一种阴香组织培养快速繁殖的方法

摘要

本发明公开了一种阴香组织培养快速繁殖的方法，属于植物生物技术领域。本发明聚焦阴香组织培养过程中外植体污染率高、丛生芽诱导及扩繁效率低与生根难等技术问题，以带有腋芽的阴香茎段为外植体，通过预处理及无汞表面消毒与初代抗菌培养，建立了低污染率的高效无菌培养技术方案；采用独特的改良培养基，结合新型细胞分裂素类植物生长调节剂及低浓度生长素的应用，有效实现丛生芽诱导与扩增繁殖及不定根发生，进而通过移栽驯化获得健康生长的阴香再生植株。本发明建立了阴香组织培养苗的高效繁育技术体系，可用于阴香优良种质组培苗的规模化生产，有助于我国天然冰片产业发展。

权利要求

1.一种阴香组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，该方法包括阴香组织的初代培养、丛生芽诱导、扩增分化培养以及诱导生根；其中所述初代培养以带有腋芽的阴香茎段为外植体，以软毛刷蘸肥皂水清洗枝条表面灰尘，流水冲洗30 min；再以浓度为0.25%的对氯间二甲苯酚溶液浸泡处理20 min，流水冲洗30 min后，沥干水分分割成长度约15 cm的茎段备用，再使用以无水乙醇与有效氯浓度为5.0%的三氯异氰尿酸钠溶液，按体积比为7:3混合后，加入0.5%的Tween‑80组成的表面消毒剂进行处理，再置于初代培养基中培养；其中，

1) 初代培养的培养基为含有以下成分的MS培养基：植菌素0.2%，蔗糖30 g/L，植物凝胶2 g/L，pH值5.8；

2) 丛生芽诱导、扩增分化培养以及诱导生根的基本培养基为经过改良的DCR培养基，其中所述改良的DCR培养基由以下成分组成：NH4NO3 340 mg/L、KNO3 340 mg/L、Ca(NO3)2 

492 mg/L、CaCl2 333 mg/L、MgSO4 210 mg/L、KH2PO4 170 mg/L、FeSO4 15.2 mg/L、EDTANa2 

37.3 mg/L、MnSO4 15.1 mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、KI 0.83 mg/L、Na2MoO4 0.22 mg/L、CuSO4 

0.16 mg/L、LiCl 0.025 mg/L、CoCl2 0.014 mg/L、甘氨酸2 g/L、肌醇200 mg/L、盐酸硫胺素1 mg/L、盐酸吡哆醇0.5 mg/L、烟酸0.5 mg/L、PVP 0.5 mg/L、核黄素30 mg/L、蔗糖30 g/L、植物凝胶2 g/L，其余为水；

3) 丛生芽诱导培养基为含有下述成分的所述改良的DCR培养基：mTR 1.0 mg/L和NAA 

0.1 mg/L，pH值为5.8；

4) 扩增分化培养基为含有下述成分的所述改良的DCR培养基：mTR 2.0 mg/L和NAA 

0.1 mg/L，pH值为5.8；

5) 诱导生根培养基为含有下述成分的所述改良的DCR培养基：IBA 1.0 mg/L，pH值

5.8。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织培养条件为光照16 h、光照强度2

36 μmol/m/s、黑暗8 h和温度24 26℃。

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说明书

一种阴香组织培养快速繁殖的方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种阴香组织培养快速繁殖的方法。

背景技术

[0002] 阴香(Cinnamomum burmanni)为樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)植物，有多种化学型，其中右旋龙脑型阴香叶片精油中天然冰片的含量最高可达78.6％，在自然界中珍惜罕有；此外，阴香叶片提取的天然冰片不含有毒的樟脑、异龙脑和致癌物黄樟油素等成分，质量上乘。天然冰片具有促进药物透皮吸收、抗菌抗氧化、保护心血管和防止系统癌变等功效，为复方丹参滴丸、速效救心丸等60多种名优中成药的“药引”，鉴于其极高的药用价值，市场需求量巨大。然而，通过有性繁殖产生的阴香后代群体变异极大，以高产右旋龙脑阴香为亲本，通过有性繁殖获得的子代叶片精油含量有明显差异，且会产生大量低产甚至不产右旋龙脑的子代。由此可见，以有性繁殖获得的阴香实生苗枝叶为原料提取天然冰片，其产量和品质难以得到保证，根本无法满足产业发展需要；因而阴香组织培养技术(即无性繁殖技术)被业界认为是破解这一难题的重要手段之一。

发明内容

[0003] 为了解决上述问题，本发明提供一种阴香组织培养快速繁殖的方法。该方法包括阴香组织的初代培养、丛生芽诱导、扩增分化培养以及诱导生根；其中所述初代培养以带有腋芽的阴香茎段为外植体，使用表面消毒剂进行处理，再置于初代培养基中培养；其中，[0004] 1)初代培养的培养基为含有以下成分的MS培养基：植菌素0.1％～0.3％，蔗糖30g/L，植物凝胶1.5～2.5g/L，pH值5.8～6.3；

[0005] 2)丛生芽诱导、扩展分化培养以及诱导生根的基本培养基为经过改良后的DCR培养基；

[0006] 3)丛生芽诱导培养基为含有下述成分的所述改良的DCR培养基：mTR 0.5～1.5mg/L和NAA 0.05～0.15mg/L，pH值为5.8～6.3；

[0007] 4)扩增分化培养基为含有下述成分的所述改良的DCR培养基：mTR 1.0～3.0mg/L和NAA 0.05～0.15mg/L，pH值为5.8～6.3；

[0008] 5)诱导生根培养基为含有下述成分的所述改良的DCR培养基：IBA 0.1～1.0mg/L，pH值5.8～6.3。

[0009] 在本发明的一个实施方案中，所述表面消毒剂为无水乙醇与有效氯浓度为1.5％～6.0％的三氯异氰尿酸钠溶液，按体积比为7:3混合后，加入0.2％～1.0％的Tween‑80。优选情况下，所述表面消毒剂为无水乙醇与有效氯浓度为5.0％的三氯异氰尿酸钠溶液，按体积比为7:3混合后，加入0.5％的Tween‑80。通过不含汞的表面消毒剂进行外植体表面消毒，并培养在抗菌初代培养基上获得无菌培养物。

[0010] 在本发明的一个实施方案中，所述经过改良后的DCR培养基由以下成分组成：NH4NO3300～370mg/L、KNO3 290～390mg/L、Ca(NO3)2 420～560mg/L、CaCl2 280～390mg/L、MgSO4190～230mg/L、KH2PO4 130～200mg/L、FeSO4 15.2mg/L、EDTANa2 37.3mg/L、MnSO4 
15.1mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4 0.22mg/L、CuSO4 0.16mg/L、LiCl 
0.025mg/L、CoCl2 0.014mg/L、甘氨酸2g/L、肌醇200mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆醇
0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、PVP 0.5mg/L、核黄素30mg/L、蔗糖30g/L、植物凝胶1.5～2.5g/L，其余为水。优选情况下，所述经过改良后的DCR培养基由以下成分组成：NH4NO3 340mg/L、KNO3340mg/L、Ca(NO3)2 492mg/L、CaCl2 333mg/L、MgSO4 210mg/L、KH2PO4 170mg/L、FeSO415.2mg/L、EDTANa2 37.3mg/L、MnSO4 15.1mg/L、H3BO3 6.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO40.22mg/L、CuSO4 0.16mg/L、LiCl 0.025mg/L、CoCl2 0.014mg/L、甘氨酸2g/L、肌醇
200mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、PVP 0.5mg/L、核黄素30mg/+ 2+
L、蔗糖30g/L、植物凝胶2g/L，其余为水。通过降低NH4 浓度促进丛生芽生长，同时提高Ca
2+
和Mg 浓度改善阴香组织培养苗叶片黄化的现象，有效提高丛生芽诱导和扩增分化效率。

[0011] 在本发明另一优选的实施方案中，

[0012] 1)初代培养基为含有以下成分的MS培养基：植菌素0.2％，蔗糖30g/L，植物凝胶2g/L，pH值为5.8；

[0013] 2)丛生芽诱导、扩增分化培养以及诱导生根的基本培养基为经过改良后的DCR培养基；

[0014] 3)丛生芽诱导培养基为含有下述成分的所述改良的DCR培养基：mTR 1mg/L和NAA0.1mg/L，pH值为5.8；

[0015] 4)扩增分化培养基为含有下述成分的所述改良的DCR培养基：mTR 2mg/L和NAA 0.1mg/L，pH值为5.8；

[0016] 5)诱导生根培养基为含有下述成分的所述改良的DCR培养基：IBA 1mg/L，pH值为5.8。

[0017] 在本发明的一个实施方案中，所述组织培养条件为光照16h、光照强度36μmol/m2/s、黑暗8h和温度24～26℃。

[0018] 本申请公开了一种阴香组织培养快速繁殖的方法，本发明聚焦阴香组织培养过程中外植体污染率高、丛生芽诱导及扩繁效率低与生根难等技术问题，以带有腋芽的阴香茎段为外植体，通过预处理及无汞表面消毒与初代抗菌培养，建立了低污染率的高效无菌培养技术方案；采用独特的改良培养基，结合新型细胞分裂素类植物生长调节剂及低浓度生长素的应用，有效实现丛生芽诱导与扩增繁殖及不定根发生，进而通过移栽驯化获得健康生长的阴香再生植株。本发明建立了阴香组织培养苗的高效繁育技术体系，可用于阴香优良种质组培苗的规模化生产，有助于我国天然冰片产业发展。

附图说明

[0019] 图1为阴香茎段外植体；

[0020] 图2为阴香茎段外植体诱导丛生芽；

[0021] 图3为阴香丛生芽扩繁；

[0022] 图4为阴香不定根诱导；

[0023] 图5为阴香再生植株移栽成活。

具体实施方式

[0024] 以下对本申请的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本申请，并不用于限制本申请。

[0025] 实施例一 阴香无菌培养体系的建立

[0026] 阴香无菌培养体系建立试验设1个试验组和3个对照组，其中试验组处理方法如以下步骤①～⑤所述；3个对照组分别在试验组基础上做一定修改，操作方法如步骤⑥所述。

[0027] ①选择生长健壮、无病虫害的阴香植株，在3～9月间采集当年生的带腋芽健康新枝为外植体，剪去所有叶片(保留叶柄)及顶芽；以软毛刷蘸肥皂水清洗枝条表面灰尘，流水冲洗30min；再以浓度为0.25％的对氯间二甲苯酚溶液浸泡处理20min，流水冲洗30min后，沥干水分分割成长度约15cm的茎段备用。

[0028] ②在超净工作台上，将阴香茎段转移至容积为1L的无菌玻璃丝口瓶中，加入1L环保消毒剂(含无水乙醇700mL、有效氯浓度为5.0％的三氯异氰尿酸钠溶液300mL和Tween‑805mL)，混合均匀后旋紧丝口瓶；在室温条件下，水平置于摇床中以100r/min震荡处理
15min。在超净工作台上除去消毒剂，以无菌水浸泡处理外植体5次，每次3min，沥干水分备用。

[0029] ③在超净工作台上，剪去阴香茎段两端死亡组织和叶柄(保留2～3mm)，将茎段切割为长度约2cm的外植体，保证每个外植体含一个腋芽。

[0030] ④将外植体垂直接种于初代培养基上(含有以下成分的MS培养基：植菌素0.2％，蔗糖30g/L，植物凝胶2g/L，pH值为5.8)，接种时保证腋芽暴露于培养基以上(见图1)；所用培养基及接种工具均经高温湿热灭菌处理(121℃、0.11MPa、20min)并冷却后使用。

[0031] ⑤将上述培养物转移至植物组织培养室中培养，培养条件为光照16h(光照强度362
μmol/m/s)/黑暗8h，温度24～26℃。每天观察并清除污染的培养物。

[0032] ⑥对照组1：略去步骤①对氯间二甲苯酚溶液浸泡步骤，其余与①～⑤完全相同。对照组2：以0.1％HgCl2溶液替代步骤②中的消毒剂，其余与①～⑤完全相同。对照组3：将表面消毒后获得的外植体接种于不含有植菌素的阴香初代培养基上培养，其余与①～⑤完全相同。

[0033] ⑦14天后统计污染率和死亡率，分析试验组和对照组去污染率效果。

[0034] 阴香表面消毒试验结果如表1所示。试验组(使用消毒剂)的污染率(12.6％)与对照组2(使用HgCl2)污染率(11.2％)相近，表明本发明所述的环保消毒剂表面消毒效果与含有重金属Hg的剧毒消毒剂相当，可以作为替代品用于阴香外植体表面消毒；同时，试验组外植体污染率明显低于对照组1(未使用对氯间二甲苯酚溶液进行预处理)和对照组3(培养基未添加植菌素)，说明对外植体进行预处理及抑菌培养均可明显降低污染率。此外，试验组外植体死亡率(11.6％)与对照组1～3(8.7％～13.5％)相比并无明显差异，表明本发明所述表面消毒过程中使用的预处理方法、消毒剂及抑菌剂未抑制阴香生长。综合分析，本发明将一种阴香外植体预处理方法、一种表面消毒方法及一种抗菌培养基有机结合，实现了阴香无菌培养体系的高效建立，具有去污染率高和环境友好的突出特点。

[0035] 表1不同表面消毒方法的无菌培养体系建立结果

[0036]

[0037] 注：去污染率(％)＝100‑污染率‑死亡率

[0038] 实施例二 阴香丛生芽的诱导与扩增分化

[0039] 通过正交试验确定基本培养基类型、N‑(3‑羟基苄基)腺苷(meta‑topolin riboside,mTR)浓度和NAA浓度对阴香丛生芽诱导效率的影响，其中基本培养基类型为MS、DCR和改良的DCR基本培养基；mTR浓度为1mg/L、2mg/L和3mg/L；NAA浓度为0.1mg/L、0.2mg/L和0.3mg/L(见表2)。在超净工作台上，将表面消毒获得的未污染阴香外植体分别转移至诱2
导培养基上，在光照16h(光照强度36μmol/m /s)/黑暗8h，温度24～26℃的条件下培养28天，统计丛生芽诱导效率。

[0040] 正交试验统计结果如下表2所示，统计结果表明培养基类型、mTR浓度和NAA浓度对阴香丛生芽诱导率均有显著影响，计算获得最优培养基为改良的DCR+mTR 1.0mg/L+NAA0.1mg/L；结果表明其丛生芽诱导率达到90.9％。

[0041] 表2不同培养基的丛生芽诱导结果

[0042]

[0043] 为进一步确定适合阴香丛生芽扩繁的细胞分裂素种类及浓度，将获得的阴香丛生芽分别转移至含有浓度为1.0～5.0mg/L的mTR或6‑BA的改良DCR培养基上，在条件为光照2
16h(光照强度36μmol/m/s)/黑暗8h，温度24～26℃培养35天，统计丛生芽增殖系数。

[0044] 试验结果如表3所示，随着所用mTR或6‑BA浓度的增加，阴香丛生芽增殖系数均呈先升高后降低的变化趋势，表明细胞分裂素的浓度对阴香丛生芽的增殖有明显影响；但是mTR和6‑BA诱导阴香丛生芽发生的最优浓度分别为2.0mg/L(处理组3)和4.0mg/L(处理组10)，说明阴香丛生芽可在含较低浓度mTR的改良DCR培养基上扩增繁殖；处理组3的丛生芽增殖系数(3.04)明显高于处理组10(1.88)，表明mTR相比6‑BA对阴香丛生芽扩繁效率更高。
由此可见，本发明将新型的细胞分裂素mTR应用于阴香丛生芽诱导及扩繁培养基，具有使用浓度低和诱导丛生芽效率高的突出特点，具有明显的实用性。

[0045] 表3不同培养基的丛生芽增殖结果

[0046]

[0047] 实施例三，阴香不定根的发生及移栽驯化

[0048] 植物组培过程具有连续性的特点，即丛生芽扩繁阶段所用细胞分裂素种类和浓度与生根阶段所用生长素浓度对诱导产生不定根均有影响，因而比较实施例二中扩繁效率最高的2种培养基上获得的丛生芽在含有不同浓度IBA的生根培养基上形成不定根的效果，方法如下。

[0049] ①在超净工作台上，将不同培养基(含mTR 2.0mg/L或6‑BA 4.0mg/L的丛生芽诱导培养基)上诱导获得的阴香丛生芽，分别转接至含IBA 0.5～1.5mg/L的阴香不定根诱导培养基上，约28天后统计不定根诱导率。

[0050] ②阴香移栽基质的制备。分别将泥炭与珍珠岩、草炭土与珍珠岩按照体积比1:1(v:v)混合均匀；以少量蒸馏水润湿，高温湿热灭菌并冷却至室温，分装于方形营养钵中(6～7cm×7～8cm，直径×高)，无菌水润湿备用。

[0051] ③将生根后的阴香植株从培养基中小心取出，温水洗净根部残留培养基；用枪状2
镊将其移栽至步骤②所述营养钵中，在光照16h(光照强度36μmol/m/s)/黑暗8h，温度24～
26℃的条件下培养。

[0052] ④培养时，将无孔的硬质透明保护套(4～5cm×5cm，直径×高，容积约100mL)扣于阴香植株上，每天更换一次干燥的硬质透明保护套；培养5天后，将无孔保护套更换为顶部开有直径为0.3cm孔洞的保护套，在相同条件下继续培养；此后每隔5天，依序更换为顶部开孔直径为0.6cm、0.9cm和1.2cm的保护套；当移栽的阴香植株顶端生长出新叶时去掉保护套，转移至温室中常规养护(夏季应适当遮荫)，每14天喷施一次Hogeland的溶液。

[0053] 如表4所示数据，以mTR扩繁获得的阴香丛生芽生根率为79.2％～96.2％，高于6‑BA诱导丛生芽的生根率(24.1％～68.5％)，表明阴香丛生芽扩繁所用的细胞分裂素种类对不定根的发生有明显影响；以不同细胞分裂素扩繁获得的丛生芽在进行不定根发生时，所用IBA的最适浓度也有差异，其中处理2所用IBA浓度(1.0mg/L)低于处理6(1.5mg/L)，但阴香的不定根发生率反而更高，表明通过mTR扩繁的阴香丛生芽可以在较低的IBA浓度下形成不定根。由此可见，本发明所用新型细胞分裂素mTR可在较低浓度下诱导阴香产生丛生芽，进而降低其不定根发生难度，有效提高阴香丛生芽的生根效率，具有明显的新颖性和实用性。

[0054] 表4不同培养基的不定根诱导效果

[0055]

[0056] 阴香小植株移栽后驯化25天，以泥炭/珍珠岩和草炭土/珍珠岩为基质移栽的阴香成活率分别为90.5％(86/95)和92.5％(86/93)。由于目前尚未见阴香组织培养苗移栽成活的报道，本发明方案未能与已有技术参数相比较，但其移栽成活率已>90％，完全可以满足工厂化育苗生产的需要，具有突出的实质性特点，可在应用中产生积极效果。

[0057] 应当指出，以上所述实施例为本发明的优选实施方式，对于本专业领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下对其做出的改进和润饰，也应视为本发明的保护范围。