一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法

摘要

本发明涉及细胞培养的技术领域，尤其涉及一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法，利用Daudi细胞膜囊泡活化CIK细胞；本发明采用Daudi细胞膜囊泡活化CIK细胞，降低了滋养细胞培养免疫细胞的潜在致瘤性及EBV病毒感染风险，提高了细胞治疗的安全性。另外，获得的CIK细胞群中含有较多的CD3+CD56+细胞(CIK细胞)，具有较好的临床应用前景。

权利要求

1.一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、获取Daudi细胞膜囊泡；

S2、收集、培养单个核细胞，且培养过程中加入Daudi细胞膜囊泡，至总体积2.5‑5%的自体血浆，终浓度为500‑1000U/ml的IL‑2，终浓度为50ng/ml的IL‑15；所述单个核细胞数与Daudi细胞膜囊泡个数之比为1：1或1:1.9；

S3、细胞收集及继续培养：培养至第7天时，补液并加入Daudi细胞膜囊泡后继续培养1‑

2周；其中，补液至总体积2.5‑5%的自体血浆，终浓度为500‑1000U/ml的IL‑2，终浓度为

50ng/ml的IL‑15。

2.根据权利要求1所述的一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法，其特征在于：所述步骤S1中，通过将Daudi细胞肿胀，破碎、离心的方式收集Daudi细胞膜囊泡。

3.根据权利要求1所述的一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法，其特征在于，所述步骤S2中，包括如下步骤： A1、获取单个核细胞；

 A2、培养单个核细胞：将单个核细胞悬浮于培养基中，调整细胞终浓度后加入Daudi细胞膜囊泡；

A3、补液培养。

4.根据权利要求3所述的一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法，6

其特征在于：所述步骤A2中，细胞终浓度为（1‑3）×10/ml。

5.根据权利要求3所述的一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法，其特征在于：所述步骤A2中，并加入自体血浆，IL‑2和IL‑15，置于37℃，5%CO2，95%湿度下培养。

6.根据权利要求3所述的一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法，其特征在于：所述步骤A3中，待原培养基变黄后再补充新鲜培养基。

7.根据权利要求1所述的一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法，其特征在于：培养时间为2周。

说明书

一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞培养的技术领域，尤其涉及一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法。

背景技术

[0002] 细胞免疫治疗为肿瘤免疫治疗的一种，目的是通过改善患者的免疫系统，以及免疫细胞的直接杀伤作用，达到直接及间接治疗肿瘤的目的。常用于细胞免疫治疗的细胞包括细胞因子诱导的杀伤(cytokine‑induced killer，CIK)细胞、树突状细胞(dendritic cell，DC)、自然杀伤(natural killer，NK)细胞、肿瘤浸润细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)等。其中，CIK细胞是一种经体外诱导培养形成的具有肿瘤细胞杀伤活性的NK样T细胞，其克服了淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine‑activatedkiller，LAK)和肿瘤浸润细胞等细胞增殖能力差、对肿瘤细胞毒性低的缺点，能满足临床治疗的要求。

[0003] CIK细胞是从人体外周血、脐带血或骨髓中提取单个核细胞后，在体外用多种细胞因子(如IFN‑γ及IL‑2)和抗体如抗CD3等诱导后获得的一群异质性细胞，其表面分子特征为共表达CD3和CD56，即CD3和CD56双阳性细胞。CIK细胞的肿瘤杀伤活性，也主要源于这群CD3+CD56+细胞，该双阳性细胞亚群既表现出T细胞强大的抗肿瘤活性，又表现出NK细胞非MHC限制性的抗肿瘤优点。

[0004] Daudi细胞是一种人B细胞淋巴瘤细胞系，EB病毒阳性。目前，已有使用Daudi细胞作为滋养层，培养NK和T细胞的相关应用。但是，Daudi细胞是一种EBV病毒阳性的B细胞淋巴瘤细胞，使用Daudi细胞作为滋养层培养细胞，使用后不但可能增加病毒感染的风险，也具有潜在致瘤性。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种滋养细胞培养免疫细胞的低潜在致瘤性及低EBV病毒感染风险的CIK细胞制备方法。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：提供一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法，利用Daudi细胞膜囊泡活化CIK细胞。

[0007] 优选地，上述方法中包括如下步骤：

[0008] S1、获取Daudi细胞膜囊泡；

[0009] S2、收集、培养单个核细胞，且培养过程中加入Daudi细胞膜囊泡；

[0010] S3、细胞收集及继续培养：培养至第7天时，补液并加入Daudi细胞膜囊泡后继续培养1‑2周。

[0011] 优选地，所述步骤S1中，通过将Daudi细胞肿胀，破碎、离心的方式收集Daudi细胞膜囊泡。

[0012] 优选地，所述步骤S2中，包括如下步骤：

[0013] A1、获取单个核细胞；

[0014] A2、培养单个核细胞：将单个核细胞悬浮于培养基中，调整细胞终浓度后加入Daudi细胞膜囊泡；

[0015] A3、补液培养。

[0016] 优选地，所述单个核细胞数与Daudi细胞膜囊泡个数之比为1：(1‑5)。

[0017] 优选地，所述步骤A2中，细胞终浓度为(1‑3)×106/ml。

[0018] 优选地，所述步骤A2中，并加入2.5‑5％自体血浆，IL‑2和IL‑15，置于37℃，5％CO2，95％湿度下培养。

[0019] 优选地，所述步骤A3中，待原培养基变黄后再补充新鲜培养基。

[0020] 优选地，其特征在于：补液包括2.5‑5％自体血浆，IL‑2和IL‑15。

[0021] 优选地，培养时间为2周。

[0022] 本发明具有如下技术效果：本发明采用Daudi细胞膜囊泡活化CIK细胞，降低了滋养细胞培养免疫细胞的潜在致瘤性及EBV病毒感染风险，其中，利用Daudi细胞膜囊(membrane vesicles)刺激免疫细胞，活化其功能。且在本发明中，裂解后Daudi细胞，在锌离子存在条件下，裂解的细胞膜形成向内或向外的联接，从而形成由单纯细胞膜组成的膜囊，从概率上阐述，即一半的细胞膜囊表面是外膜，一半的细胞膜囊表面是内膜。这种膜囊不同于外泌体、发芽囊泡或凋亡小体，它不含细胞内的成分。因此，本发明中用Daudi细胞膜囊泡刺激CIK细胞活化的方法，避免使用细胞作为滋养层，不包含细胞内成分，从而避免了致瘤性和病毒感染可能性，进而提高了细胞治疗的安全性。另外，获得的CIK细胞群中含有+ +较多的CD3CD56细胞(CIK细胞)，具有较好的临床应用前景。

附图说明

[0023] 为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0024] 图1为本发明中Daudi细胞膜囊泡在显微镜下的示意图。

[0025] 图2.为传统方法培养外周血CIK细胞，2周时细胞形态显微镜下观察(实施例1)。

[0026] 图3.为本发明方法培养外周血CIK细胞，2周时细胞形态显微镜下观察(实施例1)。

[0027] 图4.为传统方法培养CIK细胞2周，收集细胞，流式细胞学检测。来源于实施例1。

[0028] 图5.为本发明方法培养CIK细胞2周，收集细胞，流式细胞学检测。来源于实施例1。

[0029] 图6.为传统方法培养人外周血CIK细胞2周，收集细胞，流式细胞学分析。来源于实施例2。

[0030] 图7.为本发明方法培养CIK细胞2周，收集细胞，流式细胞学分析。来源于实施例2具体实施方式

[0031] 下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0032] 应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。

[0033] 还应当理解，在此本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。

[0034] 还应当进一步理解，在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。

[0035] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

[0036] 因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0037] 应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

[0038] 此外，“大致”、“基本”等用语旨在说明相关内容并不是要求绝对的精确，而是可以有一定的偏差。例如：“大致相等”并不仅仅表示绝对的相等，由于实际生产、操作过程中，难以做到绝对的“相等”，一般都存在一定的偏差。因此，除了绝对相等之外，“大致等于”还包括上述的存在一定偏差的情况。以此为例，其他情况下，除非有特别说明，“大致”、“基本”等用语均为与上述类似的含义。

[0039] 实施例1

[0040] 本实施例公开了：(1)制备Daudi细胞膜囊的方法；(2)一种Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞(CIK细胞)的方法。收集20ml健康人外周血进行培养。

[0041] 材料

[0042] Daudi细胞：为ATCC产品，由中国科学院细胞库提供。

[0043] 细胞外微囊分离试剂：北京科霖恩生物科技有限公司

[0044] 淋巴细胞分离液：天津市灏洋生物制品科技有限责任公司

[0045] 免疫细胞培养基：北京科霖恩生物科技有限公司

[0046] 细胞因子IL‑2：四环药业股份有限公司

[0047] 细胞因子IL‑15：北京科霖恩生物科技有限公司

[0048] 流式单克隆抗体：美国BD公司

[0049] 操作步骤

[0050] 获取Daudi细胞膜囊泡：

[0051] 包括孵育和离心在内的所有步骤均在4℃条件下进行。

[0052] (1)收集Daudi细胞，细胞数大于108个细胞。

[0053] (2)分别用20ml 40mM Tris‑CL悬浮细胞，每隔1‑2钟搅拌，10分钟。离心3000g,10分钟。

[0054] (3)用10ml含1mM ZnSO4的40mM Tris‑CL重悬细胞，孵育10分钟。

[0055] (4)将细胞转移到低温瓶中，液氮快速冷冻3分钟。

[0056] (5)涡旋振荡。将细胞悬液移入15ml离心管中，离心3000g，30分钟。

[0057] (6)取上清。每40ml上清加入细胞外微囊分离试剂10ml，充分混匀。

[0058] (7)置于4℃过夜。

[0059] (8)离心，2000g，30分钟。

[0060] (9)移除液体，再次离心，2000g，5分钟。

[0061] (10)吸除残留液体，加入分别PBS 2ml。粒径和蛋白浓度检测如下表。

[0062] 实施例1。附表1：Daudi细胞计数和膜囊泡粒径、蛋白浓度

[0063]

[0064] 细胞培养及获取

[0065] (1)抽取健康人外周血20ml，肝素抗凝。

[0066] (2)单个核细胞的分离：用Ficoll‑Hypaque淋巴细胞分离液(密度1.077g/ml)，密7
度梯度离心法收集单个核细胞，用生理盐水离心洗涤。计细胞数共1.1×10个，用免疫细胞培养基培养基悬浮细胞。

[0067] (3)血浆处理：取上层血浆共10ml，置于56℃，30分钟。将已经灭活的血浆置于‑20℃，静置5分钟，离心，3000g，30分钟，以去除血浆中的血小板。

[0068] (4)细胞接种、培养：实验分组及接种体系如下表所示，将细胞终浓度调整为1.8×6
10/ml，常规组加入血浆2.5％，γ干扰素2000U/ml；Daudi组加入Daudi细胞膜囊泡(16ug/ml)，相当于Daudi细胞与单个核细胞比例为1.9:1，终浓度分别为血浆2.5％，IL‑2(1000U/ml)，IL‑15(50ng/ml)，总体积分别为1ml，接种于六孔板。将细胞置于37℃，5％CO2，95％湿度下培养。常规组24小时之后，加入IL‑2(1000U/ml)，IL‑15(50ng/ml)，抗人CD3单克隆抗体(500ng/ml)，继续培养。

[0069] (5)补液培养：等培养基变黄后，补充新鲜培养基、2.5％血浆、IL‑2(1000U/ml)、IL‑15(50ng/ml)。

[0070] (6)培养至第7天，Daudi组按比例补加Daudi细胞膜囊泡((16ug/ml)。

[0071] (7)继续培养：之后继续根据细胞的状况每天或隔天补充培养基、2.5％血浆、IL‑2(1000U/ml)、IL‑15(50ng/ml)。

[0072] (8)收获细胞：培养第14天，将CIK细胞离心收集，计数。用Stain Buffer(BD)悬浮部分细胞，用于抗体标记及流式细胞学分析。

[0073] 抗体标记及流式细胞学分析

[0074] 收集培养的细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1.0×106个/ml，加入单克隆抗体标记，分别标记为：(1)同型对照；(2)CD3/CD56，PerCP‑Cy5.5标记的抗人CD3，APC标记的抗人CD56。冰上避光孵育20分钟。洗涤。Stain Buffer悬浮。用流式细胞仪Canto II检测，Diva软件分析结果。

[0075] 实施例2

[0076] 本实施例比较了常规方法与本发明方法，培养人外周血CIK细胞的结果。收集人外周血30ml进行培养。

[0077] 细胞培养及收获

[0078] 1)抽取健康人外周血30ml，肝素抗凝。

[0079] 2)单个核细胞的分离：Ficoll‑Hypaque密度梯度离心法分离并收集单个核细胞，7
计细胞数共3.5×10个，用免疫细胞培养基培养基悬浮细胞。

[0080] 3)血浆处理：取上层血浆共15ml，置于56℃，30分钟。将已经灭活的血浆置于‑20℃，静置5分钟，离心，3000g，30分钟，以去除血浆中的血小板。

[0081] 4)细胞接种、培养：将细胞悬浮于含2.5％自体血浆的扩增培养基中，浓度为3.5×6
10/ml，共10ml。各取5ml接种于两个T25cm2培养瓶中，分别标记为常规培养组和实验组(发明方法组)。

[0082] 常规组加重组人IFN‑γ，终浓度为2000U/ml，置37℃，5％CO2和95％湿度培养24小时后加IL‑2，终浓度为1000U/ml，重组人IL‑15，终浓度为50ng/ml，抗人CD3单克隆抗体(500ng/ml)，继续培养。

[0083] 实验组加Daudi细胞膜囊，蛋白质终浓度为8μg/ml，相当于Daudi细胞与单个核细胞比例为1:1，重组人IL‑2，终浓度为1000U/ml，重组人IL‑15，终浓度为50ng/ml。置37℃，5％CO2和95％湿度培养。

[0084] 5)两组培养72小时后，培养基变黄。各补充新鲜培养基5ml，含2.5％血浆，重组人IL‑2(1000U/ml)和重组人IL‑15(50ng/ml)。继续培养。

[0085] 6)继续培养：之后继续根据细胞的状况每天或隔天补充培养基、2.5％血浆、IL‑2(1000U/ml)、IL‑15(50ng/ml)。

[0086] 7)收获细胞：培养第14天，将CIK细胞离心收集，计数。用StainBuffer(BD)悬浮部分细胞，用于抗体标记及流式细胞学分析。

[0087] 抗体标记及流式细胞学分析

[0088] 收集培养的细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1.0×106个/ml，加入单克隆抗体标记，分别标记为：(1)同型对照；(2)CD3/CD56。PerCP‑Cy5.5标记的抗人CD3，APC标记的抗人CD56。冰上避光孵育20分钟。洗涤。Stain Buffer悬浮。用流式细胞仪Canto II检测，Diva软件分析结果。

[0089] 从实施例1和2可以看出，本发明方法培养的CIK细胞，目标细胞比例较高。本发明的技术特征在于，纯化获取的Daudi细胞膜囊泡可以活化细胞因子诱导杀伤细胞，获得较高+ +比例的CD3 CD56 细胞。Daudi细胞膜囊促进CIK产生的机制尚不清楚，是否与膜囊被单核巨噬细胞吞噬后，后者被活化，从而分泌如IL‑12等细胞因子，间接促进T细胞向CIK分化有关，尚需进一步研究证实。

[0090] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。