h，在功率100W、温度70℃下连续超声提取3次，每次20min；超声结束后过滤，在离心机中以5000r/min的转速离心10min，取离心所得上清液蒸煮浓缩至60mL，加入无水乙醇5mL，4℃下静置24h，置于干燥箱中进行脱水干燥，完全干燥后称取重量并记录数据。

[0090] 二、实验结果

[0091] 普通组枸杞提取物的产率为45.6％，特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组中枸杞提取物的产率为59.6％。与普通组相比，特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株预处理组枸杞提取物的产率提高了31％。

[0092] 综上，本发明所述特呈岛蜡样芽孢杆菌1号菌株能显著提升异枝江蓠、杜仲、黄芪、甘草、枸杞等中药提取物的产率，提高中药的利用度。

[0093] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。