一种黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法

摘要

本发明提供一种黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，该方法包括以下步骤：(1)将由黑牛肝菌诱变菌株的菌丝接种至初筛培养基，所述初筛培养基为以木屑为唯一碳源的琼脂培养基；(2)将经所述初筛培养基培养后的菌丝转接于复筛培养基，所述复筛培养基为以木聚糖为唯一碳源的琼脂培养基；(3)筛选所需菌株。采用本方法能够快速地从黑牛肝菌诱变菌株中筛选到对栽培基质中木质纤维素利用率提升的菌株，提高诱变菌株筛选的效率。

权利要求

1.一种黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将由黑牛肝菌诱变菌株的菌丝接种至初筛培养基，所述初筛培养基为以木屑为唯一碳源的琼脂培养基；

(2)将经所述初筛培养基培养后的菌丝转接于复筛培养基，所述复筛培养基为以木聚糖为唯一碳源的琼脂培养基；

(3)经以上步骤用于筛选出长势好、菌丝壮、生长速度佳的菌株。

2.根据权利要求1所述的黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，包括：(a)制备以木屑为唯一碳源的琼脂培养基，作为初筛培养基；

(b)将上述培养基切块，并将每一小块翻转后置于无菌培养皿中，使其含木屑较多的一面朝上；

(c)将由黑牛肝菌诱变菌株的菌丝块分别接种于步骤(b)中的培养基小块表面，28‑30℃下避光培养。

3.根据权利要求1所述的黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，包括：(d)制备以木聚糖为唯一碳源的琼脂培养基，作为复筛培养基；

(e)经步骤(1)培养后，由初筛培养基上筛选出长势好、菌丝壮的菌落，挑取菌丝块转接于所述复筛培养基，28‑30℃下避光培养。

4.根据权利要求1所述的黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，还包括：测定由所述复筛培养基培养的菌落生长速度。

5.根据权利要求2所述的黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，其特征在于，步骤(b)中，初筛培养基切块大小为(5‑10)mm×(5‑10)mm；

和/或，

步骤(c)中，挑取的菌丝块大小为(2‑3)mm×(2‑3)mm。

6.根据权利要求3所述的黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，其特征在于，步骤(e)中，挑取的菌丝块远离原接种点，大小为(2‑3)mm×(2‑3)mm。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述初筛培养基组分包括：木屑粉末20‑30g，酵母膏1‑2g，酒石酸铵1‑2g，MgSO4 1‑2g，KH2PO4 1‑2g，琼脂粉15‑20g，加水定容至1L。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述初筛培养基经115‑121℃灭菌20‑30min后，未凝固前倒入无菌培养皿，所述初筛培养基厚度为5mm‑10mm。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述复筛培养基组分包括：木聚糖10‑30g，酵母膏1‑2g，酒石酸铵1‑2g，MgSO4 1‑2g，KH2PO4 1‑2g，琼脂粉15‑20g，加水定容至1L。

10.根据权利要求1至6中任一项所述的黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述黑牛肝菌诱变菌株是通过黑牛肝菌原生质体经诱变处理后，于再生培养基上进行再生培养得到的。

说明书

一种黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法

技术领域

[0001] 本发明涉及食用菌菌种育种领域，具体而言，尤其涉及一种黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法。

背景技术

[0002] 黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)学名暗褐脉柄牛肝菌，又名暗褐网柄牛肝菌，隶属于牛肝菌目(Boletales)，小牛肝菌科(Boletinellaceae)，脉柄牛肝菌属(Phlebopus)。黑牛肝菌的人工驯化，从初期的实验室探索阶段，到工厂化栽培的发展阶段，取得了长足的进步。

[0003] 目前由于黑牛肝菌人工驯化历史较短，真正能在生产中使用的菌株较少，且亲缘关系较近，这直接导致了在黑牛肝菌的菌种选育工作中所能使用的优良亲本较少，阻碍了优良菌株选育工作的开展。在过去的一系列研究中，人们已经发现黑牛肝菌具有利用木质纤维素中的木聚糖的能力，只是此能力较弱，则可以引入诱变育种方法，通过诱变手段提高菌株利用此能力，故而如何快速地从黑牛肝菌诱变菌株中筛选到对栽培基质中木质纤维素利用率提升的菌株成为亟需解决的难题。

发明内容

[0004] 本发明鉴于解决上述技术问题，提供了一种黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，能够快速地从黑牛肝菌诱变菌株中筛选到对栽培基质中木质纤维素利用率提升的菌株，提高诱变菌株筛选的效率。

[0005] 为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：

[0006] 一种黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，包括以下步骤：

[0007] (1)将由黑牛肝菌诱变菌株的菌丝接种至初筛培养基，所述初筛培养基为以木屑为唯一碳源的琼脂培养基；

[0008] (2)将经所述初筛培养基培养后的菌丝转接于复筛培养基，所述复筛培养基为以木聚糖为唯一碳源的琼脂培养基；

[0009] (3)筛选所需菌株。

[0010] 具体地，步骤(1)中，包括：

[0011] (a)制备以木屑为唯一碳源的琼脂培养基，作为初筛培养基；

[0012] (b)将上述培养基切块，并将每一小块翻转后置于无菌培养皿中，使其含木屑较多的一面朝上；

[0013] (c)将由黑牛肝菌诱变菌株的菌丝块分别接种于步骤(b)中的培养基小块表面，28‑30℃下避光培养。

[0014] 具体地，步骤(2)中，包括：

[0015] (d)制备以木聚糖为唯一碳源的琼脂培养基，作为复筛培养基；

[0016] (e)经步骤(1)培养后，由初筛培养基上筛选出长势好、菌丝壮的菌落，挑取菌丝块转接于所述复筛培养基，28‑30℃下避光培养。

[0017] 具体地，步骤(2)中，还包括：测定由所述复筛培养基培养的菌落生长速度。

[0018] 具体地，步骤(3)中，包括：

[0019] (f)经步骤(2)培养后，筛选出长势好、菌丝壮、生长速度佳的菌株，保存备用。

[0020] 具体地，步骤(b)中，初筛培养基切块大小为(5‑10)mm×(5‑10)mm；

[0021] 和/或，

[0022] 步骤(c)中，挑取的菌丝块大小为(2‑3)mm×(2‑3)mm。

[0023] 具体地，步骤(e)中，挑取的菌丝块远离原接种点，大小为(2‑3)mm×(2‑3)mm。

[0024] 具体地，步骤(1)中，所述初筛培养基组分包括：木屑粉末20‑30g，酵母膏1‑2g，酒石酸铵1‑2g，MgSO4 1‑2g，KH2PO4 1‑2g，琼脂粉15‑20g，加水定容至1L。

[0025] 具体地，步骤(1)中，所述初筛培养基经115‑121℃灭菌20‑30min后，未凝固前倒入无菌培养皿，所述初筛培养基厚度为5mm‑10mm。

[0026] 具体地，步骤(2)中，所述复筛培养基组分包括：木聚糖10‑30g，酵母膏1‑2g，酒石酸铵1‑2g，MgSO4 1‑2g，KH2PO4 1‑2g，琼脂粉15‑20g，加水定容至1L。

[0027] 具体地，步骤(1)中，所述黑牛肝菌诱变菌株是通过黑牛肝菌原生质体经诱变处理后，于再生培养基上进行再生培养得到的。

[0028] 本发明实施例提供一种黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，黑牛肝菌诱变菌株的菌丝依次通过以木屑为唯一碳源的琼脂培养基、以木聚糖为唯一碳源的琼脂培养基进行培养，然后可以筛选出所需要的长势好、菌丝壮、生长速度佳的菌株。该黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法能够实现快速地从黑牛肝菌诱变菌株中筛选到对栽培基质中木质纤维素利用率提升的菌株，提高诱变菌株筛选的效率，节省人力物力，利用诱变育种方法，有效解决黑牛肝菌在生产中出现的木质纤维素利用率低、生物转化率低、抗污染能力弱、菌株退化等一系列问题。

具体实施方式

[0029] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0030] 所用试剂或仪器等，如无特殊说明，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0031] 实施例1

[0032] 本发明实施例提供一种黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，包括以下步骤：

[0033] (1)将由黑牛肝菌诱变菌株的菌丝接种至初筛培养基，所述初筛培养基为以木屑为唯一碳源的琼脂培养基；

[0034] (2)将经所述初筛培养基培养后的菌丝转接于复筛培养基，所述复筛培养基为以木聚糖为唯一碳源的琼脂培养基；

[0035] (3)筛选所需菌株。

[0036] 其中，黑牛肝菌诱变菌株可以采用不同的诱变处理，如紫外诱变处理或者化学诱变处理等。

[0037] 本发明实施例中，黑牛肝菌诱变菌株的菌丝依次通过以木屑为唯一碳源的琼脂培养基、以木聚糖为唯一碳源的琼脂培养基进行培养，然后可以筛选出所需要的长势好、菌丝壮、生长速度佳的菌株。该黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法能够实现快速地从黑牛肝菌诱变菌株中筛选到对栽培基质中木质纤维素利用率提升的菌株，提高诱变菌株筛选的效率，节省人力物力，利用诱变育种方法，有效解决黑牛肝菌在生产中出现的木质纤维素利用率低、生物转化率低、抗污染能力弱、菌株退化等一系列问题。

[0038] 实施例2

[0039] 本实施例示出了实施本发明的较优方法，但不限定其所有可能变型。

[0040] 本发明实施例提供一种黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，包括以下步骤：

[0041] (a)制备以木屑为唯一碳源的琼脂培养基，作为初筛培养基。

[0042] 较优的，初筛培养基组分包括：木屑粉末20‑30g，酵母膏1‑2g，酒石酸铵1‑2g，MgSO41‑2g，KH2PO41‑2g，琼脂粉15‑20g，加水定容至1L。初筛培养基经115‑121℃灭菌20‑30min后，未凝固前倒入无菌培养皿，初筛培养基厚度为5mm‑10mm。

[0043] 具体地，初筛培养基的制作方法为：发酵三个月的橡胶木木屑粉末30g，酵母膏1g，酒石酸铵1g，MgSO41g，KH2PO41g，琼脂粉20g，加水定容至1L，经121℃灭菌30min后，未凝固前倒入无菌培养皿，厚度5mm。

[0044] (b)将上述培养基切块，并将每一小块翻转后置于无菌培养皿中，使其含木屑较多的一面朝上。

[0045] 其中，培养基小块置于的无菌培养皿选用新的无菌培养皿。

[0046] 较优的，初筛培养基切块大小为(5‑10)mm×(5‑10)mm。

[0047] 具体地，初筛培养基切块大小可以为5×5mm。

[0048] (c)将由黑牛肝菌诱变菌株的菌丝块分别接种于步骤(b)中的培养基小块表面，28‑30℃下避光培养。

[0049] 较优的，挑取的菌丝块大小为(2‑3)mm×(2‑3)mm。

[0050] 具体地，挑取的菌丝块大小可以为2×2mm。

[0051] (d)制备以木聚糖为唯一碳源的琼脂培养基，作为复筛培养基。

[0052] 较优的，复筛培养基组分包括：木聚糖10‑30g，酵母膏1‑2g，酒石酸铵1‑2g，MgSO41‑2g，KH2PO41‑2g，琼脂粉15‑20g，加水定容至1L。

[0053] 具体地，复筛培养基组的制作方法为：木聚糖30g，酵母膏1g，酒石酸铵1g，MgSO41g，KH2PO41g，琼脂粉20g，加水定容至1L，经121℃灭菌30min后，未凝固前倒入无菌培养皿，厚度5mm。

[0054] (e)经步骤(c)培养后，由初筛培养基上筛选出长势好、菌丝壮的菌落，挑取菌丝块转接于复筛培养基，28‑30℃下避光培养，并测定其菌落生长速度。

[0055] 较优的，挑取的菌丝块远离原接种点，大小为(2‑3)mm×(2‑3)mm。

[0056] 具体地，挑取的菌丝块远离原接种点，大小可以为2×2mm。

[0057] (f)经步骤(e)培养后，筛选出长势好、菌丝壮、生长速度佳的菌株，保存备用。

[0058] 其中，黑牛肝菌诱变菌株可以是通过黑牛肝菌原生质体经诱变处理后，于再生培养基上进行再生培养得到的。

[0059] 实施例3

[0060] 本实施例示出了实施本发明的较优方法，但不限定其所有可能变型。

[0061] 本发明实施例提供一种黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法，包括以下步骤：

[0062] 1、原生质体制备

[0063] 将黑牛肝菌菌株YL1701‑2接种于铺有玻璃纸的马铃薯琼脂固体培养基，30℃下避光培养10天，将菌丝体收集于试管中。以0.5mol/L蔗糖溶液配制1.5％(W:V)溶壁酶溶液，加入上述试管中对菌丝体进行酶解，29℃，酶解60min，收集上述酶解液，离心、洗涤2‑3次后获得原生质体。

[0064] 2、紫外诱变处理

[0065] 将原生质体置于离紫外灯15cm处进行紫外诱变，照射时间60s。

[0066] 3、再生

[0067] 吸取100μl诱变后的原生质体悬液于再生培养基上，用涂布棒轻轻涂布均匀后于29℃恒温培养箱遮光培养。再生培养基配方为：土豆200g、蔗糖171.15g、酵母膏2g、酒石酸铵1g，MgSO4 1g，KH2PO4 1g、琼脂20g、水1L、PH自然，121℃灭菌30min。

[0068] 4、筛选

[0069] 筛选的步骤可采用实施例2中的具体实施方式：

[0070] (a)制备以木屑为唯一碳源的琼脂培养基，作为初筛培养基，初筛培养基的制作方法为：发酵三个月的橡胶木木屑粉末30g，酵母膏1g，酒石酸铵1g，MgSO41g，KH2PO41g，琼脂粉20g，加水定容至1L，经121℃灭菌30min后，未凝固前倒入无菌培养皿，厚度5mm。

[0071] (b)将上述培养基切块，并将每一小块翻转后置于新的无菌培养皿中，使其含木屑较多的一面朝上，其中，初筛培养基切块大小为5×5mm。

[0072] (c)将由黑牛肝菌诱变菌株的菌丝块分别接种于步骤(b)中的培养基小块表面，28‑30℃下避光培养，其中，挑取的菌丝块大小为2×2mm。

[0073] (d)制备以木聚糖为唯一碳源的琼脂培养基，作为复筛培养基，复筛培养基组的制作方法为：木聚糖30g，酵母膏1g，酒石酸铵1g，MgSO41g，KH2PO41g，琼脂粉20g，加水定容至1L，经121℃灭菌30min后，未凝固前倒入无菌培养皿，厚度5mm。

[0074] (e)经步骤(c)培养后，由初筛培养基上筛选出长势好、菌丝壮的菌落，挑取菌丝块转接于复筛培养基，28‑30℃下避光培养，并测定其菌落生长速度。挑取的菌丝块远离原接种点，大小为2×2mm。

[0075] (f)经步骤(e)培养后，筛选出长势好、菌丝壮、生长速度佳的菌株，保存备用。

[0076] 本实施例所获优良菌株性状如表1所示，对照组为未经诱变的菌株。

[0077] 表1木聚糖培养基上优良菌株性状

[0078]编号 生长速度d/cm 菌丝长势 菌落颜色 菌落边缘
HZMJ01 0.251±0.012 强 黄色 整齐
HZMJ02 0.232±0.007 强 黄色 整齐
HZMJ03 0.196±0.006 强 黄色 整齐
对照组 0.157±0.017 弱 褐色 不齐

[0079] 实施例4

[0080] 1、原生质体制备

[0081] 将黑牛肝菌菌株YL1701‑2接种于铺有玻璃纸的马铃薯琼脂固体培养基，30℃下避光培养10天，将菌丝体收集于试管中。以0.5mol/L蔗糖溶液配制1.5％(W:V)溶壁酶溶液，加入上述试管中对菌丝体进行酶解，29℃，酶解60min，收集上述酶解液，离心、洗涤2‑3次后获得原生质体。

[0082] 2、化学诱变处理

[0083] 诱变剂：EMS原液、0.5％、1％、2％、3％EMS(用0.5mol/LPBS溶液稀释)；

[0084] 终止剂：5％硫代硫酸钠+0.5mol/L蔗糖溶液(细菌过滤器过滤灭菌)；

[0085] 取0.5ml纯化的原生质体悬液于1.5ml离心管，再加入100μl 1％的EMS诱变剂，震荡摇匀置于29℃恒温箱诱变30min。诱变结束后，向离心管内加入0.5ml 5％硫代硫酸钠+0.5mol/L蔗糖溶液的混合溶液作为终止剂，于离心机4℃、5400r/min离心10分钟，弃上清液，沉淀用0.5mol/L蔗糖溶液润洗2‑3次即得到诱变后的原生质体。

[0086] 3、再生

[0087] 吸取100μl诱变后的原生质体悬液于再生培养基上，用涂布棒轻轻涂布均匀后于29℃恒温培养箱遮光培养。再生培养基配方为：土豆200g、蔗糖171.15g、酵母膏2g、酒石酸铵1g，MgSO4 1g，KH2PO4 1g、琼脂20g、水1L、PH自然，121℃灭菌30min。

[0088] 4、筛选

[0089] 筛选的步骤可采用实施例2中的具体实施方式：

[0090] (a)制备以木屑为唯一碳源的琼脂培养基，作为初筛培养基，初筛培养基的制作方法为：发酵三个月的橡胶木木屑粉末30g，酵母膏1g，酒石酸铵1g，MgSO41g，KH2PO4 1g，琼脂粉20g，加水定容至1L，经121℃灭菌30min后，未凝固前倒入无菌培养皿，厚度5mm。

[0091] (b)将上述培养基切块，并将每一小块翻转后置于新的无菌培养皿中，使其含木屑较多的一面朝上，其中，初筛培养基切块大小为5×5mm。

[0092] (c)将由黑牛肝菌诱变菌株的菌丝块分别接种于步骤(b)中的培养基小块表面，28‑30℃下避光培养，其中，挑取的菌丝块大小为2×2mm。

[0093] (d)制备以木聚糖为唯一碳源的琼脂培养基，作为复筛培养基，复筛培养基组的制作方法为：木聚糖30g，酵母膏1g，酒石酸铵1g，MgSO4 1g，KH2PO4 1g，琼脂粉20g，加水定容至1L，经121℃灭菌30min后，未凝固前倒入无菌培养皿，厚度5mm。

[0094] (e)经步骤(c)培养后，由初筛培养基上筛选出长势好、菌丝壮的菌落，挑取菌丝块转接于复筛培养基，28‑30℃下避光培养，并测定其菌落生长速度。挑取的菌丝块远离原接种点，大小为2×2mm。

[0095] (f)经步骤(e)培养后，筛选出长势好、菌丝壮、生长速度佳的菌株，保存备用。

[0096] 本实施例所获优良菌株性状如表2所示，对照组为未经诱变的菌株。

[0097] 表2木聚糖培养基上优良菌株性状

[0098]编号 生长速度d/cm 菌丝长势 菌落颜色 菌落边缘
HZMJ04 0.235±0.008 强 黄色 整齐
HZMJ05 0.222±0.0011 强 黄色 整齐
HZMJ06 0.219±0.015 强 黄色 整齐
对照组 0.157±0.017 弱 褐色 不齐

[0099] 通过以上实施方式可以筛选出所需要的长势好、菌丝壮、生长速度佳的菌株。本发明实施例的黑牛肝菌诱变菌株的快速筛选方法能够实现快速地从黑牛肝菌诱变菌株中筛选到对栽培基质中木质纤维素利用率提升的菌株，提高诱变菌株筛选的效率，节省人力物力，利用诱变育种方法，有效解决黑牛肝菌在生产中出现的木质纤维素利用率低、生物转化率低、抗污染能力弱、菌株退化等一系列问题。

[0100] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。