一种梨果实生物保鲜剂及其用途转让专利
申请号 : CN202210824849.5
文献号 : CN115226763B
文献日 : 2023-03-07
发明人 : 阎芙洁 , 余挺 , 吴雅兰
申请人 : 浙江大学
摘要 :
本发明公开了一种梨果实生物保鲜剂及其用途，属于果蔬采后病害防治技术领域。本发明提出了一种生物保鲜剂能够抑制梨果实青霉病，每毫升生物保鲜剂由经过N‑乙酰氨基葡萄糖诱导的1×108个马克斯克鲁维酵母以及水组成。本发明还提供了该生物保鲜剂的具体制作步骤以及相关培养基配方。所述的马克斯克鲁维酵母为食品级酵母，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号CICC 9005。所述乙酰氨基葡萄糖培养基中添加量为0.5％。本发明提供的生物保鲜剂能够延缓梨果实青霉病侵染，保障果实品质。
权利要求 :
8
1.一种梨果实生物保鲜剂，其特征在于，所述生物保鲜剂由浓度为 1×10个细胞/mL的马克斯克鲁维酵母，以及作为余量的水组成；
所述马克斯克鲁维酵母于培养基中经过 0.5% 浓度的 N‑乙酰氨基葡萄糖诱导培养了（24±1）h；
所述马克斯克鲁维酵母为食品级酵母，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号 CICC9005。
2.根据权利要求1所述的一种梨果实生物保鲜剂，其特征在于，所述培养基包括有 YPD 活化培养基、 SM 种子液培养基和 SM‑0.5% GlcNAc 种子液培养基；
所述 YPD 活化培养基为：（10±0.5）g酵母提取物、（20±0.5）g蛋白胨、（20±0.5）g葡萄糖，加水定容至 1000 mL，灭菌后，得到 YPD 活化培养基；
所述 SM 种子液培养基为：（10±0.5）g葡萄糖、（5±0.1）g硫酸铵、（2±0.1）g磷酸氢二钾、0.03 g硫酸镁、0.005 g硫酸锌、（10±0.1）g氯化钠,加水定容至1000 mL，灭菌后，得到 SM 种子液培养基；
所述 SM‑0.5% GlcNAc 种子液培养基为：利用 5 mL无菌水溶解（5±0.1）g 的N‑乙酰氨基葡萄糖，然后通过0.22 μm滤膜和注射器将 N‑乙酰氨基葡萄糖注入 1000 mL灭菌后的 SM 种子液培养基中，制得 SM‑0.5% GlcNAc 种子液培养基。
3.如权利要求1所述的梨果实生物保鲜剂的用途，其特征在于，用于防止梨果实青霉病害，保证梨果实的品质。
说明书 :
一种梨果实生物保鲜剂及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及果蔬采后病害防治技术领域，尤其涉及一种梨果实生物保鲜剂及其用途。
背景技术
[0002] 梨汁多味美，口感甜中带酸，富含丰富的维生素与纤维素，既可生食也可蒸煮食用，具有极高的营养价值，是深受大众喜爱的水果。梨的种植主要集中在我国安徽、河北、山东、辽宁四省，其品种丰富，各具特点。但梨在采后和储藏运输的过程中容易出现青霉侵染而腐烂变质，造成巨大的经济损失。化学杀菌剂的使用容易使病原菌产生耐药性，同时化学杀菌剂的残留会造成巨大的环境污染，对人体健康造成不可逆伤害。安全、高效、无污染的果蔬菜后病害防治技术急需得到深入研究与推广。
[0003] 自从威尔逊首先提出使用拮抗微生物抑制水果采后病害，一种新型、安全的生物防治技术就此诞生，并逐渐受到国内外科学家的重视。拮抗酵母通过营养空间的竞争、分泌胞外水解酶或产生抑菌物质使得病原菌生长繁殖受到抑制，从而保护果蔬避免受到病原菌的侵害。目前普遍使用的拮抗酵母包括海洋红冬孢酵母(Rhodosporidium paludigenum)、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、毕赤酵母(Pichia pastoris)等。中国发明申请专利《通过诱导抗性来抑制果实采后病害的方法及所用制剂》，申请号：201610522546.2，公开了一种使用海洋红冬孢酵母细胞壁和水组成的制剂来抑制果实采后病害。中国发明申请专利《臭氧与罗伦隐球酵母结合处理对草莓采后病害防治的方法》，申请号：201110360762.9，公开了一种便宜简单的臭氧处理罗伦隐球酵母可以提高在草莓上生防效力的方法。中国发明申请专利《胶红酵母在水果采后病害防治的应用及使用方法》，申请号：201010198131.7，公开了将水果浸泡到胶红酵母菌悬液中来抑制病害的方法。中国发明申请专利《一株库德里阿兹威毕赤酵母及其在农产品产后病害防治中的应用》，申请号：202010818591.9，公开了库德里阿兹威毕赤酵母具有良好拮抗性和农产品采后病害防治作用。然而，研究表明，拮抗剂仅在高浓度的条件下可以有效控制病原体，同时使用单一的拮抗酵母并不像化学杀菌剂那样有效。因此，科学家们在寻找新型高效的拮抗酵母同时也在寻找增强拮抗酵母生防活性的物质。
[0004] 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种非传统酵母，最早由马克斯从葡萄中分离得来，1888年E.C.Hansen鉴定其为酵母属的酵母并被命名为S.marxianus，随后被转移到克鲁维酵母属，之后相继有45个物种被归入该属。马克斯克鲁维酵母因经常与传统乳制品如发酵牛奶、开菲尔、酸奶、奶酪等联系在一起而闻名。由于这些乳制品具有悠久的安全使用历史，马克斯克鲁维酵母成为公认的安全(GRAS)酵母菌株，同时我国已于2013年批准其为可食用菌株。此外，马克斯克鲁维酵母在食品和药品工业中还具有许多实用价值。马克斯克鲁维酵母可以工业规模生产，在生产和储存过程中均能存活，且能耐受人体肠道环境，目前已有研究显示马克斯克鲁维酵母或许是潜在的益生菌株。中国发明申请专利《马克思克鲁维酵母菌及其应用》，申请号：201510540030.6，公开了一种具有高分泌性能和高生物量的马克思克鲁维酵母菌及其应用。中国发明申请专利《一种马克斯克鲁维酵母高密度发酵培养基及其使用方法》，申请号：202210006768.4，公开了一种安全高效的马克斯克鲁维酵母高密度发酵培养基及其使用方法，属于生物工程领域。中国发明申请专利《一种直投式马克斯克鲁维酵母发酵剂及其在水果发酵中的应用》，申请号：
202110237501.1，公开了一种更适合工业化应用的马克斯克鲁维酵母发酵剂及其在水果中的应用。从上述专利可以看出，马克斯克鲁维酵母工业制备技术成熟，但目前对马克斯克鲁维酵母的研究主要集中在发酵工业上，具有一定局限性，其在生物防治上的应用还有待进一步开发。
202110237501.1，公开了一种更适合工业化应用的马克斯克鲁维酵母发酵剂及其在水果中的应用。从上述专利可以看出，马克斯克鲁维酵母工业制备技术成熟，但目前对马克斯克鲁维酵母的研究主要集中在发酵工业上，具有一定局限性，其在生物防治上的应用还有待进一步开发。
[0005] 上述涉及到的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一株保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)的酵母，保藏号为CICC 33373。
[0006] N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖(GlcNAc)基本上存在于所有形式的生命中，它是地球上最丰富的糖类之一。N‑乙酰氨基葡萄糖是真菌细胞壁成分几丁质的单体，承担着维持细胞壁结构的重要角色。作为非常规碳源，N‑乙酰氨基葡萄糖只有在恶劣环境下才会被真菌用作生长繁殖所需的碳源。N‑乙酰氨基葡萄糖在人类病原真菌白色念珠菌中进行了广泛的研究，有研究首次证明它可以作为影响毒性和活力的分子信号。由于细胞壁与生防效果密切相关，N‑乙酰氨基葡萄糖作为细胞壁组成成分，目前少有其在生防方面的报道，急需进一步研究与应用。中国发明申请专利《一种N‑乙酰氨基葡萄糖的制备方法》，申请号：201910951816.5，公开了一种高纯度N‑乙酰氨基葡萄糖的制备方法。中国发明申请专利《一种N‑乙酰氨基葡萄糖片剂及其制备方法》，申请号：202011154982.1，公开了N‑乙酰氨基葡萄糖片剂的制备方法。中国发明申请专利《一种N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法》，申请号：201510465034.2，公开了一种能显著提高发酵液中N‑乙酰氨基葡萄糖含量与转化率的发酵生产方法。中国发明申请专利《一种生产N‑乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用》，申请号：201810302095.0，公开了一种生产N‑乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌S9114及其应用，属于代谢工程领域。中国发明申请专利《N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖的新用途及相关产品》，申请号：202010626521.3，公开了N‑乙酰氨基葡萄糖或其药物可接受的盐在制备防治肠易激综合症的微生态制剂或制备双歧杆菌活性改善剂的应用。中国发明申请专利《利用乙酰氨基葡萄糖提高酵母抑制果实病害效力的方法》，申请号：202010104511.3，公开了利用N‑乙酰氨基葡萄糖提高海洋红冬孢酵母生防效力的应用。从上述专利中可以看出，作为一种食品级、广泛存在，制备简单和安全性高的小分子糖类，N‑乙酰氨基葡萄糖具有较高的商业价值，在生防方面具有很强的潜力。结合上述内容，本发明提出了一种利用N‑乙酰氨基葡萄糖诱导培养马克斯克鲁维酵母而制得的用于抑制梨果实采后青霉病的生物保鲜剂及用途。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种能够有效防止梨果实采后青霉病害，保证梨果实的品质的生物保鲜剂及其用途，主要由马克斯克鲁维酵母和N‑乙酰氨基葡萄糖组成，有效增强了马克斯克鲁维酵母生防效力。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0009] 本发明提出了：一种梨果实生物保鲜剂，所述生物保鲜剂由浓度为1×108个细胞/mL的马克斯克鲁维酵母，以及作为余量的水组成；
[0010] 所述马克斯克鲁维酵母于培养基中经过0.5％浓度的N‑乙酰氨基葡萄糖诱导培养了(24±1)h；
[0011] 所述马克斯克鲁维酵母为食品级酵母，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号CICC 9005。
[0012] 本发明还进一步提出了：利用N‑乙酰氨基葡萄糖诱导培养马克斯克鲁维酵母所用的培养基，包括有YPD活化培养基、SM种子液培养基和SM‑0.5％GlcNAc种子液培养基；
[0013] 所述YPD活化培养基为：(10±0.5)g酵母提取物、(20±0.5)g蛋白胨、(20±0.5)g葡萄糖，加水定容至1000mL，115℃灭菌25分钟，得到YPD活化培养基；
[0014] 所述SM种子液培养基为：(10±0.5)g葡萄糖、(5±0.1)g硫酸铵、(2±0.1)g磷酸氢二钾、0.03g硫酸镁、0.005g硫酸锌、(10±0.1)g氯化钠,加水定容至1000mL，115℃灭菌25分钟，得到SM种子液培养基；
[0015] 所述SM‑0.5％GlcNAc种子液培养基为：利用5mL无菌水溶解(5±0.1)g的N‑乙酰氨基葡萄糖，然后通过0.22μm滤膜和注射器将N‑乙酰氨基葡萄糖注入1000mL灭菌后的SM种子液培养基中，制得SM‑0.5％GlcNAc种子液培养基。
[0016] 本发明还进一步提出了：梨果实生物保鲜剂的用途，用于防止梨果实青霉病害，保证梨果实的品质。
[0017] 本发明还进一步提出了：利用上述培养基制备提高马克斯克鲁维酵母生防效力的生物保鲜剂方法，具体见以下步骤：
[0018] (1)菌株活化
[0019] 将马克斯克鲁维酵母从YPD平板上挑取一环接种到YPD培养基中在28℃、200rpm摇床培养24h，重复传代培养2次；
[0020] (2)扩大培养
[0021] 将活化好的马克斯克鲁维酵母按照2％的接种量接种到SM‑0.5％GlcNAc种子液培养基，在28℃、200rpm摇床中培养24h；
[0022] (3)离心分离
[0023] 将步骤(2)中的马克斯克鲁维酵母4000rpm离心3分钟后用无菌水清洗三次，利用8
血球计数板得到1×10个细胞/mL的制剂，即为本发明所提出的生物保鲜剂。
血球计数板得到1×10个细胞/mL的制剂，即为本发明所提出的生物保鲜剂。
[0024] 与现有技术相比，本发明提供了一种梨果实生物保鲜剂及其用途，具备以下有益效果：
[0025] (1)本发明制备生物保鲜剂所使用的马克斯克鲁维酵母与诱导物质N‑乙酰氨基葡萄糖均为公认安全，食品级的酵母和小分子糖，以此制备的生物保鲜剂具有较高的安全性与商业价值，符合绿色环保理念。
[0026] (2)本发明所使用N‑乙酰氨基葡萄糖来源广泛，易于制备，在本发明的SM‑0.5％GlcNAc种子液培养基中添加量仅0.5％即可发挥作用，操作简单同时经济便宜，能有效替代化学杀菌剂，减少环境污染与对人体健康的危害。
[0027] (3)本发明所使用的SM种子液培养基成分采用廉价常见的无机盐，替代了部分YPD培养基中的有机成分，性价比高，是一种更具经济效益的廉价培养基。
附图说明
[0028] 图1为不同浓度N‑乙酰氨基葡萄糖诱导马克斯克鲁维酵母培养24小时后对梨果实青霉病的抑制效果；其中(a)为病斑直径，(b)为发病率；其中柱形图上的小写字母代表差异显著性(P<0.05)；
[0029] 图2为0.5％N‑乙酰氨基葡萄糖诱导马克斯克鲁维酵母不同时间后对梨果实青霉病的抑制效果；其中(a)为病斑直径，(b)为发病率；其中柱形图上的小写字母代表差异显著性(P<0.05)；
[0030] 图3为0.5％N‑乙酰氨基葡萄糖诱导马克斯克鲁维酵母培养24小时后在模拟冷链运输4℃冷藏条件下对梨果实青霉病的抑制效果；其中(a)为病斑直径，(b)为发病率；其中柱形图上的小写字母代表差异显著性(P<0.05)；
[0031] 图4为0.5％N‑乙酰氨基葡萄糖诱导马克斯克鲁维酵母培养24小时后在体外平板上抑制青霉生长的效果与孢子萌发的效果；其中(a)为平板抑制孢子生长实拍图，(b)为平板上青霉生长直径，(c)为体外抑制青霉孢子萌发率；其中柱形图上的小写字母代表差异显著性(P<0.05)。
具体实施方式
[0032] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0033] 需强调的是，除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
[0034] 实施例1：
[0035] 请参阅图1‑4，本实施例中所适用的梨果实为水晶梨，产地河北，均为表皮无机械损伤、未感染病原菌，大小、成熟度等外观品质基本一致的果实。实验前用自来水冲去梨表面灰尘，用体积浓度0.1％的次氯酸钠溶液浸泡消毒2分钟后用自来水冲洗干净，在室温下晾干备用。
[0036] 本实施例所使用的拮抗酵母为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus，CICC NO.33373)；病原菌为扩展青霉(Penicillium expansum)；N‑乙酰氨基葡萄糖为白色粉状产品。
[0037] 本实施例所使用的培养基包括有YPD活化培养基、SM种子液培养基和SM‑0.5％GlcNAc种子液培养基；
[0038] YPD活化培养基为：10g酵母提取物、20g蛋白胨、20g葡萄糖，加水定容至1000mL，每瓶分装到50～250mL的锥形瓶中，115℃灭菌25分钟，得到YPD活化培养基；
[0039] SM种子液培养基为：10g葡萄糖、5g硫酸铵、2g磷酸氢二钾、0.03g硫酸镁、0.005g硫酸锌、10g氯化钠,加水定容至1000mL，每瓶分装到50～250mL的锥形瓶中，115℃灭菌25分钟，得到SM种子液培养基；
[0040] SM‑0.5％GlcNAc种子液培养基为：利用5mL无菌水溶解5g的N‑乙酰氨基葡萄糖，然后通过0.22μm滤膜和注射器将N‑乙酰氨基葡萄糖注入1000mL灭菌后的SM种子液培养基中，制得SM‑0.5％GlcNAc种子液培养基。
[0041] 制备生物保鲜剂：将在50mL YPD培养基(28℃、200rpm条件下培养24小时，重复传代2次)中活化好的马克斯克鲁维酵母按照体积分数2％的接种量接入到0.5％GlcNAc种子液培养基中，在28℃、200rpm摇床中培养24小时后取出，按照如下步骤操作：
[0042] (1)取10mL的0.5％GlcNAc种子液于无菌离心管中，在4℃、4000rpm的条件下离心3分钟，用无菌水洗涤三次，得到菌悬液；
[0043] (2)在显微镜下用血球计数板将步骤(1)中的菌悬液计数，适量稀释后得到1×108个细胞/mL的诱导后马克斯克鲁维酵母菌悬液，该菌悬液即为生物保鲜剂。每毫升生物保鲜8
剂含有1×10个诱导后的马克斯克鲁维酵母，其余为水。使用前需要适当摇晃均匀。
剂含有1×10个诱导后的马克斯克鲁维酵母，其余为水。使用前需要适当摇晃均匀。
[0044] 实验1：不同浓度N‑乙酰氨基葡萄糖诱导培养马克斯克鲁维酵母对梨果实青霉病的控制效果
[0045] 1.实验材料与处理
[0046] 用消过毒的打孔器在梨的赤道附近打五个直径为3mm，深度1mm的伤口，接着接种不同的20μl处理组试剂，接种后将梨在室温放置2小时，然后每个伤口再接种20μl浓度为15
×10个孢子/mL的扩展青霉孢子悬液，待伤口处液体晾干后，用保鲜膜密封作保湿处理。放置在25℃环境贮藏，第3‑6天观察结果。每个处理重复9个梨果实，每次试验重复3次。
×10个孢子/mL的扩展青霉孢子悬液，待伤口处液体晾干后，用保鲜膜密封作保湿处理。放置在25℃环境贮藏，第3‑6天观察结果。每个处理重复9个梨果实，每次试验重复3次。
[0047] 具体处理安排如下：
[0048] 处理1：无菌水，即对照；
[0049] 处理2：1×108细胞/mL的马克斯克鲁维酵母菌悬液；
[0050] 处理3：0.1％GlcNAc诱导后的1×108细胞/mL的马克斯克鲁维酵母菌悬液；
[0051] 处理4：0.5％GlcNAc诱导后的1×108细胞/mL的马克斯克鲁维酵母菌悬液；
[0052] 处理5：1.0％GlcNAc诱导后的1×108细胞/mL的马克斯克鲁维酵母菌悬液。
[0053] 2.结果
[0054] 第3‑6天的结果如图1所示，马克斯克鲁维酵母本身具有明显的生防效力，在加入N‑乙酰氨基葡萄糖后生防效力又有提升，其中以0.5％GlcNAc诱导后的马克斯克鲁维酵母生防效力提升最为明显，其病斑直径与发病率均明显低于对照组与其他处理组。
[0055] 实验2：0.5％N‑乙酰氨基葡萄糖诱导培养马克斯克鲁维酵母不同时间对梨果实青霉病的控制效果
[0056] 1.实验材料与处理
[0057] 用消过毒的打孔器在梨的赤道附近打四个直径为3mm，深度1mm的伤口，接着接种不同的20μl处理组试剂，接种后将梨在室温放置2小时，然后每个伤口再接种20μl浓度为15
×10个孢子/mL的扩展青霉孢子悬液，待伤口处液体晾干后，用保鲜膜密封作保湿处理。放置在25℃环境贮藏，第3‑6天观察结果。每个处理重复9个梨果实，每次试验重复3次。
×10个孢子/mL的扩展青霉孢子悬液，待伤口处液体晾干后，用保鲜膜密封作保湿处理。放置在25℃环境贮藏，第3‑6天观察结果。每个处理重复9个梨果实，每次试验重复3次。
[0058] 具体处理安排如下：
[0059] 处理1：无菌水，即对照；
[0060] 处理2：0.5％GlcNAc诱导培养24h后的1×108个细胞/mL的马克斯克鲁维酵母菌悬液；
[0061] 处理3：0.5％GlcNAc诱导培养48h后的1×108个细胞/mL的马克斯克鲁维酵母菌悬液；
[0062] 处理4：0.5％GlcNAc诱导培养72后的1×108个细胞/mL的马克斯克鲁维酵母菌悬液。
[0063] 2.结果
[0064] 第3‑6天的结果如图2所示，0.5％GlcNAc诱导培养24h的马克斯克鲁维酵母生防效力最佳，与其他对照组产生明显区别，病斑直径与发病率均较低。说明诱导时间24h为宜。
[0065] 实验3：0.5％N‑乙酰氨基葡萄糖诱导培养马克斯克鲁维酵母在冷藏4℃条件下对梨果实青霉病的控制效果
[0066] 1.实验材料与处理
[0067] 用消过毒的打孔器在梨的赤道附近打三个直径为3mm，深度1mm的伤口，接着接种不同的20μl处理组试剂，接种后将梨在室温放置2小时，然后每个伤口再接种20μl浓度为15
×10个孢子/mL的扩展青霉孢子悬液，待伤口处液体晾干后，用保鲜膜密封作保湿处理。放置在4℃环境贮藏，第3‑6天观察结果。每个处理重复9个梨果实，每次试验重复3次。
×10个孢子/mL的扩展青霉孢子悬液，待伤口处液体晾干后，用保鲜膜密封作保湿处理。放置在4℃环境贮藏，第3‑6天观察结果。每个处理重复9个梨果实，每次试验重复3次。
[0068] 具体处理安排如下：
[0069] 处理1：无菌水，即对照；
[0070] 处理2：1×108细胞/mL的马克斯克鲁维酵母菌悬液；
[0071] 处理3：0.5％GlcNAc诱导培养24h后的1×108个细胞/mL的马克斯克鲁维酵母菌悬液。
[0072] 2.结果
[0073] 第3‑6天的结果如图3，在4℃冷藏条件下，诱导后的酵母依然能够提高生防效力。这说明经0.5％GlcNAc诱导培养24h的马克斯克鲁维酵母具有更优异的抗逆性，因此在冷藏条件下依旧能保持良好的细胞活力从而提升生防效力。
[0074] 实验4：0.5％N‑乙酰氨基葡萄糖诱导培养马克斯克鲁维酵母不同时间对梨果实青霉病的控制效果
[0075] 1.实验材料与处理
[0076] (1)PDA培养基配方：每升200g小块马铃薯去皮煮透过滤后的液体、20g/L葡萄糖、20g/L琼脂。按照配方配置1L PDA培养基，115℃灭菌25分钟，于无菌环境倒平板，使平板厚度尽量保持一致。待平板凝固后，用灭菌的打孔器打一个直径3mm的孔。像孔内接种不同的
5
10μl处理组试剂，待自然干燥后再接10μl浓度为1×10个孢子/mL的扩展青霉孢子悬液。
5
10μl处理组试剂，待自然干燥后再接10μl浓度为1×10个孢子/mL的扩展青霉孢子悬液。
[0077] 具体处理安排如下：
[0078] 处理1：无菌水，即对照；
[0079] 处理2：5×108个细胞/mL的马克斯克鲁维酵母菌悬液；
[0080] 处理3：0.5％GlcNAc诱导培养24h后的5×108个细胞/mL的马克斯克鲁维酵母菌悬液。
[0081] (2)PDA配方中不加琼脂制备PDB培养基，分装到250mL锥形瓶中每瓶50mL PDB培养8 10
基，添加500μl浓度为1×10孢子/mL的扩展青霉孢子悬浮液和500μl浓度为1×10 个细胞/
6 8
mL的酵母悬浮液，使得孢子终浓度为1×10个孢子/mL，酵母终浓度为1×10 细胞/mL。在25℃，200rpm的摇床中培养14h后显微镜下记录孢子萌发数并计算孢子萌发率。
基，添加500μl浓度为1×10孢子/mL的扩展青霉孢子悬浮液和500μl浓度为1×10 个细胞/
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mL的酵母悬浮液，使得孢子终浓度为1×10个孢子/mL，酵母终浓度为1×10 细胞/mL。在25℃，200rpm的摇床中培养14h后显微镜下记录孢子萌发数并计算孢子萌发率。
[0082] 2.结果
[0083] 如图4，在体外PDA平板上，0.5％GlcNAc诱导后的酵母使得扩展青霉生长受限，扩展青霉的直径最小。同时0.5％GlcNAc诱导后的酵母也能明显抑制扩展青霉孢子萌发，在原有基础上还能提高抑制率。
[0084] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。