一种杂交瘤细胞株5B3、恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种杂交瘤细胞株5B3、恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用，所述的杂交瘤细胞株5B3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2022244。本发明提供的56kDa蛋白单克隆抗体腹水间接ELISA效价为1:1280000，抗体亚类为IgG2aκ，具有稳定分泌抗体的能力，特异性强，制备方法简单，其可以和东方体感染株发生反应，可作为诊断抗体用于免疫学快速检测方法的建立。

权利要求

1.一种分泌恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株5B3，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株5B3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2022244。

2.一种恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述杂交瘤细胞株5B3分泌所得。

3.根据权利要求1所述恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗体通过间接ELISA检测所得到的效价为1:1280000。

4.根据权利要求1所述恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的类型为IgG2aκ。

5.权利要求2～4中任意一项所述恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述杂交瘤细胞株5B3注入动物腹腔中制备腹水，亲和层析柱纯化，即得恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体。

6.权利要求1所述杂交瘤细胞株5B3，或权利要求2～4中任意一项所述恙虫病东方体

56kDa蛋白单克隆抗体在制备用于检测恙虫病东方体产品中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、试纸或试剂。

8.一种用于检测恙虫病东方体的产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1所述杂交瘤细胞株5B3，或权利要求2～4中任意一项所述恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体。

9.根据权利要求8所述产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒、试纸或试剂。

说明书

一种杂交瘤细胞株5B3、恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体

及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及抗体工程技术，具体涉及一种杂交瘤细胞株5B3、恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 恙虫病是由恙虫病东方体(Orientia tsutsμgamushi，Ot)所引起的自然疫源性疾病。恙螨幼虫是恙虫病惟一的传播媒介，恙螨幼虫通过叮咬鼠类等啮齿类动物形成自然界的感染循环。恙虫病东方体跟随恙螨的咬噬而进入人体，先在皮肤叮咬处开始繁衍，再进入血液，最初攻击的是破损部位的髓样细胞，进而攻击血管内皮细胞。之后恙虫病东方体利用宿主细胞上存在的表面蛋白聚糖和菌体表面蛋白将其自身附着到靶细胞上。恙虫病在我国分布极为广泛，受地理地貌、气候、野生动物影响很大，不同菌株和不同地区的恙虫病东方体抗原性和毒力又存在差异，恙虫病的致病机制也尚未完全明确，辅助检查无特异性，导致该病的预防和诊断仍面临较大困难。

[0003] 单克隆抗体是一种通用的结合分子，对其目标具有高度的特异性，是研究、诊断和治疗中不可缺少的工具。1975年，Kohler和Milstein利用免疫小鼠的脾细胞和同源的骨髓瘤细胞进行融合，获得了在生物体外既可以无限增殖，又可以不断产生抗体的杂交瘤细胞，然后再利用有限稀释法，进一步克隆出能够针对单一抗原决定簇具有高度特异性的杂交瘤细胞。由单一杂交瘤细胞分泌出的能够产生高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体叫做单克隆抗体，体外融合细胞的技术被称为杂交瘤技术。该技术问世以来，在生物医学研究的各个领域被迅速应用。由于单克隆抗体具有特异性强，灵敏度高，且无毒性副作用小等优点，其广泛被应用于疾病的早期诊断，环境检测和疾病治疗的领域中。

[0004] 病原体可以准确的被单克隆抗体甄别，可以在疾病早期作出判断。Nitaya Indrawattana等利用基因工程将恙虫病东方体的60kDa GroEL蛋白进行表达纯化，重组蛋白免疫后制得单克隆抗体和多克隆抗体，随后用免疫层析法对发热性疾病患者的新鲜血液进行检测，其正确识别率较高，表明单克隆抗体技术可用于恙虫病早期的现场诊断。

发明内容

[0005] 发明目的：针对现有技术存在的技术问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种分泌恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株5B3。

[0006] 本发明还要解决的技术问题是提供一种恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体。

[0007] 本发明还要解决的技术问题是提供上述恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体的制备方法。

[0008] 本发明还要解决的技术问题是提供上述恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体的应用。

[0009] 本发明还要解决的技术问题是提供一种用于检测恙虫病东方体的产品。

[0010] 为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种分泌恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株5B3，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株5B3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2022244，保藏地址为中国武汉，保藏日期为2022年7月26日。

[0011] 为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了一种恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体，其是由上述杂交瘤细胞株5B3分泌所得。

[0012] 其中，所述抗体通过间接ELISA检测所得到的效价为1:1280000。

[0013] 其中，所述抗体亚类为IgG2aκ。

[0014] 为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体的制备方法，所述制备方法为将上述杂交瘤细胞株5B3注入动物腹腔中制备腹水，亲和层析柱纯化，即得恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体。

[0015] 所述交瘤细胞株5B3是用大肠杆菌表达系统表达的56kDa重组蛋白为抗原，免疫Balb/c小鼠利用杂交瘤技术制备，并以56kDa重组蛋白和56kDa保守区重组蛋白双重筛选获得的；具体地，所述交瘤细胞株5B3制备方法包括以下步骤：

[0016] (1)恙虫病东方体56kDa重组抗原蛋白免疫动物(Balb/c小鼠)；

[0017] (2)通过杂交瘤细胞技术，得到6株单克隆抗体细胞株1B3、2B3、3A2、4A2、5B3、6A3；

[0018] (3)通过恙虫病东方体56kDa保守区蛋白对步骤(2)所得单克隆抗体细胞株进行筛选，得到抗原表位在56kDa保守区的单克隆抗体细胞株5B3，其他5株单抗识别表位不在此区域；

[0019] (4)将单克隆抗体细胞株经亚克隆至抗体分泌稳定后，得到阳性杂交瘤细胞。

[0020] 其中，所述恙虫病东方体56kDa重组抗原蛋白是针对恙虫病东方体56kDa基因序列KM115577.1设计合成所得；具体地，根据Genbank恙虫病东方体56kDa基因序列KM115577.1设计一对引物，用PCR法分别扩增目的基因，通过克隆、转化得到能表达目的蛋白的大肠杆菌BL21，培养诱导后获取菌液纯化目的蛋白，以此作为免疫和筛选抗原。

[0021] 其中，所述恙虫病东方体56kDa保守区蛋白是针对Sj、Pt、Gilliam、karp、kato和young worl六个株型的恙虫病东方体56kDa基因序列设计合成所得；具体地，通过比对常见株型的恙虫病东方体56kDa基因序列，选择一段保守区设计一对引物，用PCR法扩增目的基因，经过克隆、转化后，用同样方法获取目的蛋白，作为筛选抗原。

[0022] 为了解决上述第四个技术问题，本发明公开了上述杂交瘤细胞株5B3或上述恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体在检测恙虫病东方体中的应用。

[0023] 以及述杂交瘤细胞株5B3或上述恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体在制备用于检测恙虫病东方体产品中的应用。

[0024] 其中，所述产品包括但不限于试剂盒、试纸或试剂。

[0025] 为了解决上述第四个技术问题，本发明公开了一种用于检测恙虫病东方体的产品，所述产品含有上述杂交瘤细胞株5B3，或上述恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体。

[0026] 其中，所述产品包括但不限于试剂盒、试纸或试剂。

[0027] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

[0028] 1.本发明提供的56kDa重组蛋白和56kDa保守区重组蛋白制备方法简便可行。

[0029] 2.本发明提供的56kDa蛋白单克隆抗体腹水间接ELISA效价为1:1280000，抗体亚类为IgG2aκ，具有稳定分泌抗体的能力，特异性强，制备方法简单，其可以和东方体感染株发生反应，可作为诊断抗体用于免疫学快速检测方法的建立。

附图说明

[0030] 图1为56kDa重组蛋白和56kDa保守区重组蛋白纯化后SDS‑PAGE示意图：a为恙虫病东方体56kDa保守区蛋白，b为恙虫病东方体56kDa重组抗原蛋白。

[0031] 图2为单克隆抗体纯化后SDS‑PAGE示意图。

[0032] 图3为western‑blot鉴定单克隆抗体特异性示意图：a为PET‑28a(+)转化的BL21，b为32kDa重组蛋白，c为56kDa重组蛋白。

[0033] 图4为Dot‑ELISA验证单抗示意图：1为阳性对照56kDa重组蛋白，2为Pt感染株悬液，3为Sj感染株悬液，4为阴性对照L929细胞悬液。

具体实施方式

[0034] 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0035] 实施例1恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体的制备

[0036] 1.恙虫病东方体56kDa重组抗原蛋白和56kDa保守区蛋白的制备

[0037] 1.1恙虫病东方体56kDa重组抗原蛋白的制备

[0038] 参照Genbank恙虫病东方体56kDa基因序列KM115577.1，选用EcoR I酶和BamH I酶利用双酶切法将目的基因连接构建表达载体PET‑28a(+)，通过热激法将质粒转化到感受态细胞BL21中。挑取单菌落过夜培养(37℃，160rpm)；将菌液转接活化培养4‑5h后，加诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol/L，诱导表达5‑6h。获取目标菌液离心收集沉淀，进行纯化，获得所需恙虫病东方体56kDa重组抗原蛋白，以此作为免疫和筛选抗原。

[0039] 1.2恙虫病东方体56kDa保守区蛋白的制备

[0040] 通过对比Genbank中Sj、Pt、Gilliam、karp、kato和young worl六个株型的恙虫病东方体56kDa基因序列，选择一保守区片段利用Primer Premier 5.0软件自行设计一对引物。上游引物：5’‑AATCCTCAGCTTGATCATG‑3’；下游引物5’‑ATCTTCTTCTTGTTGAGCAG‑3’。在上游引物5’端加入EcoR I酶切位点和同源序列atgggtcgcggatcc，下游引物5’端加入Hind III和同源序列ctcgagtgcggccgc。利用同源重组方法将目的基因连接构建表达载体PET‑28a(+)通过热激法将质粒转化到感受态细胞BL21中。挑取单菌落过夜培养(37℃，160rpm)；
将菌液转接活化培养4‑5h后，加诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/L，16℃160rpm诱导表达
15‑16h，获取目标菌液离心收集沉淀，进行纯化，获得所需恙虫病东方体56kDa保守区蛋白。
其中，恙虫病东方体56kDa重组抗原蛋白和恙虫病东方体56kDa保守区蛋白纯化后SDS‑PAGE示意图如图1所示。

[0041] 2.杂交瘤细胞株的建立

[0042] 2.1小鼠免疫

[0043] 选取6‑8周龄雌性Balb/c小鼠。首次免疫使用弗氏完全佐剂作为乳化剂，免疫剂量为100μg/只，因为注射时蛋白可能会有损耗，因此要加入过量恙虫病东方体56kDa重组抗原蛋白，同时加入与蛋白体积相同的弗氏完全佐剂利用匀浆机进行乳化，乳化后使用注射器在水中滴一滴，液体在一分钟内不散开证明乳化成功，即可用于免疫。总共需要免疫三次，每次间隔15天，且除了第一次免疫皮下多点注射，另外两次都腹腔注射，且另外两次用弗氏不完全佐剂作为乳化剂。三免15天后，注射器直接吸取100μg重组蛋白对小鼠进行腹腔注射。

[0044] 2.2细胞融合

[0045] 免疫小鼠脾细胞的获取：将断颈处死的小鼠置于75％的酒精中浸泡10min，之后将小鼠的四肢用大头钉固定于灭菌的杀鼠板上，用灭菌的手术刀小心切开小鼠的腹腔，注意不要染菌，取出脾脏，用手术刀将上边白色的结缔组织去除，置于无菌培养皿上，用注射器吸取10mL无血清培养基，将针头插入脾脏中，慢慢吹出脾脏中的细胞，尽可能的多吹几次，收集更多的脾细胞，将含有脾细胞的培养基收集到50mL无菌离心管中，最后将脾脏用注射器背面碾碎，加10‑15mL培养基，过40μm筛网孔径细胞筛，收集到50mL离心管中，置CO2培养箱中备用。

[0046] 杂交瘤细胞的形成：取SP2/0细胞与免疫小鼠脾细胞于50mL离心管中，充分混匀，1500rpm离心5min，弃上清。用手掌拍打管底，使SP2/0细胞和脾细胞均匀的铺在管底，在
1.5min内将PEG‑1500匀速加入到混合细胞中，之后在6.5min内逐滴加入37℃预热好的20mL无血清培养基，1300rpm离心5min，弃掉上清，细胞融合，形成杂交瘤细胞。

[0047] HAT培养基培养杂交瘤细胞：将细胞沉淀置于37℃、5％CO2培养箱中5min，使用配好的HAT培养基轻柔的混匀细胞，将细胞悬液铺于96孔细胞培养板，每孔250μL，10天后收集上清液，检测上清液的抗体效价，期间用显微镜观察细胞状态。

[0048] 2.3杂交瘤细胞的筛选

[0049] 第1次筛选：将纯化的56kDa重组蛋白用碳酸缓冲液(pH9.6)稀释至2μg/mL，100μL/孔加入酶标板，4℃包被过夜；次日去除孔内液体，PBST洗涤3次，每次5min；加入用PBST配制的5％脱脂奶粉，200μL/孔，37℃封闭2h；弃去封闭液，PBST洗涤3次，每次5min；将步骤2.2所得细胞上清液、1：100稀释的阳性血清和1：100稀释的阴性血清，均以100μL/孔加入到对应孔内，37℃孵育1h；弃去孔内液体，PBST洗涤3次，每次5min；加入1：2000稀释的山羊抗鼠IgG，100μL/孔加入孔内，37℃孵育1h；弃去孔内液体，PBST洗涤3次，每次5min；100μL/孔加TMB底物溶液，37℃避光反应10min，100μL/孔加入2M H2SO4终止反应；酶标仪450nm测定，P为检测孔的OD值，N为阴性血清OD值，当阴性血清的OD450值≤0.1，阳性血清的OD450值与阴性血清的OD450值的比值≥2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，P/N≥2.1的检测孔判为阳性，1.5≤P/N＜2.1的检测孔判为可疑，P/N小于1.5的检测空孔判为阴性。记录为阳性的孔。

[0050] 第2次筛选：筛选方法同第1次筛选，继续用纯化的56kDa重组蛋白作为筛选抗原。将两次筛选均为阳性的孔记录下来。

[0051] 第3次筛选：在前面两次筛选的基础上，用纯化的56kDa保守区蛋白作为筛选抗原。筛选方法同第1次筛选，将三次检测均为阳性的孔记录下来，作为待克隆孔。

[0052] 前两次筛选中得到了6株56kDa重组蛋白的单克隆抗体细胞株1B3、2B3、3A2、4A2、5B3、6A3，在此基础上，第3次筛选得到了能够识别56kDa保守区蛋白的单克隆抗体细胞株
5B3。此处，通过单抗的制备进行筛选，以免疫抗原56kDa重组蛋白和筛选抗原56kDa保守区重组蛋白进行双重筛选，单抗细胞株5B3上清能与两者均产生特异性反应，说明单克隆抗体细胞株5B3识别表位在56kDa保守区。

[0053] 2.4杂交瘤细胞的克隆

[0054] 将单克隆抗体细胞株5B3用台盼蓝染色法对细胞计数，而后用HT将细胞稀释为1个/100μL，将稀释好的细胞悬液，100μL/孔加到96孔板中，置于37℃的CO2培养箱中培养。将剩余的细胞梯度降温冻存于液氮中。至此，第一次亚克隆完成。细胞培养7‑10天以后，用ELISA筛选阳性克隆孔，选择阳性值高且生长状态良好的细胞用有限稀释法进行二次亚克隆。三次亚克隆方法同二次亚克隆，三次亚克隆以后，抗体分泌稳定。二次亚克隆和三次亚克隆细胞需要梯度降温冻存于液氮中。

[0055] 2.5腹水的制备与纯化

[0056] 选取8‑10周龄的雌性Balb/c小鼠，腹腔注射灭菌的液体石蜡，500μL/只。将筛选出来的阳性杂交瘤细胞用无菌0.01mol/L PBS稀释后注入小鼠腹腔，每只小鼠于注射细胞约l6 6
×10‑5×10个。一周后观察小鼠腹部肿胀情况，直至小鼠腹部肿大、皮肤呈紧绷状态，采集腹水，5000rpm离心10min，取上清。用Protein G亲和层析柱按照说明书对腹水进行纯化(纯化后的单抗5B3浓度为1.81mg/mL)，即得纯化后的恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体；
SDS‑PAGE检测其纯化效果，如图2所示，恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体经纯化后几乎去除所有的杂蛋白，有两条特异性主条带(25kDa和55kDa)，与抗体重链轻链大小相符合。

[0057] 实施例2恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体的鉴定

[0058] 1抗体效价鉴定

[0059] 用间接ELISA法检测纯化腹水效价。纯化腹水按照1:100，1:1000，1:10000，1:20000，1:40000，1:80000，1:160000，1:320000，1:640000，1:1280000比例稀释，每个梯度重复三次，同时设立阴阳性对照，以P/N≥2.1时的最高稀释度为抗体效价。结果显示，5B3细胞株腹水间接ELISA效价为1:1280000。

[0060] 2抗体亚类测定

[0061] 按照Roche公司单抗亚类鉴定试剂盒操作说明书进行，恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体(细胞株5B3)所产生的抗体亚类为IgG2aκ。

[0062] 3分泌抗体稳定性的鉴定

[0063] 将冻存三个月的单克隆抗体细胞株5B3从液氮中取出，扩大培养后取细胞上清，用间接ELISA的方法测定其上清效价，结果表明，经过三个月冻存的细胞依旧可以稳定的分泌抗体，且抗体效价很稳定，表明单克隆抗体细胞株5B3具有稳定分泌抗体的能力。

[0064] 4单抗特异性的鉴定

[0065] Western blot验证：将PET‑28a(+)转化的BL21、纯化的56kDa重组蛋白和56kDa保守区蛋白经过SDS‑PAGE后转印至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭，以实施例1制备的恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体作为一抗，以HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗，DAB显色试剂盒显色。图3结果显示，恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体与PET‑28a(+)转化的BL21无目的带；与56kDa保守区蛋白在分子量约为32kDa处产生特异性条带；与56kDa重组抗原蛋白在分子量约为52kDa处产生特异性条带。说明恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体与pET‑28(+)转化的BL21无反应，与纯化的56kDa重组蛋白和56kDa保守区重组蛋白有特异性反应，即恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体有良好的特异性。

[0066] 5Dot‑ELISA验证

[0067] 将硝酸纤维素(NC)膜裁成1×1cm的方格置于24孔板中，在NC膜的中央分别滴加5μL 56kDa重组蛋白和破碎的Pt感染株悬液，Sj感染株悬液，L929细胞悬液(56kDa重组蛋白为阳性对照，L929细胞悬液为阴性对照)，37℃干燥20min。加入500μL封闭液，37℃振荡封闭1h，结束后用PBST清洗三次，每次5min。将恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体用封闭液稀释1000倍后加入24孔板中，200μL/孔，37℃振荡孵育1h，结束后用PBST清洗。之后将HRP‑山羊抗鼠二抗稀释2000倍后加入24孔板中，200μL/孔，37℃振荡孵育1h，结束后用PBST清洗。
清洗干净后，吸取多余的液体，在NC膜的中央滴加20μL的DAB显色液，避光反应10min。反应结束后，蒸馏水洗3次并吸走多余液体。膜上呈黄褐色斑点即为阳性，反之为阴性。图4结果显示，恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体检测东方体Pt，Sj感染细胞株，NC膜上出现黄褐色斑点，阳性对照出现黄褐色斑点，阴性对照无斑点。

[0068] 本发明提供了一种恙虫病东方体56kDa蛋白单克隆抗体及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。