Fmoc-氨基酸中残留柠檬酸的高效液相色谱测定方法

摘要

本发明公开了Fmoc‑氨基酸中残留柠檬酸的高效液相色谱测定方法，主要解决现有利用高效液相色谱方法存在的样品需要前处理以及环节复杂，耗时长的技术问题。本发明测定方法包括以下步骤：一，准备测量的试剂，二，样品的前处理；三，进行高效液相色谱测定，其中液相色谱测定的过程中采用DAD紫外检测器，通过高效液相色谱水相中添加KH2PO4缓冲溶液，能很好保证样品不受酸性条件下分解干扰；本发明实现了待测样品不受干扰的同步检测，为氨基酸系列中残留柠檬酸检测领域提供了可靠便捷的检测手段。

权利要求

1.Fmoc‑氨基酸中残留柠檬酸的高效液相色谱测定方法，其特征是：包括以下步骤： 步骤一，准备测量的试剂：测量的试剂包括乙腈‑色谱纯，超纯水，分析纯磷酸二氢钾； 步骤二、样品溶液的配制，称取试样置于容量瓶中，加入乙腈，室温条件下采用超声波溶解，再加超纯水定容 ，最后试样用聚丙烯有机滤膜过滤后进行高效液相色谱分析； 步骤三，进行高效液相色谱测定：色谱条件为样品室温度为常温，自动进样器；色谱仪为Agilent 1260 液相色谱仪，该色谱仪采用DAD为检测器；色谱柱为：Agilent ZORBAX SB phenyl C18色谱柱，尺寸为4.6mm ×250mm, 5.0μm，柱温：30 ℃，流速：1.0 mL/min；流动相为10mmol/LKH2PO4水溶液（A）和纯乙腈（B），采用梯度洗脱程序：0～20min，流动相B比例为40%到60%， 20.0～

20.1 min，流动相B比例从60% 到40% 的初始比例，20.1～25 min，流动相B比例从40% 平衡系统；通过对流动相水相比例控制，不使非天然氨基酸在色谱柱中析出；柠檬酸的保留时间为2.0 min。

说明书

Fmoc‑氨基酸中残留柠檬酸的高效液相色谱测定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种氨基酸的高效液相色谱测定方法，特别涉及一种Fmoc‑氨基酸中残留柠檬酸的高效液相色谱测定方法。

背景技术

[0002] 常规柠檬酸含量测定，需要用到可见分光光度计，利用柠檬酸能够在酸性条件下将Cr6+还原为Cr3+，并生成柠檬酸铬螯合物，产物在545 nm处具有特征吸收峰，通过吸光值的变化即可定量检测柠檬酸的含量。操作比较麻烦；也有高效液相色谱方法中需要样品进行前处理，比如样品溶解于乙酸乙酯；先超声处理30 min； 静置过夜，加乙酸乙酯定容；再过滤，取25 mL滤液蒸干；加甲酸溶解，定容至10 mL，之后用HPLC检测。对HPLC检测需要有一定合成经验的人才能做，环节复杂，耗时也长，对整个检测出报告周期较长，比较麻烦。

[0003] 国标法是利用酚酞指示剂的pH变色范围，用1N当量的氢氧化钠标准溶液来进行酸碱滴定检测，通过计算得到柠檬酸的含量，这个方法对纯柠檬酸产品检测比较方便，对残留在0.5%以下的柠檬酸检测，最后的结果误差大，不容易操作等等。

发明内容

[0004] 本发明提供了一种氨基酸中残留柠檬酸的高效液相色谱测定方法，主要解决现有利用高效液相色谱方法存在的样品需要前处理以及环节复杂，耗时长的技术问题。本发明可用于氨基酸中残留柠檬酸含量的定性分析和定量测定，它不但简单、准确、可靠，而且是可以在短时间内分析氨基酸中残留柠檬酸的高液相色谱效分析方法。

[0005] 本发明采用了以下技术方案：氨基酸中残留柠檬酸的高效液相色谱测定方法，它包括以下步骤：

[0006] 步骤一，准备测量的试剂，测量的试剂包括乙腈‑色谱纯，超纯水，化学试剂磷酸二氢钾，分析纯磷酸二氢钾。

[0007] 步骤二：样品溶液的配制，称取试样约0.10g，精确至0.0001 g，置于10 mL容量瓶中，加入5 mL乙腈，室温条件下采用超声波溶解3 min，再用水定容至10 mL，最后试样用0.22 µm聚丙烯有机滤膜过滤后进行HPLC分析，当样品中氨基酸溶解不透明时，再用乙腈溶解至透明,最后可以折算重量计算。

[0008] 标准溶液的配制：准确称取柠檬酸的标准品0.010 g（精确至0.00001 g），用5ml纯水溶解，并用乙腈稀释至10 mL容量瓶中并定容，摇匀，配制成1000 mg/L的标准储备溶液，于25℃密封保存。

[0009] 步骤三，进行高效液相色谱测定；色谱测定的的过程为：色谱条件为样品室温度为常温，自动进样器进样体积为10 µL，色谱柱为：Agilent ZORBAX SB phenyl C18 (4.6mm ×250mm, 5.0μm)，柱温：30 ℃，流速：1.0 mL/min，流动相为10mmolKH2PO4水溶液（A）和纯乙腈（B）采用梯度洗脱程序，0～20min，V(B)为40%到60%， 20.0～20.1 min，V(B)从60% 到40% 的初始比例，20.1～25 min，V(B)从40% 平衡系统；通过对流动相水相比例控制带Fmoc保护的非天然氨基酸在色谱柱中不析出；即保留时间为2.0 min的色谱峰采集到了柠檬酸的主成份。

[0010] 所述的液相色谱测定时采用的色谱仪为安捷伦 1260色谱仪，该色谱仪采用DAD检测器。

[0011] 本发明具有以下有益效果：本发明测定氨基酸中残留柠檬酸的高效液相色谱法，该方法操作简便、快速、准确，灵敏度高（可以准确测定氨基酸中残留0.01%柠檬酸）、稳定性好，适用于本发明测定一种带Fmoc保护的非天然氨基酸中残留柠檬酸的高效液相色谱法，该方法操作简便、快速、准确，稳定性好，适用于一种带Fmoc保护的非天然氨基酸中残留柠檬酸的定性分析和定量检测，本发明在硅胶吸附时回收率就达到最大值，回收效果最好。本发明采用了高效液相色谱仪的自动进样器的精准定量，利用DAD二极管列阵的灵敏度可以对0.1mg/ml的柠檬酸有很好的响应值，最低检测到氨基酸中残留柠檬酸0.01%的浓度的精准定量；同时利用KH2PO4缓冲溶液使柠檬酸水中不被解离，使柠檬酸峰型对称，本发明的样品室温度设定为常温，有利于样品室温的保存，又和柱温箱的温度接近，有利于整个液相体系的平稳运行。

附图说明

[0012] 图1为本发明柠檬酸标准品色谱图。

[0013] 图2为本发明氨基酸中残留柠檬酸的色谱图。

[0014] 图3为本发明柠檬酸的线性范围、线性方程、相关系数图。

具体实施方式

[0015] 下面通过实施例进一步说明本发明的测定过程。

[0016] 实验部分主要仪器：

[0017] 安捷伦1260型高效液相色谱仪，配有DAD检测器，Agilent ZORBAX SB phenyl C18色谱柱，安捷伦 ZORBAX SB phenyl C18色谱柱的尺寸为（4.6mm ×250mm, 5.0μm)；超声波提取仪(KQ5200E，郑州科泰实验设备有限公司)，0.22 μm聚丙烯有机滤膜（上海安谱科学仪器有限公司），电子分析天平（CPA225D，赛多利斯科学仪器（上海）有限公司）。

[0018] 测量的试剂包括：试剂级磷酸二氢钾，超纯水；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）， 磷酸二氢钾(分析纯，上海国药公司)；超纯水( 电阻率18.2 MΩ.cm，美国屈层氏)。

[0019] 标准溶液的配制：准确称取柠檬酸的标准品0.010 g（精确至0.00001 g），用5ml纯水溶解，并用乙腈稀释至10 mL容量瓶中并定容，摇匀，配制成1000 mg/L的标准储备溶液，于25℃密封保存。

[0020] 样品的前处理：称取氨基酸试样约0.1g（精确至0.0001 g），置于10 mL容量瓶中，加入5 mL乙腈，室温条件下超声波溶解3 min，用纯水定容至100 mL。最后试样用0.22 µm聚丙烯有机滤膜过滤后进行HPLC分析。

[0021] 分析色谱条件：样品室温度为25 ℃，自动进样器进样体积为10 µL，色谱柱为：安捷伦 ZORBAX SB phenyl C18色谱柱的尺寸为4.6mm ×250mm, 5.0μm，柱温：30 ℃，流速：1.0mL/min，流动相为10mmolKH2PO4缓冲液水溶液（A）和纯乙腈（B）；采用梯度洗脱程序，0～
20min， V(B)从40%到60%，20.0～20.1 min，V(B)从60% 到40% 的初始比例，20.1～25 min，V(B)从40% 平衡系统；标准品的色谱见图1，实际样品的色谱图附图2。通过峰面积对比进行定量，即保留时间为2.0 min的色谱峰。

[0022] 样品前处理方法的选择与优化：目前在市场上的氨基酸种类繁多，一般带Fmoc的非天然氨基酸为固体晶型，本发明所测定的氨基酸是上海吉奉生物科技有限公司生产的（Fmoc‑D‑Cys(Trt)‑OH ），在Fmoc‑D‑Cys(Trt)‑OH生产过程中用到柠檬酸主要用来调节酸度，根据柠檬酸在水中的易容原理，对氨基酸中残留的柠檬酸的实际情况，本发明进行了试验，通过试验实践得到只要在10ml的容量瓶中有5ml的水就可以把0.1g的带Fmoc的非天然氨基酸中残留在1.0%以下的柠檬酸可以完全溶解。

[0023] 仪器条件的优化：色谱条件的优化

[0024] 本发明在选择时分别对水‑乙腈、10mmolKH2PO4缓冲液水溶液‑乙腈作为流动相时的分离效果进行了比较。采用水‑乙腈体系时发现，色谱峰形不对称，容易拖尾；采用10mmolKH2PO4‑乙腈体系时柠檬酸的峰型对称度达到标准，无论是分离度、灵敏度还是目标化合物的峰型都优于其他淋洗体系。故本实验采用10mmolKH2PO4缓冲液水溶液（A相）‑ 纯乙腈（B相）作为淋洗液，梯度淋洗进行色谱分离。

[0025] 本发明在选择色谱柱时还比较了WatersPuresil C18 (4.6mm×150mm, 5.0 μm)色谱柱和Agilent ZORBAX SB phenyl‑C18 （4.6 mm×150 mm, 4.0 μm) 与 Agilent ZORBAX SB phenyl C18 （4.6mm ×250mm, 5.0μm），实验结果表明前两种色谱柱也能使峰分离，但是半峰宽较大，而Agilent ZORBAX SB phenyl C18 （4.6mm ×250mm, 5.0μm）色谱柱能够使柠檬酸的主峰与杂质完全分离、峰对称且峰较窄，可降低目标化合物的检测限。故本发明采用Agilent ZORBAX SB phenyl C18 （4.6mm ×250mm, 5.0μm）色谱柱。

[0026] 本发明的样品室温度设定为室温，有利于样品室中乙腈溶剂的保存，本发明中设定柱温箱温度为30℃。

[0027] 线性范围：采用不含柠檬酸的50%体积水+50%体积乙腈为空白基质，添加不同体积的浓度标准溶液配成200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L按照上述色谱条件进行测定，以组分的质量浓度（x，µg/L）为横坐标，相应的质谱峰峰面积（y）为纵坐标得标准曲线。结果表明：柠檬酸在一定范围内线性关系良好。见图3。

[0028] 精密度和回收率：为对本发明的精密度和回收率进行比较，选择柠檬酸回收，24小时内，按照上述方法进行测定，每个浓度水平单独测定2次，回收率及相对标准偏差列于下表。由下表可知，柠檬酸回收率97.8%‑98.8%，相对标准偏差0.2～0.3%，说明该方法对柠檬酸有较好的回收率及重复性，能满足实际样品的分析要求。

[0029]

[0030] 实际样品的测定：采用本方法对带Fmoc的非天然氨基酸中残留柠檬酸样品进行检测结果表明，本方法快速、准确、灵敏度高、选择性好，检测周期短，具有实际应用价值。

[0031] 本发明建立了一种测定氨基酸中残留柠檬酸的高效液相色谱法。该方法操作简便、快速、准确，稳定性好，适用于氨基酸中残留柠檬酸的定性分析和定量检测。为氨基酸中残留柠檬酸检测提供一种新的方法，具有一定的现实意义。