IL-11的抗体及其应用

摘要

本发明提出了一种能够特异性识别IL‑11的抗体或其抗原结合片段。该抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～3，轻链可变区CDR序列：SEQ IN NO:34～36。该抗体能够特异性的靶向结合IL‑11，阻断IL‑11和IL‑11受体的结合。

权利要求

1.一种能够特异性识别IL‑11的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括：分别如SEQ ID NO:1、2和3所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和分别如SEQ ID NO:34、35和36所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一，所述重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有如SEQ ID NO：67所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO：78所示氨基酸序列的轻链可变区。

4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。

5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG抗体或其突变体。

6.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的轻链恒定区来自于人源的Kappa轻链恒定区；重链恒定区来自于人源IgG1的重链恒定区。

7.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体恒定区的全长序列如SEQ ID NO:89和90所示。

8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体重链如SEQ ID NO:91所示和轻链如SEQ ID NO:102所示。

9.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段；

所述核酸分子为DNA；

所述核酸分子如SEQ ID NO:113所示和如SEQ ID NO:124所示。

10.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求9所述的核酸分子；所述表达载体为真核表达载体。

11.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求9所述的核酸分子，或者表达权利要求1～8任一项所述的抗体或其抗原结合片段；

所述重组细胞是通过将权利要求10所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的；

所述重组细胞为真核细胞。

12.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1～8任一项所述的抗体、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的表达载体或权利要求11所述的重组细胞。

13.权利要求1～8任一项所述的抗体、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的表达载体、权利要求11所述的重组细胞或权利要求12所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防肺纤维化，非酒精性脂肪肝炎或慢性心力衰竭。

14.一种检测IL‑11的试剂盒，其特征在于，包括权利要求利要求1～8任一项所述的抗体；所述试剂盒用于检测IL‑11或者诊断IL‑11相关的疾病。

说明书

IL‑11的抗体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及IL‑11的抗体及其应用，更具体地，本发明涉及能够特异性识别IL‑11的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物、制药用途以及检测IL‑11的试剂盒。

背景技术

[0002] 纤维化是一个重要的过程，是伤口愈合的关键部分。过度纤维化在许多罕见和常见疾病中很常见，并且在疾病发病机制中很重要。以过度纤维化为特征的疾病包括但不限于：系统性硬化症、硬皮病、肥厚性心肌病、扩张型心肌病(DCM)、心房纤维性颤动、心室纤维性颤动、心肌炎、肝硬化、肾脏疾病、眼部疾病、哮喘、囊性纤维化、关节炎和特发性肺纤维化。尽管对人类健康影响很大，但对纤维化的治疗和诊断方法的医疗需求仍然未得到满足。

[0003] 白细胞介素11(IL‑11)的真正生理作用尚不清楚。IL‑11与造血细胞活化和血小板生成的关系最为密切，但也被发现具有促炎和抗炎、促血管生成的作用，并对瘤形成很重要。已知TGF β1或组织损伤可诱导IL‑11的表达。从已发表的文献来看，IL‑11在纤维化中的作用尚不清楚。IL‑11被认为对肺纤维化和炎症很重要，其表达水平与皮肤和呼吸系统中的胶原水平相关。然而，大多数研究表明IL‑11在心脏和肾脏中是抗纤维化的，在几种组织和慢性炎症疾病中的是抗炎的。一般来说，IL‑11的分子作用模式被认为是通过STAT3介导的转录调节RNA表达的mRNA水平。

[0004] 已有研究表明，施用能够抑制白细胞介素11(IL‑11)作用的试剂来治疗、预防或缓解需要治疗的受试者中的纤维化。能够抑制IL‑11作用的试剂可以阻止或减少IL‑11与IL‑11受体的结合。

[0005] 目前上市的针对肺纤维化疾病的药物仅有吡啡尼酮和尼达尼布两款，但这两款药疗效差，需要有全新机制的药物来解决这种困局。

[0006] 开发具有抑制IL‑11作用的试剂已成为开发治疗和预防肺纤维化疾病的药物的方向。

发明内容

[0007] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明开发一款具有高中和活性的Anti‑IL‑11的抗体，以期用于纤维化相关疾病的治疗或预防。

[0008] 在本发明的的第一方面，本发明提出了一种能够特异性识别IL‑11的抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～3，轻链可变区CDR序列： SEQ IN NO:34～36。

[0009] GYTFTTNG(SEQ ID NO:1)。

[0010] INTNTGEP(SEQ ID NO:2)。

[0011] AREGAFGLDY(SEQ ID NO:3)。

[0012] QSVSND(SEQ ID NO:34)。

[0013] YGS(SEQ ID NO:35)。

[0014] QQDFFSPWT(SEQ ID NO:36)。

[0015] 根据本发明实施例的上述抗体能够特异性的靶向结合IL‑11，阻断IL‑11和IL‑11受体的结合。

[0016] 再一方面，本发明提出了一种能够特异性识别IL‑11的抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～3，轻链可变区CDR序列：SEQ IN NO:34～36，所述抗体或其抗原结合片段具有人源化修饰。需要说明的是，本申请所述的“人源化修饰”是指能够使得所述抗体或其抗原结合片段的免疫原性降低的氨基酸的改变，包括氨基酸的突变、插入、缺失、化学基团的赘合等等。根据本发明实施例的上述人源化抗体的免疫源性降低，抗体能够特异性的靶向结合IL‑11，阻断IL‑11和IL‑11受体的结合。

[0017] 根据本发明的实施例，上述抗体或抗原结合片段还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

[0018] 根据本发明的实施例，所述抗体包括：

[0019] 分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和

[0020] 分别如SEQ ID NO:34、35和36或者与SEQ ID NO:34、35和36具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。

[0021] 本发明CDR序列参照Kabat命名系统进行限定。

[0022] 根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别IL‑11。

[0023] 根据本发明的实施例，所述抗体含有重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一，所述重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。

[0024] 根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO：67所示氨基酸序列的重链可变区。

[0025] QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTNGINWVKQAAGKGLKWMGWINTNTGE PTNAEELKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDAAIYFCAREGAFGLDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:67)。

[0026] 根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO：78所示氨基酸序列的轻链可变区。

[0027] SIVMTQSPKFLLVSAGDRVIITCKASQSVSNDVVWYQQKPGQSPKLLIYYGSHRNTGVP TRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDFFSPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:78)。

[0028] 根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO：67所示氨基酸序列的重链可变区，和具有如SEQ ID NO：78所示氨基酸序列的轻链可变区。

[0029] 根据本发明的实施例，所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。

[0030] 根据本发明的实施例，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG抗体或其突变体。进而所述抗体的免疫原性可以得到有效降低。

[0031] 根据本发明的实施例，所述抗体的轻链恒定区来自于人源的Kappa轻链恒定区；重链恒定区来自于人源IgG1的重链恒定区。

[0032] 根据本发明的实施例，所述抗体恒定区的全长序列如SEQ ID NO:89或90所示。

[0033] ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:89)。

[0034] RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:90)。

[0035] 其中，上述SEQ ID NO:89所示的抗体恒定区的全长序列包括IgG1重链恒定区和Fc区，其中，IgG1重链恒定区序列为 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV，Fc区序列为 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；上述SEQ ID NO:90所示的抗体恒定区的全长序列为IgG轻链恒定区。

[0036] 根据本发明的实施例，所述抗体具有SEQ ID NO:91所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:102所示氨基酸序列的轻链。

[0037] QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTNGINWVKQAAGKGLKWMGWINTNTGE PTNAEELKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDAAIYFCAREGAFGLDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:91)。

[0038] SIVMTQSPKFLLVSAGDRVIITCKASQSVSNDVVWYQQKPGQSPKLLIYYGSHRNTGVP TRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDFFSPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:102)。

[0039] 其中，在本申请中，上述SEQ ID NO:91和102所组成的抗体被称为3‑6A4，上述SEQ ID NO:92和103所组成的抗体被称为5‑20E11‑5F2，上述SEQ ID NO:93和104所组成的抗体被称为3‑5B2‑2G4，上述SEQ ID NO:94和105所组成的抗体被称为3‑5B2‑7A4，上述SEQ ID NO:95和106所组成的抗体被称为3‑2B5‑3D2，上述SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:107所组成的抗体被称为3‑7C9‑1A6，上述SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:108所组成的抗体被称为 3‑9E1‑3A2，上述SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:109所组成的抗体被称为3‑15D5‑3A6，上述 SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:110所组成的抗体被称为3‑15D5‑6A1，上述SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:111所组成的抗体被称为5‑20E11‑1A2，上述SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:112 所组成的抗体被称为5‑21G2‑1D3。

[0040] 根据本发明的实施例，所述抗体为单链抗体、多聚体抗体、CDR移植抗体或小分子抗体。

[0041] 根据本发明的实施例，所述单链抗体包括SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的重链可变区和 SEQ ID NO:78所示氨基酸序列的轻链可变区，其中所述重链可变区的C端通过连接肽linker 与所述轻链可变区的N端相连，或所述轻链可变区的C端通过连接肽linker与所述重链可变区的N端相连。需要说明的是，本申请所述的单链抗体的“连接肽linker”为用于连接抗体重链可变区和轻链可变区的连接肽，其可为制备单链抗体的常用连接肽linker，也可为经过科研工作者改造后的连接肽Linker。

[0042] 根据本发明的实施例，所述小分子抗体包括Fab抗体、Fv抗体、单域抗体以及最小识别单位的至少之一。

[0043] 在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前面所述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例的核酸分子所编码的抗体或抗原结合片段可特异性靶向结合IL‑11，阻断IL‑11和IL‑11受体的结合。

[0044] 根据本发明的实施例，上述核酸分子还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

[0045] 根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。

[0046] 根据本发明的实施例，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:113所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:124所示核苷酸序列。

[0047] CAGATTCAATTGGTACAAAGCGGTCCCGAGCTCAAGAAACCTGGGGAGACTGTGA AAATTTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACCACTAACGGTATCAACTGGGTGAAGCAGGCTGCAGGAAAGGGGCTCAAGTGGATGGGATGGATCAACACTAATACTGGAGAAC CCACCAATGCTGAGGAACTTAAAGGCAGATTCGCCTTCTCTCTTGAGACTTCAGCCAGCACCGCCTACCTCCAAATTAACAATCTGAAAAATGAGGATGCCGCTATCTATTTTTGTGCC CGAGAGGGTGCATTCGGTCTTGATTACTGGGGTCAGGGCACCTCTGTGACAGTGTCTAGCGCCTCAACTAAGGGGCCCAGTGTTTTCCCCCTTGCCCCTTCCTCAAAATCAACTAGCG GAGGCACAGCCGCTCTTGGCTGTCTCGTGAAAGATTACTTCCCCGAGCCAGTGACAGTCTCTTGGAACAGCGGGGCACTCACCTCCGGCGTTCACACTTTTCCCGCAGTCCTCCAGTC TAGCGGATTGTATAGCCTGTCTTCTGTTGTCACAGTGCCATCCTCTAGCCTTGGCACCCAGACCTACATTTGTAATGTGAATCATAAGCCTTCAAACACAAAAGTCGATAAAAAAGTGG AGCCAAAGAGCTGTGACAAGACTCACACTTGCCCTCCATGCCCTGCCCCAGAACTCCTTGGCGGACCTAGCGTCTTCCTGTTTCCTCCTAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCACG CACTCCTGAAGTGACCTGCGTTGTGGTAGACGTGAGCCACGAGGATCCAGAGGTGAAG TTCAACTGGTATGTGGATGGAGTCGAGGTGCATAATGCCAAAACAAAACCTAGGGAGGAGCAGTACAACTCTACCTACCGGGTGGTGTCTGTTTTGACCGTTCTGCACCAAGACTGGT TGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCAAACAAAGCACTCCCAGCCCCTATAGAGAAGACCATCAGCAAAGCTAAGGGGCAGCCAAGAGAACCACAGGTTTACACCCTGCCC CCCTCACGGGATGAACTGACAAAGAACCAGGTGTCTCTGACTTGCCTCGTGAAAGGATT CTACCCTTCAGATATCGCAGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAACCCGAGAATAATTACAAGACAACTCCCCCAGTCCTGGACAGTGATGGGTCTTTTTTCCTGTATTCTAAGCTCACTG TTGACAAAAGCCGCTGGCAGCAGGGTAATGTATTCTCCTGCTCCGTCATGCACGAAGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGTCTCTGAGCTTGTCACCCGGCAAG(SEQ ID NO:113)。

[0048] TCTATTGTGATGACTCAAAGTCCTAAATTTCTCCTCGTTTCCGCTGGAGACAGGGTG ATAATAACTTGCAAAGCTTCACAGAGCGTGTCCAATGATGTAGTATGGTACCAGCAAAAGCCAGGCCAGAGCCCAAAACTTCTGATCTACTACGGTTCACACCGGAACACCGGAGTAC CTACAAGGTTTACTGGTTCCGGCTATGGGACTGACTTCACATTCACTATTTCAACCGTCCAGGCTGAAGACCTGGCAGTCTATTTTTGTCAGCAGGATTTCTTCTCACCATGGACCTTCG GTGGCGGTACAAAATTGGAGATAAAGCGCACTGTTGCCGCCCCTTCCGTCTTTATATTTCCACCCTCCGATGAGCAGCTTAAGTCAGGGACAGCCTCTGTCGTGTGTCTGCTCAACAAT TTTTACCCCCGTGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTGGATAACGCCCTGCAGTCTGGCAA TTCTCAGGAGTCAGTGACCGAACAGGATTCAAAAGACTCTACATATAGCTTGTCATCCACCCTTACTCTGTCCAAAGCAGATTATGAGAAGCACAAAGTTTATGCTTGTGAAGTTACTCA CCAGGGTCTGAGCAGCCCCGTAACAAAGAGTTTCAACCGGGGGGAGTGC(SEQ ID NO:124)。

[0049] 其中，在本申请中，上述SEQ ID NO:113和124所示核苷酸序列分别编码3‑6A4抗体的重链和轻链，上述SEQ ID NO:114和125所示核苷酸序列分别编码5‑20E11‑5F2抗体的重链和轻链，上述SEQ ID NO:115和126所示核苷酸序列分别编码3‑5B2‑2G4抗体的重链和轻链，上述SEQ ID NO:116和127所示核苷酸序列分别编码3‑5B2‑7A4抗体的重链和轻链，上述SEQ ID NO:117和128所示核苷酸序列分别编码3‑2B5‑3D2抗体的重链和轻链，上述SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:129所示核苷酸序列分别编码3‑7C9‑1A6抗体的重链和轻链，上述SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:130所示核苷酸序列分别编码3‑9E1‑3A2抗体的重链和轻链，上述SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:131所示核苷酸序列分别编码3‑15D5‑3A6抗体的重链和轻链，上述SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:132所示核苷酸序列分别编码3‑15D5‑6A1抗体的重链和轻链，上述SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:133所示核苷酸序列分别编码5‑20E11‑1A2抗体的重链和轻链，上述SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:134所示核苷酸序列分别编码5‑21G2‑1D3 抗体的重链和轻链。

[0050] 在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前面所述的核酸分子。根据本发明实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的特异性识别IL‑11的抗体或其抗原结合片段表达，进而实现所述抗体或抗原结合片段的体外大量获得。

[0051] 根据本发明的实施例，上述表达载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

[0052] 根据本发明的实施例，所述表达载体为真核表达载体。进而实现前面所述的特异性识别 IL‑11的抗体或其抗原结合片段在真核细胞中的表达，如CHO细胞。

[0053] 在本发明的第四方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带前面所述的核酸分子，或者表达前面所述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例的重组细胞可用于前面所述的特异性识别IL‑11的抗体或其抗原结合片段体外表达和大量获得。

[0054] 根据本发明的实施例，上述重组细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

[0055] 根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前面所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。

[0056] 根据本发明的实施例，通过电转导的方法将所述表达载体引入所述宿主细胞中。

[0057] 根据本发明的实施例，所述重组细胞为真核细胞。

[0058] 根据本发明的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞。

[0059] 在本发明的第五方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物含有前面所述的抗体，前面所述的核酸分子，前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞。根据本发明实施例的药物组合物中所包含的抗体或表达的抗体能够特异性的靶向结合 IL‑11，阻断IL‑11和IL‑11受体的结合。

[0060] 在本发明的第六方面，本发明提出了前面所述的抗体、前面所述的核酸分子、前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞、前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者肺纤维化(Pulmonary fibrosis),非酒精性脂肪肝炎(non‑alcoholic steatohepatitis, NASH)，慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)或由成纤维细胞向纤维化转化所导致的疾病。

[0061] 在本发明的第七方面，本发明提出了一种检测IL‑11的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面任一所述的抗体。前面所述的IL‑11抗体能够特异性靶向结合IL‑11，根据本发明实施例的试剂盒可以实现IL‑11的特异性检测，如当抗体结合有荧光基团时，可以采用荧光检测装置实现对IL‑11的定位或实时检测。

[0062] 在本发明的第八方面，本发明提出了前面所述的抗体、前面所述的核酸分子、前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测IL‑11或者诊断IL‑11相关的疾病。

[0063] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

[0064] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

[0065] 图1是根据本发明实施例的优选抗体竞争性阻断IL‑11与IL‑11R结合的结果；

[0066] 图2是根据本发明实施例的优选抗体竞争性阻断活性检测结果；

[0067] 图3和图4是根据本发明实施例的优选抗体株抑制肺成纤维细胞HFL‑1向纤维化转化的 western检测结果；

[0068] 图5是根据本发明实施例的优选抗体株抑制肺成纤维细胞HFL‑1向纤维化转化统计分析结果；

[0069] 图6和图7是根据本发明实施例的优选抗体在C57BL/6小鼠中抑制肺纤维化结果；

[0070] 图8、图9、图10和图11是根据本发明实施例的优选抗体在Sprague Dawley大鼠中抑制肺纤维化结果。

具体实施方式

[0071] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

[0072] 此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

[0073] 抗体

[0074] 本文中，术语“抗体”是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V 区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH。

[0075] 在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区 (Hypervariable region，HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为决定簇互补区(complementarity‑determining region，CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR区。抗体可变区内高变区之外的氨基酸组成和排列顺序变化相对较小，称为框架区(FR)。VH和VL内各有4个框架区，分别以FR1、FR2、FR3和FR4表示。

[0076] 本发明利用IL‑11抗原，通过免疫获得了高特异性的高亲和力的抗IL‑11的Fab (antigen‑binding fragment)抗体片段。利用该抗体片段能够与IL‑11抗原特异性结合，从而可以靶向性治疗肺纤维化等疾病。

[0077] 需要说明的是，“免疫原性”是指能引起免疫应答的性能，即抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性。本申请的发明人进一步对筛选得到的鼠源的全新中和抗体序列进行人源化改造(人源化修饰)，得到人源化抗体，该人源化抗体既能保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又大幅降低了其免疫原性，提高了其安全性。

[0078] 在一些实施方案中，本发明提供了一种能够特异性识别IL‑11的抗体或者抗原结合片段，所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～33，轻链可变区CDR序列：SEQ IN NO:34～66。在另一些实施方案中，本发明所提供的抗体或者抗原结合片段与上述重链和轻链相比，具有保守氨基酸取代。“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原能力的抗体片段。“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸发生生物学上、化学上或者结构上相似的残基所取代。生物学上相似的指的是该取代不破坏IL‑11抗体或者与IL‑11抗原结合的生物学活性。结构上相似指的是氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学相似性指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的。例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者极性氨基酸相互取代，例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等等。

[0079] 在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO：67～77任一项所示氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO： 78～88任一项所示氨基酸序列的轻链可变区。发明人通过抗体序列比对数据库(NCBI、 IMGT)可得到上述抗重链可变区序列的CDR区(如SEQ ID NO:1～33所示)和轻链可变区序列的CDR区(如SEQ ID NO:34～66所示)。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区序列与SEQ ID NO:67～77所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区序列与SEQ ID NO:78～88任一项所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代。当然，这些保守氨基酸取代不会对抗体或者抗原结合片段的生物学功能带来改变。在一些具体方式中，这些保守氨基酸取代可以发生在重链可变区和轻链可变区中除了CDR区之外的氨基酸上。

[0080] 在一些优选方案中，本发明提供了一种抗IL‑11抗体，该抗体具有SEQ ID NO:91～101 任一项所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:102～112任一项所示氨基酸序列的轻链。

[0081] 在一些优选方案中，本发明提供了一种抗IL‑11单链抗体。

[0082] 核酸分子、表达载体、重组细胞

[0083] 在制备或者获取这些抗体的过程中，可以利用表达这些抗体的核酸分子，与不同的载体连接，然后在不同细胞中表达，来获得相应抗体。

[0084] 为此，本发明还提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述所述的抗体或抗原结合片段。

[0085] 在一些实施方案中，所述分离核酸分子具有如SEQ ID NO:113～123任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:124～134任一项所示核苷酸序列。

[0086] 在一些实施方案中，所述分离的核酸分子与上述SEQ ID NO:113～123所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。在至少一些实施方案中，所述分离的多核苷酸与所述SEQ ID NO:124～134 所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。这些与SEQ ID NO:113～123或者SEQ ID NO:124～134所示核苷酸序列具有同源性的序列，能够表达与SEQ ID NO:91～101和SEQ ID NO:102～112 相似的氨基酸，从而能够与IL‑11抗原特异性结合，实现抗体的靶向性功能。

[0087] 在一些优选实施方式中，所述分离的核酸分子具有SEQ ID NO:113～123所示的重链核苷酸序列和SEQ ID NO:124～134所示的轻链核苷酸序列。这些核苷酸序列经过种属优化，更易在哺乳动物细胞中表达。

[0088] 本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述分离的核酸分子。在将上述分离的多核苷酸连接到载体上时，可以将多核苷酸与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制多核苷酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，多核苷酸与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。例如Plasmid‑X质粒。

[0089] 本发明还提供了一种重组细胞，该重组细胞中包含有该表达载体。可以将表达载体导入到哺乳动物细胞中，构建获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达本发明提供的抗体或者抗原结合片段。通过该重组细胞进行培养，即可以获得相应抗体。这些可用的哺乳动物细胞例如可以为CHO细胞等。

[0090] 药物组合物、试剂盒及制药用途和在制备试剂盒中的用途。

[0091] 本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述所述的抗体或者抗原结合片段和药学可接受的载体。

[0092] 本文提供的抗IL‑11抗体可以掺入适合受试者施用的药物组合物中。通常，这些药物组合物包括本文提供的抗IL‑11抗体以及药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”可以包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等等。具体实例可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合物中的一种或多种。有许多情况下，药物组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠等。当然药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。

[0093] 例如，本发明的抗体可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物组合物中。这些药物组合物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。典型的药物组合物为注射溶液或输注溶液形式。所述抗体可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。

[0094] 当然，本文中的抗IL‑11抗体还可以根据需要被制成试剂盒或者其他诊断性试剂的一部分。根据本发明的实施例，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述IL‑11 抗体。应用本发明提供的试剂盒，例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用IL‑11 抗原和抗体特异性结合性能，来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：拮抗剂、抗IL‑11抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂；说明书或者文献等。抗IL‑11抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试相关疾病。这种相关疾病可包括IL‑11相关疾病，例如肺纤维化等等。当然本文提供的抗体也可以用于上述疾病的放射免疫检测和放射免疫治疗等等。

[0095] 在利用本发明所提供的抗IL‑11抗体治疗上述疾病时，可以将本发明提供的抗IL‑11 抗体提供给受试者即可。为此，本发明提供了一种用于治疗上述疾病的方法，包括向有需要的受试者施用本发明所提供的抗体或其抗原结合片段。

[0096] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0097] 实施例1重组人源蛋白抗原hu‑IL‑11‑His tag的生产

[0098] 载体的构建：人源IL‑11氨基酸序列通过全球公共数据库UniProt(P20809：124294)获得。采用分子克隆的方法，构建了含人源IL‑11基因序列的表达载体。采用电转染的方法，将编码人源IL‑11的载体转染至哺乳动物细胞CHO进行表达14天。待表达完成收获细胞上清液，采用Protein A纯化柱(GE healthcare,Cat:17040201)进行初步纯化，然后再采用Superdex75 (GE healthcare,Cat:29148721)进行精细纯化，最终获得可以用于免疫动物的重组蛋白抗原 hu‑IL‑11‑His tag。

[0099] 实施例2动物免疫

[0100] 为了得到能分泌针对hu‑IL‑11抗体的小鼠，我们对雌性Balb/c小鼠进行免疫。雌性Balb/c 购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司(Hunan SJA Laboratory Animal Co.，Ltd)。重组蛋白抗原hu‑IL‑11‑His tag与免疫佐剂经充分乳化后进行动物免疫，免疫流程见表1。

[0101] 表1：免疫动物安排表

[0102]

[0103]

[0104] 第35天收获少量的小鼠眼眶血，采用常规的Elisa方法进行抗体效价检测。

[0105] 实施例3抗体分泌细胞融合与筛选

[0106] 分离的小鼠脾细胞与永生化的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，并使用含10‑4M ‑7 ‑5Hypoxanthine, 4x10  M Aminopterin,1.6x10  M Thymidine的RPMI‑1640完全培养基静置培养约14天，待融合细胞长出克隆团后进行抗体亲和力的检测筛选。选取与IL‑11结合的抗体克隆株，取其上清，再进行流式细胞术测定抗原抗体的竞争结合，选出高分泌特异性抗体细胞株进行扩大培养及冻存，结果见表2。具体方法是首先通过Elisa筛选获得与IL‑11具有高亲和力的抗体株 (OD450nm即为测定的亲和力值)，其中P.C.为采用购买的IL‑11抗体(Abcam,ab130083) 与IL‑11蛋白之间的结合作为阳性对照。其次，通过构建稳表达IL‑11R的细胞株，并用适量的IL‑11蛋白与杂交瘤上清混合后，与稳转表达有IL‑11R的细胞株进行共孵育，最终通过流式检测杂交瘤上清对IL‑11/IL‑11R之间的阻断效果(FITC‑A mean值)，其中N.C.是未加杂交瘤上清检测的值，可以视其为完全没有阻断下的值(Negative control)。表2中下划线表示选定的克隆株，经过多轮亚克隆化，最终得到单个抗体分泌细胞来源的单克隆抗体，其单克隆抗体所检测的亲和力(OD450nm)与流式阻断结果见表3。

[0107] 表2：Elisa亲和实验及流式竞争实验检测结果

[0108]

[0109]

[0110] 注：表2中的N/A表示：无数据

[0111] 表3：Elisa亲和实验及流式竞争实验检测结果

[0112] 样品编号 OD450 FITC Mean 样品编号 OD450 FITC Mean3‑6A4 1.584 3036 3‑5B2‑2G4 1.65 19751
5‑20E11‑5F2 1.596 3109 5‑21G12‑1D3 1.528 3362
5‑20E11‑1A2 1.634 3635 3‑5B2‑7A4 1.636 20958
3‑15D5‑3A6 1.688 10944 3‑9E1‑3A2 1.544 9067
3‑7C9‑1A6 1.601 3148 3‑15D5‑6A1 1.511 13639
3‑2B5‑3D2 1.614 15289 N.C.(流式) N/A 18433

[0113] 注：表3中的N/A表示：无数据；因3‑6A4在亚克隆化后的细胞经测序与亚克隆化前的序列一致，故其编号与表2中的编号相同。

[0114] 实施例4单克隆抗体序列测定

[0115] 取1*10^6～5*10^6个杂交瘤细胞，用Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒提取总RNA，用PrimeScript RT Reagent Kit(Takara公司)试剂盒反转录出cDNA。以上步骤按照厂家提供的说明书进行。抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因扩增引物设计主要参考Ig‑Primer Sets(Novagen公司，货号：69831‑3)中的引物对，由华大基因公司合成。从cDNA第一链中扩增重链可变区和轻链可变区基因，克隆到pMD18‑T载体中，转化大肠杆菌DH5α后，挑取克隆由华大基因公司测序获得重链可变区(VH)和轻链可变区 (VL)基因序列。所用到的引物序列及测序得到的抗体序列另见文档。

[0116] 实施例5抗体亚型鉴定

[0117] 将优选抗体株对应的单克隆杂交瘤细胞株采用常规方法注射到Balb/C小鼠中进行腹水抗体的生产及纯化。利用纯化的抗体进行抗体亚型分析，抗体亚型检测方法采用成熟的试剂盒进行检测(Proteintech,KMIM‑2)，结果如下表4。

[0118] 表4：候选抗体株的抗体亚型鉴定结果

[0119]

[0120] 实施例6优选单克隆抗体表达纯化

[0121] 我们将优选的单抗隆抗体株3‑6A4及5‑20E11‑5F2序列采用基因工程的方法构建至常规的表达载体中，然后在CHO细胞中进行表达。表达完成后采用Protein G层析柱(EzFast Protein G 4FF，博格隆)对收集的细胞培养液进行纯化，平衡液为20mM PBS，0.15M NaCl，pH7.4，洗脱液为0.1M甘氨酸pH3.0±0.2，收集目标吸收峰下蛋白洗脱液，用PBS缓冲液超滤后，取部分样品进行SDS‑PAGE电泳检测，并采用SEC‑HPLC方法测定多聚体含量。抗体的多聚体含量均在3％以内。

[0122] 实施例7优选抗体竞争性阻断IL‑11与IL‑11R结合

[0123] 为了检测优选抗体3‑6A4及5‑20E11‑5F2的竞争结合情况，我们通过在Elisa检测板中包被适量的IL‑11R‑His蛋白，过夜孵育。然后通过加入适量的IL‑11‑Fc蛋白，并与不同浓度梯度的抗体进行共孵育。最后采用HRP耦联的Goat anti IgG‑Fc二抗(ThermoFisher，31413) 及TMB显色底物进行检测。我们检测到优选抗体及6D9A1(Abcam,ab130083)均能不同程度的抑制IL‑11与IL‑11R的结合，结果如图1所示。

[0124] 实施例8优选抗体的交叉反应

[0125] IL‑6细胞因子家族成员包括IL‑6,IL‑11,CNTF,CLC,LIF,CT‑1,OSM,IL‑27,IL‑31。IL‑11  属于IL‑6细胞因子家族成员。我们采用常规Elisa方法包被重组IL‑6 (Sinobiological‑10395‑HNAE),IL‑27(R&D systems,2526‑IL‑010),LIF(Peprotech,300‑
05),CLC (R&D systems,962‑CL‑050),IL‑11(LSBio,LS‑G132887‑10),OSM(Genscript‑z03132),IL‑31 (Peprotech,200‑31),CNTF(R&D systems,257‑NT‑010),CT‑1(R&D systems,612‑CD‑010)蛋白，并检测了优选抗体3‑6A4及5‑20E11‑5F2与IL‑6细胞因子家族成员的结合情况。结果表明优选抗体除与IL‑11细胞因子结合外，不与IL‑6细胞因子家族其他成员发生交叉反应，Elisa结果(OD450nm)如下表5所示。

[0126] 表5：优选抗体株3‑6A4及5‑20E11‑5F2与IL‑6细胞因子家族不同成员的结合检测[0127]

[0128] 实施例9优选IL‑11单克隆抗体与抗原结合的亲和力测定

[0129] 应用生物膜干涉技术(BLI)测定，采用Ni‑NTA传感器捕获抗原IL‑11(His tag)，优选抗体株3‑6A4及5‑20E11‑5F2作为分析物，分析物稀释7个浓度梯度，结合时间为60s，解离时间为1000s。缓冲液为20mM PBS，0.15M NaCl，0.1％BSA，0.05％Tween 20，pH7.4。BLI 动力学/亲和力软件分析，获得优选抗体与对应hu‑IL‑11配体的解离常数(kdis)及亲和力常数(KD)，具体结果见下表6。

[0130] 表6：

[0131]

[0132] 实施例10优选抗体竞争性阻断活性检测

[0133] 为了评估优选Anti‑huIL‑11抗体3‑6A4及5‑20E11‑5F2与IL‑11的结合，以及能否阻断配体与受体间的结合，我们构建了稳定表达IL‑11R的细胞株membrane‑IL‑11R CHO，利用流式方法检测候选抗体及商业化抗体6D9A1(Abcam,ab130083)对IL‑11与IL‑11R的阻断活性。首选适量的带有Fc标签的IL‑11重组蛋白与不同梯度的抗体共孵育15mins，然后再与1E+05 个membrane‑IL‑11R CHO细胞孵育。检测采用的二抗为耦联有FITC荧光基团的二抗 (Goat‑anti‑Fc‑FITC)(Abcam,ab98529)，竞争结合结果表明3‑6A4抗体中和活性IC50约为 
7μg/ml；5‑20E11‑5F2抗体中和活性IC50约为21μg/ml，并且候选抗体的阻断活性明显优于 
6D9A1克隆株抗体的阻断活性，结果如图2所示。

[0134] 实施例11优选抗体株抑制肺成纤维细胞HFL‑1向纤维化转化

[0135] HFL‑1细胞作为肺成纤细胞，当被促纤维化因子如TGF‑beta1诱导后会大量表达IL‑11细胞因子，最终向纤维化转化。当HFL‑1细胞向纤维化转化过种中，标志物ACTA2蛋白会不断累积。在此实例中，我们采用TGF‑beta1细胞因子诱导HFL‑1细胞向纤维化转化的同时加入优选3‑6‑A4、5‑20E11‑1A2及5‑20E11‑5F2抗体株时，培养48h后，收取细胞进行western 检测分析，可以看到不同浓度的抗体均能够抑制HFL‑1细胞向纤维化转化(ACTA2蛋白表达量降低)，如图3、图4及对应的统计分析图5。

[0136] 实施例12优选抗体在C57BL/6小鼠中抑制肺纤维化

[0137] 在由博来霉素诱导C57BL/6小鼠肺纤维化的动物模型中，具体来说，将10周齡的C57BL/6 进行戊巴比妥麻醉剂全身麻醉后，经手术曝露出小鼠肺的主气管，然后采用滴注或雾化的方式向气管内注入适量的博来霉素。小鼠经过七天的博来霉素诱导后，肺部纤维化基本呈现。在第八天时，我们按每隔一天的方式进行注射优选抗体5‑20E11‑5F2或同型对照抗体lgG。连续注射14天后，将小鼠处死取其肺，进行肺部的炎症损伤检测以及纤维化评分检测。此药效模型下，可以看到候选抗体株可以减缓小鼠肺纤维化，结果如图6和图7所示。

[0138] 实施例13优选抗体在Sprague Dawley大鼠中抑制肺纤维化

[0139] 在大鼠中气管内滴注博来霉素是一种广泛用于研究肺纤维化的药效模型，本实验测试了优选抗体在体内降低博来霉素诱导大鼠单侧肺纤维化的能力。

[0140] 将雄性动物分组成九组。采用25mg/kg戊巴比妥钠联合1‑2.5％异氟烷呼吸麻醉维持动物麻醉深度。以博莱霉素气管注射方式诱导纤维化模型，假模型组以等体积生理盐水代替博莱霉素。模型建立第八天，每隔一天给予不同组以不同剂量的优选抗体治疗14天，其中吡啡尼酮(Esbriet)或尼达尼布(Ofev)药物作为治疗的参照(Esbriet与Ofev均采用100毫克/每千克/ 每天)。在治疗结束后，取肺进行免疫组化H&E染色及Masson三染色。小鼠肺的组织学检查发现对照组为正常肺，博来霉素处理的肺中，炎症损伤明显加重，优选抗体能够明显缓解炎症细胞在肺中的浸润见图8(图8，肺组织H&E染色，A为对照组；B为博来霉素诱导组； C为3‑6A4 mAb‑20mg/kg组；D为5‑20E11‑5F2 mAb‑20mg/kg组)。此外优选抗体也很好的缓解肺纤维化进程见图9(图9，肺组织Masson三染色，A为对照组；B为博来霉素诱导组； C为3‑6A4 mAb‑20mg/kg组；D为5‑20E11‑5F2 mAb‑20mg/kg)。统计分析结果显示优选抗体在不同剂量下均能缓解博来霉素引起的大鼠肺的炎症损伤及纤维化进程见图10(图10， ###P<0.001vs.BLM Model；aaP<0.01vs.Ofev；bP<0.05vs.Esbriet,bbbP<0.001vs.Esbriet； cccP<0.001vs.3‑6A4 mAb 30mg/kg)、图11(***P<0.001vs.Sham；##P<0.01vs.BLM Model, ###P<0.001vs.BLM Model.)。

[0141] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。