一种Fmoc-NH-PEGn-丙酸同系物的分离方法

摘要

本发明公开了一种Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物的分离方法，属于医药原料检测技术领域。该方法包括：按以下条件对含Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物的待测样品进行分离：色谱柱：Agilent ZORBAX SB‑C18；流动相：流动相A和B分别为高氯酸‑水溶液和甲醇‑水溶液；洗脱时间及流动相A的体积含量为：0～3min，38～42％；3～12min，38～42％至25～30％；12～30min，25～30％；30～40min，25～30％至0％；40～50min，0％。该方法能使待测样品中的Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物得到有效分离，检测灵敏度好，有利于更好地控制同系物含量和纯度。

权利要求

1.一种Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：按以下高效液相色谱条件对含Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物的待测样品进行分离：色谱条件：采用Agilent ZORBAX SB‑C18作为色谱柱；色谱柱规格为250×4.6mm,5μm，以高氯酸体积百分数为0.1%的高氯酸‑水溶液为流动相A，以甲醇体积百分数为90%的甲醇‑水为流动相B，进行梯度洗脱；

柱温为30℃，检测波长为220nm，流速为1.0mL/min，进样量为10μL；

洗脱程序为：

0 3min，流动相A为40%，流动相B为60%；

~

3 12min，流动相A为40%至28%，流动相B为60%至72%；

~

12 30min，流动相A为28%，流动相B为72%；

~

30 40min，流动相A为28%至0%，流动相B为72%至100%；

~

40 50min，流动相A为0%，流动相B为100%；

~

51 60min，流动相A为0%至40%，流动相B为100%至60%；

~

待测样品的进样浓度为0.5 4mg/mL；

~

待测样品中同时含有Fmoc‑NH‑PEG1‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG2‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG3‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG4‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG5‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG6‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG7‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG8‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG9‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG10‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG11‑丙酸以及Fmoc‑NH‑PEG12‑丙酸中的至少2种。

2.根据权利要求1所述分离方法，其特征在于，待测样品经稀释剂稀释后至预设浓度后再进样。

3.根据权利要求2所述分离方法，其特征在于，所述稀释剂包括乙腈或甲醇。

说明书

一种Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物的分离方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药原料检测技术领域，具体而言，涉及一种Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物的分离方法。

背景技术

[0002] 就Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物(n＝1,2,…,12)而言，该品种常含有同系物杂质，干扰产品纯度和收率，同时对下游产品中的杂质谱产生影响。

[0003] 目前有关上述物质的检测方法主要是依据《中国药典》2020版四部通则，没有对其同系物进行分离检测。

[0004] 但该品种同系物之间极性十分相近，在色谱柱中吸附能力相当，分离难度较大。目前还没有能够使该品种同系物间有效分离，且灵敏度较高的分离方法。

[0005] 鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物的分离方法，以解决上述技术问题。

[0007] 本申请可这样实现：

[0008] 本申请提供一种Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物的分离方法，包括以下步骤：

[0009] 按以下高效液相色谱条件对含Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物的待测样品进行分离：

[0010] 色谱柱：Agilent ZORBAX SB‑C18；

[0011] 流动相：流动相A为高氯酸‑水溶液，流动相B为甲醇‑水溶液；其中，高氯酸‑水溶液中高氯酸的体积百分数为0.05～0.15％，甲醇‑水溶液中甲醇的体积百分数为88～92％；

[0012] 洗脱程序为：洗脱时间及洗脱时间内流动相A的体积含量如下：0～3min，38～42％；3～12min，38～42％至25～30％；12～30min，25～30％；30～40min，25～30％至0％；
40～50min，0％。

[0013] 在可选的实施方式中，洗脱程序还包括：洗脱时间及洗脱时间内流动相A的体积含量如下：50～60min，0％至38～42％。

[0014] 在可选的实施方式中，分离过程中，洗脱流速为0.8～1.2mL/min。

[0015] 在可选的实施方式中，分离过程中，柱温为25～40℃。

[0016] 在可选的实施方式中，分离过程中，检测波长为210～230nm。

[0017] 在可选的实施方式中，分离过程中，进样量为5～20μL。

[0018] 在可选的实施方式中，分离过程中，待测样品的进样浓度为0.5～4mg/mL。

[0019] 在可选的实施方式中，待测样品经稀释剂稀释后至预设浓度后再进样。

[0020] 在可选的实施方式中，稀释剂包括乙腈或甲醇。

[0021] 在可选的实施方式中，待测样品中同时含有Fmoc‑NH‑PEG1‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG2‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG3‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG4‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG5‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG6‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG7‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG8‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG9‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG10‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG11‑丙酸以及Fmoc‑NH‑PEG12‑丙酸中的至少2种。

[0022] 本申请的有益效果包括：

[0023] 本申请提供的分离方法，通过使用特定的色谱柱、流动相和洗脱程序，能够使Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物(n＝1至12)间分离度达到1.0以上，实现各同系物的完全分离，具有良好的专属性，便于判断产品中含有同系物杂质类型。检测过程对应的色谱峰峰形对称，无明显拖尾。并且，该方法操作简便，耗时短，成本低，能够在较短时间内检测出样品中上述同系物杂质的情况，为产品生产工艺控制同系物杂质提供数据依据，有利于控制产品质量。

附图说明

[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

[0025] 图1为本申请实施例1中杂质混合溶液的色谱图；

[0026] 图2为本申请对比例1中杂质混合溶液的色谱图；

[0027] 图3为本申请对比例2中供试品溶液的色谱图；

[0028] 图4为本申请对比例3中杂质混合溶液的色谱图；

[0029] 图5为本申请对比例4中杂质混合溶液的色谱图；

[0030] 图6为本申请对比例5中杂质混合溶液的色谱图；

[0031] 图7为本申请对比例6中杂质混合溶液的色谱图。

具体实施方式

[0032] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0033] 下面对本申请提供的Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物的分离方法进行具体说明。

[0034] 本申请提出Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物的分离方法，待测样品中含有Fmoc‑NH‑PEG1‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG2‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG3‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG4‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG5‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG6‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG7‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG8‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG9‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG10‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG11‑丙酸以及Fmoc‑NH‑PEG12‑丙酸中的至少2种。

[0035] 也即，无论待测样品中含有2种、3种、4种或更多种上述Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物，本申请提供的方法均可对待测样品中含有的所有Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物进行有效分离。

[0036] 具体的，本申请提供的分离方法包括以下步骤：

[0037] 按以下高效液相色谱条件对含Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物的待测样品进行分离：

[0038] 色谱柱：Agilent ZORBAX SB‑C18；

[0039] 流动相：流动相A为高氯酸‑水溶液，流动相B为甲醇‑水溶液；其中，高氯酸‑水溶液中高氯酸的体积百分数为0.05～0.15％，甲醇‑水溶液中甲醇的体积百分数为88～92％；

[0040] 洗脱程序为：洗脱时间及洗脱时间内流动相A的体积含量如下：0～3min，38～42％；3～12min，38～42％至25～30％；12～30min，25～30％；30～40min，25～30％至0％；
40～50min，0％。

[0041] 在一些优选的实施方式中，洗脱程序为：洗脱时间及洗脱时间内流动相A的体积含量如下：0～3min，40％；3～12min，40％至28％；12～30min，28％；30～40min，28％至0％；40～50min，0％。

[0042] 相应地，洗脱时间及洗脱时间内流动相B的体积含量如下：0～3min，60％；3～12min，60％至72％；12～30min，72％；30～40min，72％至100％；40～50min，100％。

[0043] 进一步地，上述洗脱程序还包括：洗脱时间及洗脱时间内流动相A的体积含量如下：50～60min，0％至38～42％。

[0044] 通过在50～60min进行上述洗脱，可确保上一次进样所残留的物质被冲洗干净，避免对下次进样分离造成不利影响。

[0045] 本申请分离过程中，洗脱流速例如可设置为0.8～1.2mL/min，如0.8mL/min、0.9mL/min、1mL/min、1.1mL/min或1.2mL/min等，也可以为0.8～1.2mL/min范围内的其它任意值。优选为1mL/min。

[0046] 柱温例如可设置为25～40℃，如25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃或40℃等，也可以为25～40℃范围内的其它任意值。

[0047] 检测波长例如可设置为210～230nm，如210nm、215nm、220nm、225nm或230nm等，也可以为210～230nm范围内的其它任意值。

[0048] 进样量例如可以为5～20μL，如5μL、10μL、15μL或20μL等，也可以为5～20μL范围内的其它任意值。

[0049] 相应地，待测样品的进样浓度可设置为0.5～4mg/mL，如0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL或4mg/mL等，也可以为0.5～4mg/mL范围内的其它任意值。

[0050] 作为参考地，上述进样浓度可由待测样品经稀释剂稀释而得。

[0051] 其中，稀释剂可采用乙腈或甲醇，以获得良好的分离效果，避免出现峰拖尾等现象。

[0052] 通过采用上述方法进行分离，Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物间分离度可达到1.0以上，具有良好的专属性，便于判断产品中含有同系物杂质类型。并且，该方法耗时短，成本低，能够在较短时间内检测出样品中同系物杂质的情况，为产品生产工艺控制同系物杂质提供数据依据，以便控制产品质量。

[0053] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0054] 实施例1

[0055] 本实施例提供一种含Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物的待测样品进行分离。

[0056] 待测样品为Fmoc‑NH‑PEG12‑丙酸，其由本公司自行提供。进样前，用乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中约含2.5mg的溶液，得到供试品溶液。

[0057] 在此基础上，配制杂质混合溶液作为内标。

[0058] 杂质混合溶液的配制方法如下：分别取Fmoc‑NH‑PEG1‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG2‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG3‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG4‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG5‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG6‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG7‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG8‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG9‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG10‑丙酸和Fmoc‑NH‑PEG11‑丙酸适量作为杂质，用乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中各杂质分别约含2.5mg的混合贮备液；取Fmoc‑NH‑PEG12‑丙酸25mg，置10mL量瓶中，加入1mL混合贮备液，用乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，得杂质混合溶液。

[0059] 色谱条件：采用Agilent ZORBAX SB‑C18(250*4.6mm,5μm)作为色谱柱，以高氯酸体积百分数为0.1vt％的高氯酸‑水溶液为流动相A，以己醇体积百分数为90vt％的甲醇‑水为流动相B，进行梯度洗脱。柱温为30℃，检测波长为220nm，流速为1.0mL/min，进样量为10μL。

[0060] 洗脱程序为：

[0061] 0～3min，流动相A为40vt％，流动相B为60vt％；

[0062] 3～12min，流动相A为40vt％至28vt％，流动相B为60vt％至72vt％；

[0063] 12～30min，流动相A为28vt％，流动相B为72vt％；

[0064] 30～40min，流动相A为28vt％至0vt％，流动相B为72vt％至100vt％；

[0065] 40～50min，流动相A为0vt％，流动相B为100vt％；

[0066] 51～60min，流动相A为0vt％至40vt％，流动相B为100vt％至60vt％。

[0067] 检测：分别取乙腈(空白溶液)、杂质混合溶液、供试品溶液各10μL，分别注入色谱系统，记录色谱图，其中杂质混合溶液的色谱图如图1所示。各杂质含量和主峰纯度按面积归一化法计算，计算结果如表1所示，编号1至12分别代表Fmoc‑NH‑PEG1‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG2‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG3‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG4‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG5‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG6‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG7‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG8‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG9‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG10‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG11‑丙酸和Fmoc‑NH‑PEG12‑丙酸。

[0068] 系统适用性要求：以杂质混合溶液考查系统适用性，各同系物杂质间分离度不得小于1.0(适应样品需求)。

[0069] 表1计算结果

[0070]

[0071] 由图1和表1可以看出：该方法下同系物杂质间分离度均大于1.0，且峰型较好，说明本申请提供的方法能够将上述各同系物有效分离开。

[0072] 对比例1

[0073] 以实施例1的杂质混合溶液为例，本对比例将检测波长改变为200nm，其余检测条件不变。所得的色谱图如图2所示。

[0074] 由图2可以看出，降低波长为200nm，基线噪音较大，掩盖部分杂质，该波长并不适宜本申请中各同系物的分离。

[0075] 对比例2

[0076] 以实施例1的杂质混合溶液为例，本对比例将流速改变为0.8mL/min，其余检测条件不变。所得的色谱图如图3所示。

[0077] 由图3可以看出，减小流速后，主峰变宽，峰略拖尾，相邻杂质峰间分离度减小，该流速并不适宜本申请中各同系物的分离。

[0078] 对比例3

[0079] 以实施例1的杂质混合溶液为例，本对比例将洗脱程序改变成表2所示。杂质混合溶液配制方法如下：分别取杂质Fmoc‑NH‑PEG1‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG2‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG3‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG4‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG5‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG6‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG7‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG8‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG9‑丙酸、Fmoc‑NH‑PEG10‑丙酸和Fmoc‑NH‑PEG11‑丙酸适量，用乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中各杂质分别约含0.2mg的混合溶液。其余检测条件不变。所得的色谱图如图4所示。

[0080] 表2洗脱程序

[0081]时间(min) 流动相A(vt％) 流动相B(vt％)
0 45 55
40 45 55
50 10 90
60 10 90
61 45 55
70 45 55

[0082] 由图4可以看出：杂质个数与配制的溶液不一致，说明有部分杂质并未得到有效分离，也即该洗脱程序并不适宜本申请中各同系物的分离。

[0083] 对比例4

[0084] 以实施例1的杂质混合溶液为例，本对比例将杂质混合溶液中，各同系物间的浓度均配制成0.001mg/mL。

[0085] 色谱条件：采用Agilent ZORBAX SB‑C18(250*4.6mm,5μm)作为色谱柱，以0.1vt％三氟乙酸为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。

[0086] 柱温为35℃，检测波长为220nm，流速为1.0mL/min，进样量为10μL。

[0087] 洗脱程序：

[0088] 0min时，流动相A为75vt％，流动相B为25vt％；

[0089] 35～45min，流动相A为10vt％，流动相B为90vt％；

[0090] 46～50min，流动相A为75vt％，流动相B为25vt％。

[0091] 所得的色谱图如图5所示。

[0092] 由图5可以看出，该方法基线不平，且各杂质间未完全分离，说明上述条件并不适宜本申请中各同系物的分离。

[0093] 对比例5

[0094] 以实施例1的杂质混合溶液为例，本对比例将杂质混合溶液中，各同系物间的浓度均配制成0.01mg/mL。

[0095] 色谱条件：采用Agilent ZORBAX SB‑C18(250*4.6mm,5μm)作为色谱柱，以0.1vt％三氟乙酸为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。

[0096] 柱温为35℃，检测波长为220nm，流速为1.0mL/min，进样量为10μL。

[0097] 洗脱程序为：

[0098] 0min时，流动相A为25vt％，流动相B为75vt％；

[0099] 15min时，流动相A为30vt％，流动相B为70vt％；

[0100] 30min，流动相A为20vt％，流动相B为80vt％；

[0101] 40～45min，流动相A为10vt％，流动相B为90vt％；

[0102] 46～50min，流动相A为25vt％，流动相B为75vt％。

[0103] 所得的色谱图如图6所示。

[0104] 由图6可以看出，该方法基线不平，且各杂质间未完全分离，说明上述条件并不适宜本申请中各同系物的分离。

[0105] 对比例6

[0106] 以实施例1的杂质混合溶液为例，本对比例将杂质混合溶液中，各同系物间的浓度均配制成0.01mg/mL。

[0107] 色谱条件：采用中谱红(250*4.6mm,5μm)作为色谱柱，以0.1vt％高氯酸为流动相A，以甲醇‑水(体积比为95:5)为流动相B，进行梯度洗脱。

[0108] 柱温为30℃，检测波长为220nm，流速为1.0mL/min，进样量为10μL。

[0109] 洗脱程序为：

[0110] 0～40min，流动相A为45vt％，流动相B为55vt％；

[0111] 50～60min，流动相A为10vt％，流动相B为90vt％；

[0112] 61～70min，流动相A为45vt％，流动相B为55vt％。

[0113] 所得的色谱图如图7所示。

[0114] 由图7可以看出，该方法下基线相对较平，各杂质间有分离趋势但仍未完全分离，说明上述条件也不适宜本申请中各同系物的分离。

[0115] 综上，本申请提供的分离方法，能够使Fmoc‑NH‑PEGn‑丙酸同系物间分离度可达到1.0以上，具有良好的专属性，便于判断产品中含有同系物杂质类型。并且，该方法耗时短，成本低，能够在较短时间内检测出样品中同系物杂质的情况，为产品生产工艺控制同系物杂质提供数据依据，以便控制产品质量。

[0116] 以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。