一种抗CD3的纳米抗体或其抗原结合部分及其制备方法

摘要

本发明公开了一种抗CD3的纳米抗体或其抗原结合部分及其制备方法，所述抗体包含SEQ ID NO.1所示的重链可变区中的互补决定区CDR1‑CDR3。本发明首先构建CD3抗原对羊驼进行四次免疫后，获得羊驼PBMC细胞；其次通过微流控技术对PBMC细胞进行筛选分离；对单个细胞进行RNA的捕获，通过巢氏PCR的方法获得抗体基因片段，构建真核表达载体；然后通过哺乳动物细胞高通量表达系统诱导抗体高通量表达；最后通过ELISA与FACS检测，及测序结果分析获得了具有高的灵敏度和特异性的抗体。该抗体可用于肿瘤和过度性增值疾病的治疗。

权利要求

1.一种抗CD3的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包含如SEQ ID NO.1所示的重链可变区中的互补决定区CDR1‑CDR3。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1的第31‑35位氨基酸。

3.根据权利要求2所述的纳米抗体，其特征在于，所述CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.1的第49‑55位氨基酸。

4.根据权利要求3所述的纳米抗体，其特征在于，所述CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.1的第99‑105位氨基酸。

5.根据权利要求4所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还包含SEQ ID NO.1所示的重链可变区中的框架区FR1‑FR4。

6.根据权利要求5所述的纳米抗体，其特征在于，所述FR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1的第1‑30位氨基酸。

7.根据权利要求6所述的纳米抗体，其特征在于，所述FR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.1的第36‑49位氨基酸。

8.根据权利要求7所述的纳米抗体，其特征在于，所述FR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.1的第67‑98位氨基酸。

9.根据权利要求8所述的纳米抗体，其特征在于，所述FR4的氨基酸序列为SEQ ID NO.1的第106‑116位氨基酸。

10.分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1‑9中任一项所述的纳米抗体。

11.包含权利要求10所述的核酸分子的载体。

12.包含权利要求10所述的核酸分子或权利要求11所述的载体的宿主细胞。

13.一种制备抗CD3的纳米抗体的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求11所述的载体转染至宿主细胞中，培养宿主细胞，分离或回收得到抗CD3纳米抗体。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

15.一种检测CD3的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1‑9中任一项所述的纳米抗体。

16.根据权利要求15所述的产品，其特征在于，所述产品为偶联物或缀合物。

17.根据权利要求16所述的产品，其特征在于，所述偶联物或缀合物包括：

1）权利要求1‑9中任一项所述的纳米抗体；

2）与所述纳米抗体偶联或缀合的诊断剂。

18.根据权利要求17所述的产品，其特征在于，所述诊断剂包括放射性核素、造影剂、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁性离子、酶、光敏诊断剂。

19.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括以下任一项：

1）权利要求1‑9中任一项所述的纳米抗体；

2）一种偶联物或缀合物，所述偶联物或缀合物包括：a）权利要求1‑9中任一项所述的纳米抗体；

b）与所述纳米抗体偶联或缀合的治疗剂。

20.根据权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可用的载体。

21.一种用于非治疗目的地检测样品中CD3存在情况的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将权利要求1‑9中任一项所述的纳米抗体与待测样品接触，通过抗原抗体反应来检测待测样品中CD3的存在情况。

22.权利要求1‑9中任一项所述的纳米抗体、权利要求16中所述的偶联物或缀合物在制备CD3检测产品中的应用。

23.权利要求1‑9中任一项所述的纳米抗体、权利要求19中所述的偶联物或缀合物在制备用于治疗CD3介导的疾病的药物中的用途。

说明书

一种抗CD3的纳米抗体或其抗原结合部分及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及一种抗CD3的抗体及其应用。

背景技术

[0002] CD3分子是T细胞膜上的重要分化抗原，是成熟T细胞的特征性标志。它与T细胞表面受体TCR形成复合物，在细胞内信号转导过程中起着重要作用。CD3抗体可特异性地识别T细胞表面CD3分子，引起T细胞TCR‑CD3复合体的交联，直接产生活化信号，导致T细胞活化并增殖。目前研究表明，CD3抗体在肿瘤治疗中有重要的作用。但是，抗体药物应用存在很多问题，比如研发周期长，生产成本过高；难以大规模生产；稳定性差易降解，贮存成本高；容易被污染，维护成本费用高昂；并具有免疫原性等，限制了其在临床上的应用范围。纳米抗体技术，是生物医学科学家在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术结合纳米科学的概念进行的抗体工程革命，从而研发出的最新和最小的抗体分子。

[0003] 1993年Hamers等报道，羊驼的免疫系统在检测到细菌和病毒等外来入侵者时会产生两种类型的抗体：一种类似于人抗体IgG，另一种相当于普通抗体的十分之一大小，这些较小的抗体称为单域抗体或纳米抗体(即缺失轻链的“重链抗体”)，这种缺失轻链的重链抗体只有很小的片段也能和正常的IgG等抗体一样去结合抗原，并且特异性强亲和力高。纳米抗体具有完整功能的最小的抗原结合片段，其晶体结构呈椭圆形，直径2.5nm，长4nm。纳米抗体在化学组成和形状上比抗体简单许多，不具有化学疏水性，其抗热性和抗酸碱性更强，更容易相互结合或与其他化合物结合，能被单基因编码，容易用微生物合成。纳米抗体对环境具有良好的耐受性，具备高度的构象稳定性，而且分子质量更小，临床的治疗效果更好，同时这些小蛋白分子更容易合成，价格也更低。纳米抗体的独特的性质，使其在疾病的精确诊断和免疫靶向治疗等方面展现了更为广阔的应用前景。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种研发周期短、可大规模生产、稳定性强、不易降解的抗CD3纳米抗体及开发方法，该抗体可用于制备抗肿瘤的药物。

[0005] 本发明采用了如下技术方案：

[0006] 本发明一方面提供了一种抗CD3的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQ ID NO.1所示的重链可变区中的互补决定区CDR1‑CDR3，所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第31‑35位氨基酸；所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第49‑55位氨基酸；所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第99‑105位氨基酸。

[0007] 进一步，所述抗体或其抗原结合部分还包含SEQ ID NO.1所示的重链可变区中的框架区FR1‑FR4，其中所述FR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第1‑30位氨基酸；所述FR2的氨基酸序列为序列表中SEQ IDNo.1的第36‑49位氨基酸；所述FR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第67‑98位氨基酸；所述FR4的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的第106‑116位氨基酸。

[0008] 进一步，所述抗体为纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

[0009] 本发明另一方面提供了一种分离的核酸分子，其编码前面所述的抗体或其抗原结合部分，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0010] 一旦获得编码VH区段的DNA片段，进一步通过标准重组DNA技术操作这些DNA片段，以例，如将可变区基因转变为全长抗体链基因、或抗原结合部分DNA片段。在这些操作中，将编码VH的DNA片段可操作的连接至编码另一蛋白质，诸如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。术语“可操作的连接”在用于本文时意图表示连接两DNA片段从而使得这两个DNA片段所编码的氨基酸序列保持在同一读码框中(in‑frame)。

[0011] 通过将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子可以将编码VH区的分离的DNA转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的。

[0012] 本发明另一方面提供了前面所述的核酸分子的载体。

[0013] 可用于本发明的载体包括质粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。可选用本领域已知的各种载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明的抗体的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成表达载体。

[0014] 本发明另一方面提供了前面所述的核酸分子或所述的载体的宿主细胞。

[0015] 可用于本发明的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。用于表达抗体的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、COS细胞、CHO细胞等。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是哺乳动物细胞，最佳的是HEK‑293T细胞或CHO细胞。

[0016] 本发明另一方面提供了一种制备抗CD3的抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括以下任一项：

[0017] 1)一种制备抗CD3的抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法是将前面所述的载体转染至宿主细胞中，培养宿主细胞，分离或回收抗CD3抗体。

[0018] 进一步，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

[0019] 2)一种基于SCMES(单克隆哺乳动物细胞表达筛选系统)平台开发抗CD3的抗体抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法步骤如下：

[0020] a)CD3抗原对羊驼进行免疫后，获得羊驼PBMC细胞；

[0021] b)通过液滴微流控技术对PBMC细胞进行分选，获得能够结合CD3抗原的有功能的抗体分泌细胞；

[0022] c)对分选获得的能够结合CD3抗原的有功能的抗体分泌细胞RNA捕获，通过PCR方法获得抗体基因片段，构建真核表达载体；

[0023] d)通过哺乳动物细胞高通量表达系统诱导抗CD3抗体高通量表达；

[0024] e)通过抗体检测技术及测序结果分析获得抗CD3抗体。

[0025] 进一步，所述PCR方法为巢氏PCR方法。

[0026] 进一步，所述抗体检测技术为ELISA或FACS检测。

[0027] 本发明另一方面提供了一种检测CD3的产品，所述产品包括前面所述的抗体或其抗原结合部分。

[0028] 所述功能性连接包括例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式连接。

[0029] 进一步，所述产品可为偶联物或缀合物，所述偶联物或缀合物包括：

[0030] 1)前面所述的抗体或其抗原结合部分；

[0031] 2)与前面所述抗体或其抗原结合部分偶联或缀合的诊断剂；

[0032] 进一步，所述诊断剂包括放射性核素、造影剂、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁性离子、酶、光敏诊断剂。

[0033] 可用于本发明的顺磁性离子包括：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)。

[0034] 可用于本发明的荧光剂包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。

[0035] 可用于本发明的化学发光剂包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。

[0036] 可用于本发明的生物发光剂包括荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。

[0037] 可用于本发明的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β‑D‑半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

[0038] 所述产品的具体实例包括试剂盒。所述试剂盒中还包括固相载体，前面所述抗体被固定于固相载体(如多孔板、盖玻片、微珠)或游离存在。

[0039] 本发明另一方面提供了一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括以下任一项：

[0040] 1)前面所述的抗体或其抗原结合部分；

[0041] 2)一种偶联物或缀合物，所述偶联物或缀合物包括：

[0042] a)前面所述的抗体或其抗原结合部分；

[0043] b)与前面所述的抗体或其抗原结合部分偶联或缀合的治疗剂。

[0044] 所述治疗剂包括细胞毒素、药物、放射性核素。

[0045] 细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素，依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1‑去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，及其类似物或同系物。

[0046] 治疗剂还包括例如抗代谢物类(例如甲氨蝶呤、6‑巯基嘌呤、6‑硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5‑氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine)、烷化剂类(例如双氯乙基甲胺、塞替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C、和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素类(例如放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素、和氨茴霉素(AMC)、和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)duocarmycin、加利车霉素、美登素和auristatin及其衍生物。

[0047] 利用本领域现有的接头技术可以将细胞毒素偶联至本发明的抗体。已经用于将细胞毒素偶联至抗体的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。

[0048] 本发明的抗体还可以与放射性同位素偶联以生成细胞毒性放射性药物。可以与抗131 111 90 177
体偶联以用于治疗的放射性同位素的实例包括但不限于碘 、铟 、钇 和镥 。

[0049] 可用于本发明的放射性核素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68 86 90 89 94m 94 99m 120 123 124 125 131 154‑158 32 11 13 15 186
Ga、Y、Y、Zr、 Tc、Tc、 Tc、 I、 I、 I、 I、 I、 Gd、F、C、N、O、 Re
188 51 52m 55 72 75 76 82m 83
、 Re、Mn、 Mn、Co、As、Br、Br、 Rb、Sr或其它γ发射体、β发射体或正电子发射体。

[0050] 进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

[0051] 在用于本文时，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、等等生理学相容的载体。优选的是，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据施用路径，活性成分(抗体或其抗原结合部分、偶联物/缀合物或双特异性分子)，可以包被在一种物质中，以保护活性成分不受酸和可以使该活性成分失活的其它天然条件的作用。

[0052] 本发明另一方面提供了一种用于非治疗目的的检测样品中CD3存在情况的方法，所述方法包括以下步骤：前面所述的抗体或其抗原结合部分作为CD3的检测抗体，通过抗原抗体反应来检测待测样品中CD3的存在情况。

[0053] 所述CD3序列是全长或以下两段活性成分，所述两段活性成份来自公开数据库：Asp 23‑Asp 126(CD3E)：Accession P07766‑1(CD3E)；Phe 22‑Ala 105(CD3D)：Accession P04234‑1(CD3D)。

[0054] 所述方法包括利用酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法、放射免疫法、发光免疫测定法、胶体金免疫层析法、凝集法、免疫比浊法检测抗原抗体的反应。

[0055] 本发明另一方面提供了一种应用，其包含以下任一项所述的应用：

[0056] 1)前面所述的抗体或其抗原结合部分前面所述的连接诊断剂的偶联物或缀合物在制备CD3检测产品中的应用；

[0057] 2)前面所述抗体或其抗原结合部分、前面所述的连接治疗剂的偶联物或缀合物在制备用于治疗CD3介导的疾病的药物中的用途；

[0058] 本文所述的CD3介导的疾病包括过度增殖性疾病，特别地涉及任何组织或器官的癌症，特别地用于治疗头部、颈部、乳房、肝脏、皮肤、胃、膀胱、肾、食道、妇科、支气管、鼻咽、甲状腺、前列腺、结直肠、卵巢、胰腺、肺的癌和纤维肉瘤。

[0059] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的所述纳米抗体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的所述纳米抗体的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码所述纳米抗体，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

[0060] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

[0061] 上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。

[0062] 在本申请中，术语“纳米抗体”是指缺失轻链的重链抗体(如：来源于骆驼体内)克隆其可变区得到的单域抗体，是最小的功能性抗原结合片段，相对分子质量(Mr)仅约为15000。纳米抗体具有分子质量小、稳定性强、可溶性好、易表达，免疫原性低等特点。

[0063] 在本申请中，术语“抗原结合部分”通常是指一个与抗原结合或与抗原结合(即特异性结合)的完整抗体(即与它们所衍生的完整抗体)竞争的免疫球蛋白或抗体的多肽片段。所述抗原结合片段可以包括但不限于：Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段，线性抗体，单链抗体，双体抗体，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

附图说明

[0064] 图1显示4免后的抗血清效价的结果图；

[0065] 图2显示抗CD3抗体cDNA巢氏PCR目的片段的结果图，其中A是第一次PCR获得的目的条带图，B是第二次PCR获得的目的条带图；

[0066] 图3显示单克隆ELISA结果图；

[0067] 图4显示FACS阳性抗体检测结果图；

[0068] 图5显示表达纯化后的FACS阳性抗体进行抗CD3结合实验图。

具体实施方式

[0069] 下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

[0070] 下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0071] 本发明首先构建CD3抗原对羊驼进行四次免疫后，获得羊驼PBMC细胞；其次通过微流控技术对PBMC细胞进行筛选分离；对单个细胞进行RNA的捕获，通过巢氏PCR的方法获得抗体基因片段，构建真核表达载体；然后通过哺乳动物细胞高通量表达系统诱导抗体高通量表达；最后通过ELISA与FACS检测，及测序结果分析获得了具有高的灵敏度和特异性的抗体。

[0072] 实施例1制备CD3免疫原

[0073] 1、制备免疫原

[0074] 我们依据CD3的蛋白序列和基因序列信息，CD3序列是来自公开数据库，Asp 23‑Asp 126(CD3E)：Accession P07766‑1(CD3E)；Phe 22‑Ala 105(CD3D)：Accession P04234‑1(CD3D)，分析并设计了可有效诱导羊驼产生针对human CD3的特异性抗体，在C端连接His‑tag用于后续纯化及检测。

[0075] 实施例2羊驼免疫与获得抗血清

[0076] 1、羊驼免疫与获得抗血清

[0077] 用200μg human CD3/His蛋白与200μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对羊驼进行初免，在第21天、42天、63天用human CD3/His蛋白与200μl弗氏不完全佐剂加强免疫3次，每次免疫1周后，采血检测Anti‑CD3/His血清滴度；第4次免疫1周后，采血50ml用于微流控平台进行单细胞分选。

[0078] Anti‑CD3/His血清效价通过ELISA检测，用浓度为2μg/ml的CD3/His蛋白包被酶标板，每孔加入2倍梯度稀释的血清或者纯化的抗体100μl(对照为免疫前羊驼血清)，37℃孵育1.5h，洗涤2次，每孔加入1：10000稀释的辣根过氧化物酶标记的Goat anti‑Alpaca IgG(H+L)二抗，37℃孵育1h，洗涤5次后，加100μl TMB底物，37℃孵育10min，50μl 0.1M的H2SO4中止反应测定OD450nm。ELISA检测血清效价规定为在OD450nm是空白对照的2倍以上的，结果如图1所示，图1所示为4免后的抗血清效价为102400。由此可见，该抗原可诱导羊驼产生特异性针对CD3蛋白的高滴度抗血清。

[0079] 实施例3构建及筛选VHH单克隆表达库构建及筛选

[0080] 1、VHH单克隆表达库构建及筛选：

[0081] 1)分选细胞：

[0082] 第4次免疫1周后，采血50ml用于微流控平台进行有功能的抗体分泌细胞分选，液滴微流控技术可以将细胞与抗原包裹在一个个皮升级别的单分散油滴中，可以达到每秒数千个单分散液滴的生成速度，获取单细胞每个微液滴都是独立的，实现了细胞与细胞之间的环境独立，互不交叉污染；在油滴内通过荧光标记的羊驼二抗去识别VHH，同时如果细胞分泌的VHH抗体能够识别荧光标记的抗原，就能形成FRET信号而被分选出来，筛选得到可以分泌VHH有结合活性的B细胞。

[0083] 2)建库：

[0084] 利用磁珠提取RNA，并利用oligo(dT)反转为cDNA，通过引物扩增，以及分子克隆等技术，目的片段克隆结果如图2(部分结果)；将羊驼的VHH基因克隆至真核表达载体中，转化感受态细胞，得到VHH单克隆表达库。为了进一步鉴定CD3‑VHH单克隆表达库是否构建成功，在涂的单克隆菌板中，挑选10个克隆进行测序，测序结果显示，阳性克隆率和序列多样性为100％；比对结果显示，差异序列大多在CDR结合区。经检测，该构建得到一个CD3‑VHH单克隆表达库。

[0085] 3)提质粒：

[0086] CD3‑VHH单克隆表达库涂的菌板，挑取单克隆菌落至96孔深孔板中，37℃震荡摇床800r/min培养8h；将培养菌液的96孔深孔板置于水平离心机中，4000r/min离心10min，弃掉上清，加入300μL溶液Ι，震荡将菌体均匀悬起；再加入300μL溶液Ⅱ，温和并充分的上下颠倒
4‑6次混合均匀使菌液充分裂解，直至形成透亮的溶液；最后加入400μL溶液Ⅲ，温和并充分的上下颠倒6‑8次，4000r/min离心10min；离心后每孔吸取800μL上清至96孔过滤板中(过滤板下接96孔深孔板)，4000r/min离心2min；收集滤液每孔加入300μL异丙醇，4000r/min离心
15min，弃掉上清；每孔加入500μL 70％无水乙醇，4000r/min离心10min，弃掉上清；96孔深孔板放置室温晾干乙醇，每孔加入70μL ddH2O，震荡混匀后测质粒浓度。

[0087] 4)细胞转染与筛选：

[0088] 将无抗培养液DMEM分别加入到96孔细胞培养板中，每孔75μl。每孔分别加入10μl质粒(对应相应质粒位置不要串孔)；一共转染10板96细胞版，需配制至少75mL转染试剂(1mL的PEI加入到75mL DMEM培养基中)，加好质粒的96孔细胞培养板中每孔再加入75μl DMEM稀释的PEI转染试剂；将质粒与转染试剂室温共孵育15min；准备转染试剂期间将细胞状态良好的HEK‑293T细胞用0.05％胰酶消化，2.4％FBS的DMEM(含1％双抗)重新悬浮细胞4
吹散计数；将细胞悬液逐滴加入对应的96孔细胞培养板中，每孔5*10个细胞共加入100μL细胞悬液,37℃、5％CO2细胞培养箱内培养，连续培养72h。转染后的细胞上清与CD3蛋白进行结合检测。单克隆ELISA结果显示，十板96孔细胞板共960个单克隆得到396个阳性克隆(如图3所示，部分结果展示)，并将这些序列进行测序比对剔除重复序列。为了进一步验证文库中结合CD3‑VHH蛋白的阳性抗体，将细胞上清进行流式细胞术检测，结果显示，396个ELISA阳性克隆中有15个FACS阳性抗体(如图4所示，部分结果展示)。将FACS阳性抗体检测结果进行表达纯化后进行Cell binding assay检测，结果显示通过Cell binding assay筛选最终获得1个VHH抗体的Emax明显高于对照抗体(如图5所示)，该VHH抗体为ANb27‑M249‑
4M‑905，VHH抗体的序列如SEQ ID No.1所示。纳米抗体经ELISA及流式细胞术验证，获得了具有高的灵敏度和特异性的抗体。

[0089] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。