生产L-苏式-3-羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用

摘要

生产L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。为了解决利用现有酶法或全细胞催化法生产L‑THA需要外加昂贵底物导致生产成本高的问题，本发明提供了一种低成本且可高效生产L‑THA的基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主菌，沉默表达天冬氨酸激酶III基因lysC，并过表达天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB、天冬酰胺加氧酶基因asnO和天冬氨酸氨解酶基因aspA。利用该基因工程菌，以葡萄糖为碳源进行发酵就可以达到高效生产L‑THA的目的，对于实现L‑THA的低成本绿色合成具有重要意义。

权利要求

1.生产L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为沉默表达天冬氨酸激酶III基因lysC，并过表达天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB、天冬酰胺加氧酶基因asnO和天冬氨酸氨解酶基因aspA的大肠杆菌；所述天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB、天冬氨酸氨解酶基因aspA和天冬氨酸激酶III基因lysC均来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，所述天冬氨酸转氨酶基因aspC的Gene ID为945553，天冬酰胺合成酶基因asnB的Gene ID为945281，天冬氨酸氨解酶基因aspA的Gene ID为948658，天冬氨酸激酶III基因lysC的Gene ID为948531；所述天冬酰胺加氧酶基因asnO来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，以pET28a(+)质粒表达天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB和天冬酰胺加氧酶基因asnO；以pACYCDuet‑1质粒表达天冬氨酸氨解酶基因aspA。

3.一种微生物发酵法转化生产L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸的方法，其特征在于，以葡萄糖为底物，利用权利要求1或2任意一项所述的基因工程菌发酵生产L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法为将所述基因工程菌接种于种子培养基，经培养后获得种子液，再将种子液接种于发酵培养基，经诱导后，获得发酵液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为液体LB培养基，所述种子培养的条件为35℃～37℃，200rpm～250rpm，摇瓶培养10h～14h。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为M9培养基，种子液的接种量为1％～2％(v/v)。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵液的具体制备方法为接入种子液后于35℃～37℃的条件下，培养至OD600为0.6～0.8，然后加入0.2mM IPTG，28℃～32℃诱导

3h～4h，再加入终浓度为1mM的L‑谷氨酰胺，0.5mM FeSO4·7H2O和1mM抗坏血酸，于28℃～32℃、150rpm～200rpm的条件下继续培养20h～28h，结束发酵过程。

8.权利要求1或2任意一项所述的基因工程菌或权利要求3‑7任意一项所述的方法在生产L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸中的应用。

说明书

生产L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及生产L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸的基因工程菌及其应用。

背景技术

[0002] L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸(L‑threo‑3‑hydroxyaspartic acid，L‑THA)作为羟基氨基酸的一种，其合成方法和生物学特性受到研究者的关注。L‑THA可以作为抗各种微生物的抗菌剂，作为谷氨酸转运蛋白的抑制剂，也是聚甲基丙烯酰胺聚合物的官能部分。L‑THA由于其广泛的临床和材料用途，对化学家和生物学家很有吸引力。目前L‑THA的合成主要依赖于化学方法，然而这些方法合成L‑THA会伴随着立体异构体的生成，例如D‑THA，因此往往需要复杂的纯化工艺才能获得L‑THA。与化学合成相反，生物酶具有出色的化学区域和立体选择性，使得生物酶催化成为手性化合物合成领域的研究热点和有效途径。

[0003] 目前利用微生物代谢工程技术或酶工程技术合成L‑THA的方法较少，主要集中在两个酶催化转化途径：一是利用天冬酰胺加氧酶突变体(AsnO‑D241N)或其同源酶(SCO2693‑D246N)用于L‑天冬氨酸的直接羟基化(如专利US20100184189A1和公开于2008年9月题为Non‑Heme Hydroxylase Engineering For Simple Enzymatic Synthesis of l‑threo‑Hydroxyaspartic Acid记载)；二是构建了过表达野生型天冬酰胺加氧酶AsnO或SCO2693，并敲除天冬酰胺酶I的基因工程菌，以L‑天冬酰胺为底物合成L‑苏式‑3‑羟基天冬酰胺，然后通过天冬酰胺酶II水解得到L‑THA，实现了L‑THA的生物合成途径(如公开于2005年6月题为One‑Pot Production of L‑threo‑3‑Hydroxyaspartic  Acid Using Asparaginase‑Deficient Escherichia coli Expressing Asparagine Hydroxylase of Streptomyces coelicolor A3(2)的文章记载)。以上所述方法采用酶或全细胞催化法实现L‑THA的生物合成，但由于产量较低并且其反应体系需要外加底物L‑天冬酰胺和共底物α‑酮戊二酸等，导致生产成本很高，难以用于工业生产。

[0004] 综上，找到一种产率高、成本低适用于工业生产的L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸的生产方法变得尤为重要。

发明内容

[0005] 针对利用现有酶法或全细胞催化法生产L‑THA存在的产量低且需要外加昂贵底物导致生产成本高的问题，本发明提供了一种以葡萄糖为底物，能够高效生产L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸的基因工程菌，所述基因工程菌为沉默表达天冬氨酸激酶III基因lysC，并过表达天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB、天冬酰胺加氧酶基因asnO和天冬氨酸氨解酶基因aspA的大肠杆菌。

[0006] 在本发明的一个实施方式中，天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB、天冬氨酸氨解酶基因aspA和天冬氨酸激酶III基因lysC均来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，天冬氨酸转氨酶基因aspC的Gene ID为945553，天冬酰胺合成酶基因asnB的Gene ID为945281，天冬氨酸氨解酶基因aspA的Gene ID为948658，天冬氨酸激酶III基因lysC的Gene ID为948531。

[0007] 在本发明的一个实施方式中，天冬酰胺加氧酶基因asnO来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0008] 在本发明的一个实施方式中，以pET28a(+)质粒表达天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB和天冬酰胺加氧酶基因asnO；以pACYCDuet‑1质粒表达天冬氨酸氨解酶基因aspA。

[0009] 本发明还提供了一种微生物发酵法转化生产L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸的方法，该方法以葡萄糖为底物，利用上述的基因工程菌发酵生产L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸。

[0010] 在本发明的一个实施方式中，所述方法为将所述基因工程菌接种于种子培养基，经培养后获得种子液，再将种子液接种于发酵培养基，经诱导后，获得发酵液。

[0011] 在本发明的一个实施方式中，种子培养基为液体LB培养基，种子培养的条件为35℃～37℃，200rpm～250rpm，摇瓶培养10h～14h。

[0012] 在本发明的一个实施方式中，发酵培养基为M9培养基，种子液的接种量为1％～2％(v/v)。

[0013] 在本发明的一个实施方式中，发酵液的具体制备方法为接入种子液后于35℃～37℃的条件下，培养至OD600为0.6～0.8，然后加入0.2mM IPTG，28℃～32℃诱导3h～4h，再加入终浓度为1mM的L‑谷氨酰胺，0.5mM FeSO4·7H2O和1mM抗坏血酸，于28℃～32℃、150rpm～200rpm的条件下继续培养20h～28h，结束发酵过程。

[0014] 本发明还提供了上述基因工程菌或上述微生物发酵法转化生产L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸的方法在生产L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸中的应用。

[0015] 本发明的有益效果：

[0016] 本发明利用代谢工程手段在大肠杆菌体内重构L‑THA代谢网络，所得基因工程菌株直接发酵葡萄糖即可高效生产L‑THA，对于实现L‑THA的低成本绿色合成具有重要意义。

[0017] 在相同发酵培养条件下，过表达天冬酰胺加氧酶基因asnO、天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB和天冬氨酸氨解酶基因aspA并敲除天冬氨酸激酶III基因lysC的重组菌株L‑THA产量可达280.80mg/L，与只表达天冬酰胺加氧酶基因asnO的重组菌株相比，L‑THA产量提高了约4.6倍；与只表达基因asnO和aspC、或只表达基因asnO和asnB的两种重组菌种相比，L‑THA产量提高了约4倍；与只表达基因aspC、asnB和asnO的重组菌株相比，L‑THA产量提高了约2倍；与表达基因aspC、asnB、asnO和aspA的重组菌株相比，L‑THA产量提高了约30％。

附图说明

[0018] 图1为pCBO重组质粒结构示意图；

[0019] 图2为pACY‑aspA重组质粒结构示意图；

[0020] 图3为FDAA衍生化法检测发酵产物及L‑THA标准品的HPLC结果图。

具体实施方式

[0021] 本发明中使用的缩写或简称如下：

[0022] L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸(L‑threo‑3‑hydroxyaspartic acid)：L‑THA[0023] 异丙基硫代半乳糖苷：IPTG

[0024] 大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)：E.coli

[0025] 本发明设计的培养基及其配方如下：

[0026] 种子培养基(LB液体培养基)：酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，余量为水，添加终浓度为50μg/mL卡那霉素和终浓度为25μg/mL的氯霉素。

[0027] M9培养基：15.2g/L Na2HPO4·12H2O，3g/L KH2PO4，1g/L NH4Cl，0.5g/L NaCl,0.24g/L MgSO4·7H2O，20g/L葡萄糖，余量为水；发酵液中卡那霉素和氯霉素终浓度分别为
50μg/mL和25μg/mL；发酵培养基pH7.0。

[0028] 发酵液中L‑THA含量的检测方法：

[0029] 采用柱前衍生法测定各基因工程菌发酵液中的L‑THA含量，具体步骤为：

[0030] 将发酵液于10000rpm的条件离心10min，获得上清液，再取400μL上清液，加入终浓度5mM FDAA和30mM NaHCO3，37℃反应2h，然后取出冷却至室温，加1M HCl 20μL，终止反应；过0.22μm有机滤膜，采用HPLC检测L‑THA的产量。

[0031] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0032] 实施例1：基因工程菌的构建

[0033] 本实施例中的引物序列见表1

[0034] (一)重组质粒pO、pCO、pCBO和pBO的构建

[0035] (1)构建重组质粒pO

[0036] 将天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)来源的天冬酰胺加氧酶基因asnO按照大肠杆菌密码子偏好性进行优化，委托基因合成公司合成基因，所得基因asnO的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将获得的基因asnO克隆至pET28a(+)质粒，使用酶切位点为BamH I和Hind III，得到重组质粒pET28a‑asnO，命名为pO。

[0037] (2)重组质粒pCO的构建

[0038] 以BL21(DE3)基因组DNA为模板，以aspC‑F和aspC‑R为引物，PCR扩增天冬氨酸转氨酶基因aspC基因片段(所述aspC基因的Gene ID为945553)。使用限制性内切酶Not I和Xho I对所得的aspC基因片段和步骤1)得到的pO质粒进行双酶切，酶切片段用DNA T4连接酶进行酶连。将酶连产物转化DH5α感受态细胞，得到转化子，对转化子进行PCR菌落验证、双酶切验证和DNA测序分析，构建成功的重组质粒为pET28a‑asnO‑aspC，命名为pCO。

[0039] (3)重组质粒pCBO的构建

[0040] 以BL21(DE3)基因组DNA为模板，以asnB‑F和asnB‑R为引物PCR扩增asnB天冬酰胺合成酶基因片段(所述asnB基因的Gene ID为945281)，使用限制性内切酶Not I和Hind III对所得asnB基因和步骤2)所得pCO质粒进行双酶切，酶切片段用DNA T4连接酶进行酶连。将酶连产物转化DH5α感受态细胞，得到转化子，对转化子进行PCR菌落验证、双酶切验证和DNA测序分析进行确认，构建成功的重组质粒为pET28a‑aspC‑asnB‑asnO，命名为pCBO，其结构示意图如图1所示。

[0041] (4)重组质粒pBO的构建

[0042] 以BL21(DE3)基因组DNA为模板，以asnB‑F和asnB‑R为引物PCR扩增asnB天冬酰胺合成酶基因片段(所述asnB基因的Gene ID为945281)，使用限制性内切酶Not I和Hind III对所得asnB基因和步骤1)所得pO质粒进行双酶切，酶切片段用DNA T4连接酶进行酶连。将酶连产物转化DH5α感受态细胞，得到转化子，对转化子进行PCR菌落验证、双酶切验证和DNA测序分析进行确认，构建成功的重组质粒为pET28a‑asnO‑asnB，命名为pBO。

[0043] (二)重组质粒pACY‑aspA的构建

[0044] 以BL21(DE3)基因组DNA为模板，以aspA‑F和aspA‑R为引物PCR扩增天冬氨酸氨解酶基因aspA基因片段(所述aspA基因的Gene ID为948658)，使用限制性内切酶EcoR V和Nde I对所得aspA基因和质粒pACYCDuet‑1进行双酶切，酶切片段用DNA T4连接酶进行酶连。将酶连产物转化DH5α感受态细胞，得到转化子，对转化子进行PCR菌落验证、双酶切验证和DNA测序分析进行确认，构建成功的重组质粒为pACY‑aspA，其结构示意图如图2所示。

[0045] (三)宿主菌的基因敲除

[0046] 采用P1噬菌体转导技术敲除宿主菌BL21(DE3)基因组上的lysC基因(所述lysC基因的Gene ID为948531)。以lysC‑outup和kan‑3’为引物，对lysC敲除菌进行菌落PCR验证，筛选阳性菌株。使用温敏型质粒Pcp20对敲除成功的阳性菌株进行卡那霉素抗性基因片段的消除，以lysC‑outup和lysC‑outdown为引物对消抗成功的lysC基因敲除菌进行PCR菌落验证和DNA测序分析，验证正确的重组宿主菌为BL21(DE3)ΔlysC。

[0047] (四)生产L‑THA的基因工程菌的构建

[0048] 将重组质粒pO转化至BL21(DE3)中，得到重组菌株CA02；将重组质粒pCO转化至BL21(DE3)中，得到重组菌株CA03；将重组质粒pBO转化至BL21(DE3)中，得到重组菌株CA04；将重组质粒pCBO转化至BL21(DE3)中，得到重组菌株CA05；将重组质粒pCBO和重组质粒pACY‑aspA共同转化至BL21(DE3)中，得到重组菌株CC02；将重组质粒pCBO和重组质粒pACY‑aspA共同转化至敲除lysC的重组宿主菌BL21(DE3)ΔlysC中，得到重组菌株CC03，其中重组菌株CC03为可高效生产L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸的基因工程菌。FDAA衍生化法检测利用重组菌株CC03发酵所得产物及L‑THA标准品的HPLC结果如图3。

[0049] 表1.相关引物序列

[0050]

[0051] 实施例2：基因工程菌在生产L‑苏式‑3‑羟基天冬氨酸中的应用

[0052] 将实施例1所得基因工程菌CA02、CA03、CA04、CA05、CC02和CC03分别接种于种子培养基(LB液体培养基)，37℃，220rpm摇瓶过夜培养；以1％的接种量(体积比)将种子液转接于M9培养基，37℃培养至OD600为0.6时加入终浓度0.2mM IPTG诱导，培养温度为30℃，诱导4h后加入终浓度1mM L‑谷氨酰胺，0.5mM FeSO4·7H2O和1mM抗坏血酸，于30℃、180rpm继续培养24h，发酵结束取发酵液样品进行离心，取上清液，采用柱前衍生法测定各基因工程菌发酵液中的L‑THA含量，检测结果如表2所示。

[0053] 结果显示，过表达天冬酰胺加氧酶基因asnO、天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬酰胺合成酶基因asnB和天冬氨酸氨解酶基因aspA并敲除天冬氨酸激酶III基因lysC的重组菌株CC03的L‑THA产量最高，达到280.80mg/L，而只表达天冬酰胺加氧酶基因asnO的重组菌株CA02的L‑THA产量为49.80mg/L，即在相同发酵培养条件下，含有两种重组质粒pCBO和pACY‑aspA并且敲除lysC基因的重组菌株CC03比含有单质粒pO的重组菌株L‑THA产量提高了约4.6倍；与只含有pCO或pBO的两种重组菌种相比，L‑THA产量提高了约4倍；与只含有pET28a‑aspC‑asnB‑asnO的重组菌株CA05相比，L‑THA产量提高了约2倍；与含有质粒pET28a‑aspC‑asnB‑asnO和pACY‑aspA的重组菌株CC02相比，L‑THA产量提高了约30％。

[0054] 表2.各基因工程菌对应的L‑THA产量

[0055]