一种大规模纯化抗PD-1抗体的方法转让专利
申请号 : CN202211206682.2
文献号 : CN115286716B
文献日 : 2023-02-03
发明人 : 卢伟强 , 徐传学 , 李文 , 王加俊 , 龙杰 , 王玉倩 , 闫少羽 , 隋东虎 , 白莉惠 , 朱吉满
申请人 : 广州誉衡生物科技有限公司
摘要 :
本发明涉及一种大规模纯化抗PD‑1抗体的方法，具体包括如下步骤：（1）取含有抗PD‑1抗体的细胞上清液，并澄清过滤；（2）亲和层析；（3）低pH病毒孵育；（4）中间深层过滤；（5）阳离子层析；（6）阴离子层析；（7）除病毒过滤。通过优化亲和层析、阳离子层析和阴离子层析的参数，成功将抗PD‑1抗体纯化规模放大到了200L，三批总体纯化收率相似，工艺质量参数稳定，抗体产品纯度高，适用于抗PD‑1抗体的商业化大规模生产，显著降低了生产成本。
权利要求 :
1.一种大规模纯化抗PD‑1抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取含有抗PD‑1抗体的细胞上清液，并澄清过滤；
（2）将步骤（1）得到的澄清过滤收集液经亲和层析，收集洗脱液；
（3）将步骤（2）得到的洗脱液进行低pH病毒孵育；
（4）步骤（3）处理后的体系经中间深层过滤得过滤溶液；
（5）将步骤（4）得到的过滤溶液经阳离子层析，收集洗脱液；
（6）将步骤（5）得到的洗脱液经阴离子层析，收集上样流穿液；
（7）将步骤（6）得到的上样流穿液进行除病毒过滤即得纯化后的抗PD‑1抗体；
步骤（2）中，所述的亲和层析，包括平衡、上样、第一淋洗、第二淋洗、第三淋洗、洗脱的操作；其中，平衡缓冲液为70 mM Tris‑HAc，120 mM NaCl，pH 7.0；第一淋洗缓冲液为70 mM Tris‑HAc，120 mM NaCl，pH 7.0；第二淋洗缓冲液为70 mM NaAc‑HAc，1 M NaCl，pH 5.6；第三淋洗缓冲液为70 mM NaAc‑HAc，pH 5.5；洗脱缓冲液为70 mM NaAc‑HAc，pH 3.7；上样载量为18‑37 g/L；
步骤（5）中，所述的阳离子层析，包括平衡、上样、淋洗和洗脱的操作；其中，平衡缓冲液和淋洗缓冲液为70 mM NaAc‑HAc, pH 5.0；洗脱缓冲液为70 mM NaAc‑HAc, pH 6.6；上样载量为30‑50 g/L；
步骤（6）中，所述的阴离子层析，包括预平衡、平衡、上样、淋洗和洗脱的操作；其中，预平衡缓冲液为700 mM NaAc‑HAc，pH 5.5，平衡缓冲液和淋洗缓冲液为70mM NaAc‑HAc, pH
5.8；上样载量为80‑120 g/L；上样样品pH值5.7‑6.1，样品电导值2‑4mS/cm；
步骤（1）中，所述的澄清过滤为通过Millipore的D0HC深层过滤器和Millipore的30英寸0.5/0.2 μm囊式过滤器过滤；澄清过滤后得到的收集液中，抗PD‑1抗体的浓度范围为
9.0‑10.0 g/L；
步骤（2）中，所述的亲和层析为proteinA亲和层析，其层析柱填料采用MabSelect SuRe作为亲和介质；
步骤（3）中，所述的低pH病毒孵育为pH 3.6‑3.8、15‑25℃下孵育60‑240 min，再进行病毒灭活，灭活结束后调节pH至4.9‑5.1；
步骤（4）中，所述的中间深层过滤为室温下采用Millipore的A1HC深层过滤器过滤后，使用Millipore的20英寸0.5/0.2 μm囊式过滤器过滤；
步骤（5）中，所述的阳离子层析，其层析柱采用POROS XS作为层析填料，以结合/洗脱的方式在室温下将中间深层过滤得到的过滤溶液进行阳离子层析；
步骤（6）中，所述的阴离子层析，其层析柱采用POROS 50HQ作为层析填料，以流穿模式在室温下将阳离子层析洗脱液进行阴离子层析，并回收产品；
步骤（7）中，所述的除病毒过滤，使用Modus 1.3除病毒预过滤器和Micro 1.3除病毒过滤器对阴离子层析上样流穿液进行病毒过滤；平衡缓冲液和病毒过滤后冲洗系统为60‑80 mM NaAc‑HAc, pH 5.5‑6.1；
其中，所述的大规模为200L以上规模。
说明书 :
一种大规模纯化抗PD‑1抗体的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大规模纯化抗PD‑1抗体的方法。
背景技术
[0002] 抗体药是近几年来迅速发展的一种生物药，随着新药品种在市场份额的不断增加，在癌症和自身免疫疾病等疾病的治疗上发挥着越来越重要的角色。治疗性抗体药物由于对其纯度有极其高要求，才能确保其注射液对患者身体的安全。对于整个生物药行业来说，工业级纯化获得的生物抗体药具有重要的经济效益。抗PD‑1抗体作为备受瞩目的一类抗体，目前有多家海内外公司在进行相关的开发，由于该抗体安全性良好，已报道的临床研究结果显示其对某些肿瘤具有显著的抑制作用。
[0003] 现有技术中对于抗体的纯化工艺一般涉及多个步骤，常见步骤有亲和层析、低pH病毒孵育、中间深层过滤、阳离子层析、阴离子层析和除病毒过滤等，每个步骤都有其特定的目的和作用，最终得到高纯度的抗体。由于抗体类药物分子的理化性质相似，所以每个公司根据自身条件，将多种纯化步骤串联使用，建立自己的抗体纯化平台，以保障平台工艺的稳定和纯化收率的高效。但是由于大规模放大是多数企业的瓶颈所在，导致生产规模一般维持在50‑100L，无法实现更大的经济效益。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种大规模纯化PD‑1抗体的方法。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种大规模纯化抗PD‑1抗体的方法，具体包括以下步骤：
[0006] （1）取含有抗PD‑1抗体的细胞上清液，并澄清过滤；
[0007] （2）将步骤（1）得到的澄清过滤收集液经亲和层析，收集洗脱液；
[0008] （3）将步骤（2）得到的洗脱液进行低pH病毒孵育；
[0009] （4）步骤（3）处理后的体系经中间深层过滤得过滤溶液；
[0010] （5）将步骤（4）得到的过滤溶液经阳离子层析，收集洗脱液；
[0011] （6）将步骤（5）得到的洗脱液经阴离子层析，收集上样流穿液；
[0012] （7）将步骤（6）得到的上样流穿液进行除病毒过滤即得纯化后的抗PD‑1抗体。
[0013] 其中，步骤（2）中，所述的亲和层析，包括平衡、上样、第一淋洗、第二淋洗、第三淋洗、洗脱的操作；其中，第二淋洗缓冲液配方为60‑80 mM NaAc‑HAc，0.9‑1.1 M NaCl，pH 5.3‑5.8；洗脱缓冲液配方为60‑80 mM NaAc‑HAc, pH 3.5‑3.8；上样载量为18‑38 g/L；
[0014] 优选的，第二淋洗缓冲液配方为70 mM NaAc‑HAc，1 M NaCl，pH 5.6；洗脱缓冲液配方为70 mM NaAc‑HAc, pH 3.7；上样载量为28 g/L。
[0015] 其中，步骤（5）中，所述的阳离子层析，包括平衡、上样、淋洗和洗脱的操作；其中，平衡缓冲液和淋洗缓冲液配方为60‑80 mM NaAc‑HAc, pH 4.9‑5.2；洗脱缓冲液配方为60‑80 mM NaAc‑HAc, pH 6.4‑6.7；上样载量为28‑52 g/L；
[0016] 优选的，平衡缓冲液和淋洗缓冲液配方为70 mM NaAc‑HAc, pH 5.0；洗脱缓冲液配方为70 mM NaAc‑HAc, pH 6.6；上样载量为40 g/L。
[0017] 其中，步骤（6）中，所述的阴离子层析，包括平衡、上样和淋洗的操作；其中，平衡缓冲液和淋洗缓冲液配方为60‑80 mM NaAc‑HAc, pH 5.5‑6.1；上样载量为80‑135 g/L；
[0018] 优选的，平衡缓冲液和淋洗缓冲液配方为70 mM NaAc‑HAc, pH 5.8；上样载量为110 g/L。
[0019] 其中，所述的大规模为200L以上规模，优选的大规模为200L。
[0020] 其中，步骤（1）中，所述的抗PD‑1抗体，是一种新型抗PD‑1抗体，其能够阻断PD‑1配体与程序性死亡分子1(PD‑1)的结合，因此阻断PD‑1配体对表达PD‑1的T细胞的抑制作用（该抗PD‑1抗体详细的构建过程已公开在专利CN106432494B中）。
[0021] 其中，步骤（1）中，所述的澄清过滤具体为：将生产培养达到收获标准（培养到14天或者细胞密度低于60%的时候）后获得的澄清收获液通过深层过滤器和囊式过滤器过滤，并保存在相应的容器中。
[0022] 具体的，澄清过滤是为了过滤去除细胞培养过程中的CHO细胞和细胞碎片，利于下面的纯化操作。
[0023] 具体的，上述深层过滤器为Millipore的D0HC深层过滤器、科百特的PurciseSAF滤器L20，囊式过滤器为Millipore的30英寸0.5/0.2 μm囊式过滤器，优选的为Millipore的D0HC深层过滤器（货号MD0HC）和Millipore的30英寸0.5/0.2 μm囊式过滤器（货号KHGEA）。
[0024] 其中，步骤（2）中，所述的亲和层析为proteinA亲和层析，其层析柱填料采用Cytiva的MabSelect SuRe（货号：17‑5438）作为亲和介质。
[0025] 具体的，该介质由刚性的、高流速的琼脂糖基架和耐碱蛋白A配基组成。经过工程改造的蛋白A配基在碱性条件下，比传统的蛋白A配基稳定性更好，提高了工艺的经济性和产品质量。亲和层析中工艺溶液在室温下进行上柱，蛋白结合到填料上，同时大多数工艺相关杂质，如宿主蛋白（HCP）、宿主DNA和其他澄清收获液成分流穿。
[0026] 其中，步骤（2）中，所述的亲和层析是生产纯化过程中的第一步工艺。层析柱首先用第一漂洗缓冲液70 mM Tris‑HAc, 120 mM NaCl, pH 7.0漂洗去除柱保存缓冲液，使用前经0.1 M NaOH消毒，然后用平衡缓冲液70 mM Tris‑HAc,120 mM NaCl, pH 7.0平衡以准备上样。将澄清收获液进行亲和上样；首先用第一淋洗缓冲液70 mM Tris‑HAc,120 mM NaCl, pH 7.0淋洗，然后再用第二淋洗缓冲液为70 mM NaAc‑HAc,0.9‑1.1 M NaCl, pH 5.3‑5.8淋洗，最后再用第三淋洗缓冲液70 mM NaAc‑HAc, pH 5.5淋洗。用洗脱缓冲液60‑
80 mM NaAc‑HAc, pH 3.5‑3.8进行洗脱。洗脱完成后，用1 M HAc对亲和层析柱进行再生、再用第二漂洗缓冲液70 mM Tris‑HAc, 120 mM NaCl, pH 7.0漂洗处理；然后使用前经消毒和平衡进入下一个循环，直至整个收获液完成纯化。直到最后一个循环结束，层析柱先用
0.1 M NaOH溶液进行使用后消毒，再用第三漂洗缓冲液70 mM Tris‑HAc, 120 mM NaCl, pH 7.0进行漂洗，最后保存在20%乙醇中。AKTA使用1 M NaOH 消毒后，保存在0.1 M NaOH溶液中。
80 mM NaAc‑HAc, pH 3.5‑3.8进行洗脱。洗脱完成后，用1 M HAc对亲和层析柱进行再生、再用第二漂洗缓冲液70 mM Tris‑HAc, 120 mM NaCl, pH 7.0漂洗处理；然后使用前经消毒和平衡进入下一个循环，直至整个收获液完成纯化。直到最后一个循环结束，层析柱先用
0.1 M NaOH溶液进行使用后消毒，再用第三漂洗缓冲液70 mM Tris‑HAc, 120 mM NaCl, pH 7.0进行漂洗，最后保存在20%乙醇中。AKTA使用1 M NaOH 消毒后，保存在0.1 M NaOH溶液中。
[0027] 优选的，平衡缓冲液为70 mM Tris‑HAc,120 mM NaCl, pH 7.0，第一淋洗缓冲液为70 mM Tris‑HAc,120 mM NaCl, pH 7.0，第二淋洗缓冲液为70 mM NaAc‑HAc,1 M NaCl, pH 5.6，第三淋洗缓冲液为70 mM NaAc‑HAc pH 5.5，洗脱缓冲液为70 mM NaAc‑HAc, pH 3.7。
[0028] 其中，步骤（2）中，所述的亲和层析，其亲和层析柱的装柱方法为：亲和填料首先用注射用水进行三次置换以移除填料原来的保存缓冲液，然后测量匀浆中填料浓度。取出柱头，排空层析柱底部筛网的气泡，混匀容器中的填料，转移所需填料混悬液到层析柱中。待填料沉降到上层溶液澄清后，将柱头放入柱子中开始装柱。设置初始线性流速≤60 cm/h，柱床稳定后，降低柱头，提高流速直至达到柱床目标高度。
[0029] 其中，步骤（3）中，所述的低pH病毒孵育具体为：在完成亲和层析后，每个循环的亲和层析洗脱液会单独收集在一次性使用的液体混匀袋中，根据需要添加1 M HAc调整pH值，在15‑25℃温度条件下，在pH 3.6‑3.8孵育60‑240 min进行病毒灭活。灭活结束后，病毒灭活中间产品用1 M Tris‑HCl, pH 9.0调节pH至4.9‑5.1。
[0030] 其中，步骤（4）中，所述的中间深层过滤的主要功能为去除不溶性颗粒和杂质，例如宿主蛋白（HCP）、聚集体、残留Protein A和DNA。
[0031] 具体的，亲和收集液经过低pH病毒灭活后，调节pH至4.9‑5.1，可发生沉淀。采用深层过滤器过滤去除沉淀后，对中间深层过滤收集液再使用囊式过滤器过滤。
[0032] 具体的，上述深层过滤器为Millipore的A1HC深层过滤器、科百特的PurciseSAF滤器L10，囊式过滤器为Millipore 的20英寸0.5/0.2 μm囊式过滤器，优选的为Millipore的A1HC深层过滤器（货号MA1HC）和Millipore 的20英寸0.5/0.2 μm囊式过滤器（货号KHGEA）。
[0033] 其中，步骤（5）中，所述的阳离子层析，其层析柱采用Life Tech 的POROS XS（货号1‑2559）作为层析填料。
[0034] 具体的，填料由刚性交联的聚苯乙烯二乙烯苯和荷负电荷的璜丙基配基组成。阳离子交换层析工艺是在中间深层过滤后，进一步纯化蛋白，去除工艺和产品相关杂质及污染物的纯化步骤。
[0035] 其中，步骤（5）中，所述的阳离子层析（CEX）是生产工艺中第二个层析步骤。阳离子层析以结合/洗脱的方式在室温下将中间深层过滤的溶液进行阳蛋白纯化。阳离子层析柱首先经使用前1M NaOH消毒，然后用平衡缓冲液60‑80 mM NaAc‑HAc, pH 4.9‑5.2平衡，准备上样。上样结束后，层析柱首先用淋洗缓冲液60‑80 mM NaAc‑HAc, pH 4.9‑5.2淋洗，然后再用洗脱缓冲液60‑80 mM NaAc‑HAc, pH 6.4‑6.7进行洗脱。在产品洗脱完成后，层析柱经再生，使用前消毒和平衡处理后进入下一个循环，直至整个上样样品纯化完成。直到最后一个循环洗脱结束，层析柱经70 mM NaAc‑HAc, 1 M NaCl, pH 5.5再生和使用后1M NaOH消毒处理后，最后保存于0.1 M NaOH缓冲液中。AKTA Process使用1 M NaOH消毒后，用0.1 M NaOH保存。阳离子收集液使用Millipore的20英寸0.5/0.2 μm囊式过滤器（货号KHGEA）过滤。
[0036] 优选的，上述阳离子层析所用的平衡缓冲液和淋洗缓冲液均采用70 mM NaAc‑HAc, pH 5.0，洗脱缓冲液采用70 mM NaAc‑HAc, pH 6.6。
[0037] 其中，步骤（5）中，所述的阳离子层析，其阳离子层析柱的装柱方法为：层析填料首先用注射用水进行三次置换以移除填料原来的保存缓冲液，然后测定填料匀浆浓度。取出柱头，排空层析柱底部筛网的气泡，混匀容器中的填料，转移所需填料混悬液到层析柱中。待填料沉降到上层溶液澄清后，将柱头放入柱子中开始装柱。高流速直至达到柱床目标高度。
[0038] 其中，步骤（6）中，所述的阴离子层析，其层析柱采用Life Tech的POROS 50HQ（货号4404334）作为层析填料。
[0039] 具体的，填料由刚性交联的聚苯乙烯二乙烯苯基架和季铵化聚乙烯亚胺配基组成。阴离子交换层析工艺主要是在阳离子交换层析工艺后，进一步纯化蛋白，去除工艺和产品相关杂质及污染物。
[0040] 其中，步骤（6）中，所述的阴离子层析（AEX）是生产工艺中第三个层析步骤。阴离子层析以流穿模式在室温下将阳离子层析洗脱液进行蛋白纯化。层析柱首先经使用前1 M NaOH消毒，然后先用预平衡缓冲液700 mM NaAc‑HAc, pH 5.5预平衡、再用平衡缓冲液60‑80 mM NaAc‑HAc, pH 5.5‑6.1平衡，准备上样。在上样过程中，蛋白流过层析柱，而带负电荷的杂质则与层析柱结合。上样结束后，用淋洗缓冲液60‑80 mM NaAc‑HAc, pH 5.5‑6.1淋洗层析柱，回收层析柱中未结合的产品。产品收集结束后，AEX柱经再生，漂洗、使用前消毒、预平衡和平衡进入下一循环，直至整个AEX上样样品纯化完成。生产活动结束后，用1 M NaOH对层析柱进行使用后消毒，最后保存在10 mM NaOH中。AKTA Process用1 M NaOH消毒后，保存0.1 M NaOH溶液中。
[0041] 优选的，上述阴离子层析所用的预平衡缓冲液采用700 mM NaAc‑HAc, pH 5.5，平衡缓冲液和淋洗缓冲液均采用70 mM NaAc‑HAc, pH 5.8。
[0042] 其中，步骤（6）中，所述的阴离子层析，其阴离子层析柱的装柱方法为：层析填料首先用注射用水进行三次置换以移除填料原来的保存缓冲液，然后测定填料匀浆浓度。取出柱头，排空层析柱底部筛网的气泡，混匀容器中的填料，转移所需填料混悬液到层析柱中。待填料沉降到上层溶液澄清后，将柱头放入柱子中开始装柱。高流速直至达到柱床目标高度。
[0043] 其中，步骤（7）中，所述的除病毒过滤是基于大小拦截的原理进行病毒清除的步骤。
[0044] 具体的，使用Modus 1.3除病毒预过滤器（货号VPPS）和Modus 1.3除病毒过滤器（货号VPMD）对阴离子收集液进行病毒过滤。病毒过滤预过滤器首先用注射用水漂洗，然后用注射用水漂洗预过滤器和病毒过滤器，最后用60‑80 mM NaAc‑HAc, pH 5.5‑6.1缓冲液平衡病毒预过滤器和病毒过滤器。在产品过滤过程中，在一定的压差(△P)下通过病毒过滤器，同时潜在的病毒被截留。将病毒过滤后产品收集到收集袋中，用60‑80 mM NaAc‑HAc, pH 5.5‑6.1冲洗系统，收集保留在系统的产品。病毒过滤收集液使用Millipore 的20英寸0.5/0.2 μm囊式过滤器（货号KHGEA）过滤。
[0045] 优选的，平衡缓冲液和病毒过滤后冲洗系统均采用70 mM NaAc‑HAc, pH 5.8。
[0046] 有益效果：
[0047] （1）本发明提供的纯化抗PD‑1抗体的方法工艺简单，稳定性好，生产的抗体产品纯度高。
[0048] （2）相对于50‑100L的生产规模，本发明通过优化亲和层析、阳离子层析和阴离子层析参数，成功将抗PD‑1抗体纯化规模放大到了200L。
[0049] （3）通过一系列实验结果的测定，该工艺流程下纯化的产品质量参数稳定，可以应用于商业化大规模生产，在显著降低生产成本的同时，可进一步提升公司效益。
附图说明
[0050] 下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
[0051] 图1为不同批次间各个工序SEC‑HPLC单体（%）趋势图。
[0052] 图2为不同批次间各个工序CEX‑HPLC主峰（%）趋势图。
[0053] 图3为不同批次间各个工序还原性CE‑SDS纯度（%）趋势图。
[0054] 图4为不同批次间各个工序非还原性CE‑SDS纯度（%）趋势图。
[0055] 图5为亲和层析DoE研究总结图。
[0056] 图6为阳离子层析DoE研究总结图。
[0057] 图7为阴离子层析DoE研究总结图。
具体实施方式
[0058] 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0059] 本发明中所述的第一漂洗与漂洗1、第一淋洗与淋洗1、第二淋洗与淋洗2、第三淋洗与淋洗3、第二漂洗与漂洗2、第三漂洗与漂洗3所表述的意思相同。
[0060] 实施例1 纯化抗PD‑1抗体的工艺
[0061] （1）将生产培养达到收获标准（收获标准：培养14天或者细胞密度低于60%的时候）后获得的含有抗PD‑1抗体的细胞上清液，并通过Millipore的D0HC深层过滤器（货号MD0HC）和Millipore的30英寸0.5/0.2 μm囊式过滤器（货号KHGEA）澄清过滤，并保存。
[0062] （2）亲和层析：将澄清过滤收集液（浓度9.0‑10.0 g/L）上样至MabSelect SuRe层析柱。层析柱首先用第一漂洗缓冲液70 mM Tris‑HAc, 120 mM NaCl, pH 7.0漂洗去除柱保存缓冲液，使用前经0.1 M NaOH消毒，然后用平衡缓冲液70 mM Tris‑HAc,120 mM NaCl, pH 7.0平衡以准备上样。将澄清收获液进行亲和上样；首先用第一淋洗缓冲液70 mM Tris‑HAc,120 mM NaCl, pH 7.0淋洗，然后再用第二淋洗缓冲液为70 mM NaAc‑HAc,1 M NaCl, pH 5.6淋洗，最后再用第三淋洗缓冲液70 mM NaAc‑HAc, pH 5.5淋洗。用洗脱缓冲液70 mM NaAc‑HAc, pH 3.7进行洗脱。洗脱完成后，用1 M HAc对亲和层析柱进行再生、再用第二漂洗缓冲液70 mM Tris‑HAc, 120 mM NaCl, pH 7.0漂洗处理；然后使用前经消毒和平衡进入下一个循环，直至整个收获液完成纯化。直到最后一个循环结束，层析柱先用0.1 M NaOH溶液进行使用后消毒，再用第三漂洗缓冲液70 mM Tris‑HAc, 120 mM NaCl, pH 7.0进行漂洗，最后保存在20%乙醇中。AKTA使用1 M NaOH 消毒后，保存在0.1 M NaOH溶液中。具体工艺参数详见表1。
[0063] 表1 亲和层析工艺参数
[0064]
[0065] 实验结果如下表2所示，可以看出三批实验样品的pH、电导较为稳定，微生物负荷<1 CFU/10mL，内毒素<0.25 EU/mL，批次1的宿主蛋白残留较其它两批实验高出一些。由于亲和层析为粗纯步骤，宿主蛋白残留将在后续精纯步骤得到有效的去除。三批实验SEC‑HPLC的单体比例均>95%，CEX‑HPLC主峰比例>50%，还原性毛细管凝胶电泳CE‑SDS>98%，非原性毛细管凝胶电泳CE‑SDS>98%，显示出亲和层析工艺运行稳定。
[0066] 表2 亲和层析样品检测结果
[0067]
[0068] （3）低pH病毒孵育：在完成亲和层析后，每个循环的亲和层析洗脱液会单独收集在一次性使用的液体混匀袋中，根据需要添加1 M HAc调整pH值，在15‑25℃温度条件下，调节样品溶液pH 至3.6‑3.8，孵育60‑240 min进行病毒灭活。灭活结束后，病毒灭活中间产品用1 M Tris‑HCl, pH 9.0调节pH至4.9。实验结果如表3所示，可以看出三批实验样品的pH均为4.9，电导和蛋白浓度较为稳定。
[0069] 表3 低pH病毒孵育实验检测结果
[0070]
[0071] （4）中间深层过滤：亲和收集液经过低pH病毒灭活后，调节pH至4.9‑5.1，可发生沉淀。在室温下，采用Millipore的A1HC深层过滤器（货号MA1HC）过滤后，再使用Millipore的20英寸0.5/0.2 μm囊式过滤器（货号KHGEA）。具体中间深层过滤工艺参数如表4所示。
[0072] 表4 中间深层过滤工艺参数
[0073]
[0074] 结果如表5所示，可以看出三批实验样品的pH、电导较为稳定，批次1的宿主蛋白残留在本次操作过程中得到有效的去除。三批实验DNA残留量也比亲和层析后的残留量有显著降低，SEC‑HPLC的单体比例均>95%，CEX‑HPLC主峰比例>50%，还原性毛细管凝胶电泳CE‑SDS>98%，非原性毛细管凝胶电泳CE‑SDS>98%，显示出中间深层过滤工艺运行稳定。
[0075] 表5 中间深层过滤实验检测结果
[0076]
[0077] （5）阳离子层析：阳离子层析以结合/洗脱的方式在室温下将中间深层过滤的溶液进行阳蛋白纯化。阳离子层析柱首先经使用前1M NaOH消毒，然后用平衡缓冲液70 mM NaAc‑HAc, pH 5.0平衡，准备上样。上样结束后，层析柱首先用淋洗缓冲液70 mM NaAc‑HAc, pH 5.0淋洗，然后再用洗脱缓冲液70 mM NaAc‑HAc, pH 6.6进行洗脱。在产品洗脱完成后，层析柱经再生，使用前消毒和平衡处理后进入下一个循环，直至整个上样样品纯化完成。直到最后一个循环洗脱结束，层析柱经70 mM NaAc‑HAc, 1 M NaCl, pH 5.5再生和使用1M NaOH消毒处理后，最后保存于0.1 M NaOH缓冲液中。AKTA Process 使用1 M NaOH消毒后，用0.1 M NaOH保存。阳离子收集液使用0.5/0.2 μm孔径类型的滤器过滤。其他阳离子工艺参数如表6所示。
[0078] 表6 阳离子层析工艺参数
[0079]
[0080] 结果如表7所示，可以看出三批实验样品的pH、电导较为稳定，宿主蛋白残留均<10 ng/mg。三批实验DNA残留量也比深层过滤后的残留量进一步降低，SEC‑HPLC的单体比例均>97%，CEX‑HPLC主峰比例>50%，还原性毛细管凝胶电泳CE‑SDS>98%，非原性毛细管凝胶电泳CE‑SDS>98%，显示出阳离子层析工艺运行稳定。
[0081] 表7 阳离子层析实验检测结果
[0082]
[0083] （6）阴离子层析：阴离子层析以流穿模式在室温下将阳离子层析洗脱液进行蛋白纯化。层析柱首先经使用前1 M NaOH消毒，然后先用预平衡缓冲液700 mM NaAc‑HAc, pH 5.5预平衡、再用平衡缓冲液70 mM NaAc‑HAc, pH 5.8平衡，准备上样。在上样过程中，蛋白流过层析柱，而带负电荷的杂质则与层析柱结合。上样结束后，用淋洗缓冲液70 mM NaAc‑HAc, pH 5.8淋洗层析柱，回收层析柱中未结合的产品。产品收集结束后，AEX柱经再生，漂洗、使用前消毒、预平衡和平衡进入下一循环，直至整个AEX上样样品纯化完成。生产活动结束后，用1 M NaOH对层析柱进行使用后消毒，最后保存在10 mM NaOH中。AKTA Process 用1 M NaOH消毒后，保存0.1 M NaOH溶液中。其他阴离子工艺参数如表8所示。
[0084] 表8 阴离子层析工艺参数
[0085]
[0086] 结果如表9所示，可以看出三批实验样品的pH、电导较为稳定，三批实验宿主蛋白残留、DNA残留量已经达到可检测的下限，SEC‑HPLC的单体比例均>97%，CEX‑HPLC主峰比例>50%，还原性毛细管凝胶电泳CE‑SDS>98%，非原性毛细管凝胶电泳CE‑SDS>98%，显示出阴离子层析工艺运行稳定。
[0087] 表9 阴离子层析实验检测结果
[0088]
[0089] （7）除病毒过滤：使用Modus 1.3除病毒预过滤器（货号VPPS）和Modus 1.3除病毒过滤器（货号VPMD）对阴离子收集液进行病毒过滤。病毒过滤预过滤器首先用注射用水漂洗，然后用注射用水漂洗预过滤器和病毒过滤器，最后用70 mM NaAc‑HAc, pH 5.8缓冲液平衡预过滤器和病毒过滤器。在产品过滤过程中，在一定的压差(△P)下通过病毒过滤膜，同时潜在的病毒被截留。将病毒过滤后产品收集到收集袋中，用70 mM NaAc‑HAc, pH 5.8冲洗系统，收集保留在系统的产品。病毒过滤收集液使用Millipore的20英寸0.5/0.2 μm囊式过滤器（货号KHGEA）过滤。具体除病毒过滤工艺参数如表10所示。
[0090] 表10 除病毒过滤工艺参数
[0091]
[0092] 结果如表11所示，可以看出三批实验样品的pH、电导较为稳定，三批实验的SEC‑HPLC的单体比例均>97%，CEX‑HPLC主峰比例>50%，还原性毛细管凝胶电泳CE‑SDS>98%，非原性毛细管凝胶电泳CE‑SDS>98%，显示出除病毒过滤工艺运行稳定。
[0093] 表11 除病毒过滤实验检测结果
[0094]
[0095] 从图1到图4，可以看出不同批次间各个工序中间体质量数据的趋势，由三批实验检测结果可以看出三批中间体的SEC‑HPLC单体（%）、CEX‑HPLC主峰（%）、还原性CE‑SDS纯度（%）和非还原性CE‑SDS纯度（%）趋势较为集中，其中SEC‑HPLC单体>97%，CEX‑HPLC主峰>50%，还原性CE‑SDS纯度（%）>98%，非还原性CE‑SDS纯度（%）>98%，未发生较大的偏离现象，可以证明该200L规模生产工艺下产品的质量属性稳定，本次规模放大成功，可以使用于商业化稳定生产。
[0096] 实施例2 亲和层析过程参数优化
[0097] 亲和层析研究实验的具体过程参数见表12。
[0098] 表12 亲和层析过程参数
[0099]
[0100] 1.1 实验设计（DoE）
[0101] 将在DoE实验中研究的5个因素分别是（1）淋洗2缓冲液pH值，（2）淋洗2缓冲液氯化钠浓度，（3）洗脱缓冲液pH值，（4）洗脱缓冲液浓度，（5）上样载量。
[0102] DoE实验将通过5因素，3水平，分辨率为4的部分析因实验设计来实施，附加4个中心点（中间值），实验数量为20（16个实验+4个中心点实验）。具体的实验方案见表13和14。
[0103] 表13 DoE的因素和其水平
[0104]
[0105] 表14 DoE研究方案‑部分析因
[0106]
[0107] 1.2 结果与讨论
[0108] 1.2.1 DoE实验结果
[0109] DoE研究的分析结果总结在表15。
[0110] 表 15 亲和DoE研究的分析结果
[0111]
[0112] 1.3 DoE 总结
[0113] 通过JMP软件，建立了亲和层析各因素对响应值的统计学模型，DoE结果的总结见图5。所有在统计学上对响应值有显著影响的因素用标星方框标出。
[0114] 洗脱缓冲液pH对产品SEC纯度，洗脱液的体积和回收率产生显著影响。较高的洗脱pH可以得到较高的SEC纯度，但是同时也会增大洗脱体积并使回收率下降。
[0115] 载量对产品SEC纯度，CEX‑HPLC主峰相对含量，洗脱液的体积产生显著影响。较低的载量有助于提高SEC纯度和CEX‑HPLC主峰相对含量，并使洗脱体积降低。
[0116] 淋洗2缓冲液pH和氯化钠浓度对残留DNA的去除有显著影响，并且有交互作用。在高水平氯化钠浓度下（1100mM），低pH水平（pH5.3）的组合下对残留DNA有最好的去除效果。而且氯化钠浓度相对于pH来说对残留DNA的去除是更重要的因素，在低氯化钠浓度水平下（900mM），pH的水平会对残留DNA的去除产生明显的影响，而高氯化钠浓度水平下，pH的不同水平对残留DNA的去除影响不大。
[0117] 对于SEC纯度来说，由于最终产品的质量标准为≥95%，而亲和层析研究中，洗脱样品的SEC纯度为96.5%‑97.7%，且考虑到后续工艺，阴离子层析还有提高SEC纯度的能力，所以在亲和层析研究中，各参数在研究范围内对SEC纯度的影响都是可接受的。
[0118] 对于HCP来说，设置的各参数在研究范围内对HCP都没有显著的影响。
[0119] 对于CEX‑HPLC主峰相对含量来说，实际上在各因素的研究范围内，CEX‑HPLC主峰相对含量数据本身差距不大（51.2% 48.6%），以及考虑到最终产品该检项的标准为不小于~40%，所以在亲和层析研究中，CEX‑HPLC主峰相对含量的变化都是可以接受的，在各参数在研究范围内对终产品在CEX‑HPLC主峰相对含量这一项上是低风险的。
[0120] 对于残留DNA来说，最差的情况会在淋洗2缓冲液为低氯化钠浓度水平（900mM）和高pH（5.9）条件下出现。该模型拟合度较高（调整R2=0.94），通过模型预测最差情况下DNA残留为92.50pg/mg。而在可能的运行值的最差情况下（氯化钠浓度水平900mM，pH5.8），DNA残留预测值为85.15pg/mg，可以认为pH5.3‑5.8是可以接受的淋洗2缓冲液的pH范围。
[0121] 对于回收率来说，在亲和DoE研究中，回收率都大于90%，在设置的参数范围内都是可以接受的。
[0122] 综上所述，亲和层析参数建议的范围见表16。
[0123] 表16 建议的亲和层析参数及其范围
[0124]
[0125] 实施例3 阳离子层析过程参数优化
[0126] 阳离子层析工艺研究实验的具体过程参数见表17。
[0127] 表17 阳离子层析过程参数
[0128]
[0129] 2.1实验设计（DoE）
[0130] 根据预实验结果，将在DoE实验中研究的6个因素分别是（1）平衡缓冲液pH，（2）平衡缓冲液浓度，（3）上样样品pH，（4）洗脱缓冲液pH，（5）洗脱缓冲液浓度，（6）上样载量。
[0131] DoE实验将通过6因素，3水平，分辨率4的部分析因的实验设计来实施，总共实验数量为20（16+4中心点）。具体的实验方案见表18和表19。
[0132] 表18 DoE的因素和其水平
[0133]
[0134] 表 19 DoE研究方案‑部分析因
[0135]
[0136] 2.2结果与讨论
[0137] 2.2.1 DoE实验结果
[0138] DoE研究的分析结果总结在表20。
[0139] 表20 阳离子层析DoE研究的分析结果
[0140]
[0141] 2.3 DoE 总结
[0142] 通过JMP软件，建立了阳离子层析各因素对响应值的统计学模型，DoE结果的总结见图6。所有在统计学上对响应值有显著影响的因素用标星方框标出。
[0143] 洗脱缓冲液浓度对产品SEC‑HPLC纯度、CEX‑HPLC主峰相对纯度、洗脱体积和回收率均产生显著影响。较低的洗脱缓冲液浓度可以得到较高的SEC和CEX‑HPLC纯度，但是同时也会增大洗脱体积并使回收率下降。
[0144] 洗脱缓冲液pH对产品SEC‑HPLC纯度、CEX‑HPLC主峰相对纯度和回收率有显著影响。较低的洗脱缓冲液pH可以得到较高的SEC和CEX‑HPLC纯度，但是同时也会使回收率下降。
[0145] 平衡缓冲液pH、平衡缓冲液浓度、上样样品pH对产品SEC‑HPLC纯度和回收率有显著影响。较高的平衡缓冲液pH和较高的平衡缓冲液浓度、较低的上样样品pH可以得到较高的SEC纯度和回收率。
[0146] 对于CEX‑HPLC主峰相对含量来说，研究参数的变化对CEX‑HPLC主峰相对含量结果的影响不大。DOE实验研究中的最低值为53.3%，可以达到该检项的标准不小于40%，所以在阳离子层析研究中，各参数在研究范围内对产品的CEX‑HPLC主峰相对含量的变化都是可以接受的，是低风险的。
[0147] 对于洗脱体积来说，洗脱缓冲液浓度和上样载量对洗脱体积有显著影响，各因素间不存在交互作用。最差情况在高上样载量(52g/L)和低洗脱缓冲液浓度(30mM，Cond：2.3mS/cm)组合的条件下出现，DoE实验中达到的最大洗脱体积为5.4CV。由于洗脱体积不对产品本身产品质量产生影响，可认为各参数在研究范围内对工艺表现是低风险的。
[0148] 对于回收率来说，平衡缓冲液pH、洗脱缓冲液浓度、平衡缓冲液浓度、洗脱缓冲液pH、上样样品pH对回收率均有显著影响。其中平衡缓冲液pH和平衡缓冲液浓度之间存在交互作用。在低平衡缓冲液pH水平下（pH4.8），平衡缓冲液浓度的水平会对回收率产生明显的影响，而高平衡缓冲液pH水平下，平衡缓冲液浓度的不同水平对回收率影响不大。回收率最差情况(72%)出现在低的平衡缓冲液pH(pH4.8)，低的洗脱缓冲液浓度 (50mM，Cond：2.3mS/cm)，低的平衡缓冲液浓度(50mM，Cond：1.4mS/cm)，低的洗脱缓冲液pH(pH6.4)，高的上样样品pH(pH5.2)组合的条件下。该模型的拟合度可接受(调整R2=0.78)，可以通过模型预测各参数组合下的回收率。在平衡缓冲液pH低水平调整至pH4.9，洗脱缓冲液浓度低水平调整至60mM，平衡缓冲液浓度低水平调整至60mM，其余参数在DoE设计范围内达到最差条件时，通过模型预测最差情况下回收率为80%。见表21。而在下游工艺中，这五个因素同时达到最差条件的情况可能性很小，因此综合考虑风险因素后，在调整后的因素范围内洗脱产品的回收率结果可接受。
[0149] 表21可接受回收率范围内的各因素条件
[0150]
[0151] 对于SEC‑HPLC纯度来说，洗脱缓冲液浓度、平衡缓冲液pH、洗脱缓冲液pH、上样样品pH和平衡缓冲液浓度对洗脱产品SEC‑HPLC纯度均有显著影响。洗脱缓冲液浓度、平衡缓冲液pH之间存在交互作用。在低洗脱缓冲液浓度水平下，平衡缓冲液pH的水平对SEC‑HPLC纯度没有明显影响，而高洗脱缓冲液浓度水平下，较高的平衡缓冲液pH的可以得到较高的SEC‑HPLC纯度。平衡缓冲液pH和洗脱缓冲液pH之间也存在交互作用，在低的洗脱缓冲液pH水平下（pH6.4），洗脱缓冲液浓度的不同水平对SEC‑HPLC纯度影响较大，而高洗脱缓冲液pH水平下，洗脱缓冲液浓度的不同水平变化对SEC‑HPLC纯度影响不大。SEC‑HPLC最差情况（95.7%）出现在低平衡缓冲液pH（pH4.8），低平衡缓冲液浓度（50mM），高上样样品pH（pH5.2），高洗脱缓冲液pH（pH6.8）和高洗脱缓冲液浓度（90mM）的组合条件下。该模型的拟2
合度较高(调整R =0.99)，可以通过模型预测各参数组合下的SEC纯度。在平衡缓冲液pH下限调整至pH4.9，洗脱缓冲液浓度高水平调整至80mM，洗脱缓冲液pH高水平调整至6.7，其余参数在DoE设计范围内达到最差条件时，通过模型预测最差情况下SEC‑HPLC纯度96.6%，见表22。而在下游工艺中，这五个因素同时达到最差条件的情况可能性很小，因此综合考虑风险因素后，在调整后的因素范围内洗脱产品的SEC‑HPLC纯度结果可接受。
合度较高(调整R =0.99)，可以通过模型预测各参数组合下的SEC纯度。在平衡缓冲液pH下限调整至pH4.9，洗脱缓冲液浓度高水平调整至80mM，洗脱缓冲液pH高水平调整至6.7，其余参数在DoE设计范围内达到最差条件时，通过模型预测最差情况下SEC‑HPLC纯度96.6%，见表22。而在下游工艺中，这五个因素同时达到最差条件的情况可能性很小，因此综合考虑风险因素后，在调整后的因素范围内洗脱产品的SEC‑HPLC纯度结果可接受。
[0152] 表22 可接受SEC_HPLC纯度范围内的各因素条件
[0153]
[0154] 综上所述，阳离子层析参数建议的范围见表23。
[0155] 表23 建议的阳离子层析参数及其范围
[0156]
[0157] 实施例4 阴离子层析过程参数优化
[0158] 阴离子层析工艺研究实验的具体过程参数见表24。
[0159] 表24 阴离子层析过程参数
[0160]
[0161] 3.1 实验设计（DoE）
[0162] 该阴离子层析工艺为弱结合模式，利用了抗体单体和聚体间的电荷性质差异来提高单体纯度。在DoE实验中研究的5个因素分别是（1）平衡缓冲液的pH值，（2）平衡缓冲液的浓度，（3）样品的pH值，（4）样品的电导值，（5）上样样品的载量。DoE实验通过5因素，3水平，分辨率为4的部分析因实验设计来实施，附加了4个中心点（中间值），实验数量为20（16个实验+4个中心点实验）。具体的实验方案见表25和表26。
[0163] 表25 DoE的因素和其水平
[0164]
[0165] 表26 DoE研究方案‑部分析因
[0166]
[0167] 3.2 结果和讨论
[0168] 3.2.1 DoE实验结果
[0169] DoE研究的检测结果总结在表27。
[0170] 表27 阴离子层析DoE研究的检测结果
[0171]
[0172] 3.3 DoE总结
[0173] 通过JMP软件，建立了阴离子层析各因素对响应值的统计学模型，DoE结果的总结见图7。所有在统计学上对响应值有显著影响的因素用标星方框标出。
[0174] 平衡缓冲液pH对产品SEC纯度、CEX‑HPLC主峰相对含量和回收率产生显著影响。较高的平衡缓冲液pH有利于提高SEC纯度和CEX‑HPLC主峰相对含量，但是同时会使回收率下降。
[0175] 平衡缓冲液浓度对产品SEC纯度、CEX‑HPLC主峰相对含量和回收率也产生了显著影响。当平衡缓冲液浓度升高时，SEC纯度和CEX‑HPLC主峰相对含量均下降，但是使得回收率提升。
[0176] 样品pH仅对CEX‑HPLC主峰相对含量有影响。当样品pH升高时，CEX‑HPLC主峰相对含量也随之升高。但是CEX‑HPLC主峰相对含量在54.1 57.7%之间波动，考虑到实验、检测方~面固有系统误差，可以认为研究参数的变化对CEX‑HPLC主峰相对含量结果的影响都是可以接受的。
[0177] 样品电导值影响了产品的SEC纯度、CEX‑HPLC主峰相对含量和回收率。随着样品电导值的提高，SEC纯度和CEX‑HPLC主峰相对含量下降，回收率提高，这与平衡缓冲液浓度对产品的影响表现出相同趋势。
[0178] 上样载量对HCP去除、CEX‑HPLC主峰相对含量和回收率产生显著影响。在高载情况下，有利于回收率的提高。
[0179] 对于SEC纯度来说，由于最终产品的质量标准为≥95%，在阴离子层析工艺实验中，上样样品的SEC纯度在97.3% 97.7%，流穿产品的SEC纯度在97.8% 99.3%。总的来说，相对于~ ~上样样品而言，经过阴离子层析工艺实验后，SEC纯度均得到提高。考虑到该步层析主要作用是提升SEC纯度，根据统计学模型，平衡缓冲液pH以及上样样品电导对SEC纯度有显著的影响，将上样电导调整为≤3mS/cm，平衡缓冲液pH调整至5.7‑6.1的范围内，可以保证SEC纯度达到≥98.5%。
[0180] 对于HCP来说，除了上样载量以外，其余设置的参数在研究范围内对HCP都没有显著的影响。所以在阴离子层析研究中，各参数在研究范围内运行，流穿产品的HCP含量都是可接受的。
[0181] 对于CEX‑HPLC主峰相对含量来说，实际上在各参数的研究范围内，CEX‑HPLC主峰相对含量数据本身差距不大（54.1% 57.7%），以及考虑到最终产品该检项的标准为不小于~40%，所以在阴离子层析研究中，CEX‑HPLC主峰相对含量的变化都是可以接受的，在各参数在研究范围内对终产品在CEX‑HPLC主峰相对含量这一项上是低风险的。
[0182] 对于回收率来说，DoE实验最差的情况在高平衡缓冲液pH (pH6.1)、低平衡缓冲液浓度（50 mM）、低样品电导值（2 mS/cm）和低载量（65 g/L）的组合条件下出现，此条件组合下实验实际回收率为79.5%，回收率偏低。该模型拟合度较高（R2=0.97，调整R2=0.87），可以通过模型来预测各条件下可能的回收率。当各参数范围处于上述最差条件下时，通过模型预测最差情况下回收率为78.8%，与实际实验数据是可比的，说明模型预测是比较准确的。设置组合中其他参数条件不变，将载量提高到80g/L时，通过模型预测的回收率可以达到
80%。考虑到各参数同时处于最差条件的可能性是非常小的，回收率可以保证在80%以上。
80%。考虑到各参数同时处于最差条件的可能性是非常小的，回收率可以保证在80%以上。
[0183] 综上所述，阴离子层析参数建议的范围见表28。
[0184] 表28 建议的阴离子层析参数及其范围
[0185]
[0186] 本发明提供了一种大规模纯化PD‑1抗体的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。