多能活性制剂诱发恒河猴抵抗新冠突变体的免疫防治模型

摘要

本发明涉及一种利用多能活性制剂诱发恒河猴抵抗新冠病毒及其突变体感染免疫防治模型的建立及其制备方法。用恒河猴肺泡上皮细胞，通过带EGFP标记的含有SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白的重组腺病毒载体转染类拟胚体3D微球，构建表达含有SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白的类拟胚体3D微球，每支类拟胚体3D微球为2×103个,微球直径190±30μm，冻存液为人的AB血浆，总体积为1ml。制备的方法是通过物理动态悬浮法诱导为类拟胚体3D微球，并通过SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白进行遗传改良而制备成多能活性制剂。用多能活性制剂1支对12‑15年龄的老龄恒河猴上臂皮下接种，诱发恒河猴抵抗新冠病毒及其突变体感染免疫防治模型的建立。

权利要求

1.一种多能活性制剂，其特征在于：用恒河猴肺泡上皮细胞，通过带EGFP标记的含有SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白的重组腺病毒载体转染类拟胚体3D微球，构建表达含有SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白的类拟胚体3D微球，装入2ml冻存小管，每支类拟胚体3D3

微球为2×10 个,微球直径为190±30μm，冻存液为人的AB血浆，总体积为1ml，于－196℃液氮中贮存，解冻后直接使用。

2.一种权利要求1多能活性制剂的制备方法，其特征在于：用恒河猴肺泡上皮细胞，通过物理动态悬浮法诱导为类拟胚体3D微球，并通过SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白进行遗传改良而制备的，共分为以下步骤：(1)肺泡上皮细胞的扩大培养；(2)物理动态悬浮法是采用物理轨道震荡悬浮技术诱导肺泡上皮细胞转化为类拟胚体3D微球；(3)类拟胚体3D微球胚胎干性检测；(4)类拟胚体3D微球的基因修饰，使其可表达SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白，并带有EGFP标记，详细步骤如下：(1)肺泡上皮细胞的扩大培养：显微镜下观察细胞的贴壁情况，避免剧烈晃动，根据细胞的生长状况，进行换液和传代，并留一部分进行保种备用；

(2)肺泡上皮细胞在物理轨道震荡悬浮培养体系中诱导转化成类拟胚体3D微球：取对数生长期的肺泡上皮细胞，用DMEM/F12培养基重悬于培养皿中，将培养皿放在水平摇床37℃，5％CO2培养箱上，根据细胞状态进行动态轨道调整、加液或换液，形成类拟胚体3D微球；

(3)类拟胚体3D微球胚胎干性检测：将诱导形成的类拟胚体3D微球在免疫缺陷鼠上，观察其具有三个胚层分化潜能；

(4)通过带EGFP标记的SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白的重组腺病毒载体转染类拟胚体3D微球，构建表达SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白的类拟胚体3D微球，制备为多能3

活性制剂，装入2ml冻存小管，每支类拟胚体3D微球为2×10 个,微球直径为190±30μm，冻存液为人的AB血浆，总体积为1ml，于－196℃液氮中贮存，解冻后直接使用。

3.一种恒河猴抵抗新冠病毒及其突变体感染免疫防治模型的建立方法，其特征在于：采用12‑15年龄的老龄恒河猴，使用权利要求1的多能活性制剂1支皮下接种在恒河猴的上臂；

3

(1)1支中多能活性制剂中有类拟胚体3D微球为2×10 个,微球直径为190±30μm，冻存液为人的AB血浆，总体积为1ml，于－196℃液氮中贮存，解冻后直接使用；

(2)接种的剂量为1支；

(3)接种在恒河猴的上臂皮下；

(4)恒河猴的饮食无特别要求。

说明书

多能活性制剂诱发恒河猴抵抗新冠突变体的免疫防治模型

技术领域

[0001] 本发明涉及一种利用多能活性制剂诱发恒河猴抵抗新冠病毒及其突变体感染免疫防治模型的建立及其制备方法。

背景技术

[0002] 探索一种机体免疫防治模型对不断演变的病毒及其突变体具有更持久有效抵抗的新策略，以有效阻止病毒复制、释放、再入侵机体内新细胞的恶性循环，是一种迫切的选择。最新研究表明，Omicron 并不是一种良性的天然疫苗免疫增强剂，反而是一种特别隐蔽的免疫逃避剂。

[0003] 到目前为止，老年宿主的中枢和外周免疫功能的全面退化被认为是不可逆转的，如何逆转退化的免疫系统是一个棘手的临床问题。且当前用于免疫防治的模型的研究大都是啮齿类，在进化关系上与人类相差甚远，以其为研究对象所获得的实验数据对临床指导意义不大，而恒河猴的解剖特点、各系统生理功能及对疾病和药物反应性与人类是极为相近的，是进行免疫防治及临床转化前有效性和安全性的理想动物模型。

发明内容

[0004] 本发明的目的是克服现有技术中的不足之处，利用恒河猴的肺泡上皮细胞制成的多能活性制剂来构建恒河猴抵抗新冠病毒及其突变体感染免疫防治模型，为开发新冠预防及治疗的临床前应用转化提供更安全有效的动物模型，解决开发一种更安全、长效的特殊生物制剂，以重建易感宿主退化的免疫系统，抵抗不断进化的SARS‑COV‑2及其不断进化的突变体产生的免疫逃逸从而阻止其突破性入侵感染。

[0005] 发明的任务是这样实现的：

[0006] 1.一种多能活性制剂：用恒河猴肺泡上皮细胞，通过带EGFP标记的含有SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑ 糖蛋白的重组腺病毒载体转染类拟胚体3D微球，构建表达含有SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白的类拟胚体3D微球，装入2ml冻存小管，每支类拟胚体3D微球
3
为2×10个,微球直径为190±30μm，冻存液为人的AB血浆，总体积为1ml，于－196℃液氮中贮存，解冻后直接使用。

[0007] 2.上述1多能活性制剂的制备方法：用恒河猴肺泡上皮细胞，通过物理动态悬浮法诱导为类拟胚体3D 微球，并通过SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白进行遗传改良而制备的，共分为以下步骤：(1)肺泡上皮细胞的扩大培养；(2)物理动态悬浮法是采用物理轨道震荡悬浮技术诱导肺泡上皮细胞转化为类拟胚体3D 微球；(3)类拟胚体3D微球胚胎干性检测；(4)类拟胚体3D微球的基因修饰，使其可表达SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白，并带有EGFP标记。

[0008] 3.恒河猴抵抗新冠病毒及其突变体感染免疫防治模型的建立方法：采用12‑15年龄的老龄恒河猴用上述1的多能活性制剂1支皮下接种在恒河猴的上臂，恒河猴的饮食无特别要求。

[0009] 本发明与现有技术相比具有以下优点：

[0010] 1.该多能活性制剂采用物理动态逆转肺泡上皮细胞为胚胎样类拟胚体3D微球，并通过含有SARS‑CoV‑2 受体结合域的S‑糖蛋白以基因修饰的模式进行遗传改良，一方面可以刺激机体直接产生抗体来针对 SARS‑CoV‑2及其突变体的入侵；另一方面还可以更新宿主退化免疫微环境，活化以NKT为主的亚群抵抗病毒变异入侵；两者相辅相成，可以持久有效的抵抗SARS‑CoV‑2及其不断进化的突变体产生的免疫逃逸从而阻止其突破性入侵感染。

[0011] 2.恒河猴免疫防治模型的建立可以持久有效地抵抗不断进化突变的SARS‑CoV‑2的突破性感染，同时也可以对因免疫缺陷相关病毒入侵导致相关疾病的治疗带来新希望。

[0012] 3.恒河猴免疫防治模型的建立可以为研发新冠预防及治疗相关研究的临床前应用转化提供更为安全有效的动物模型。

[0013] 4.恒河猴免疫防治模型的建立可以持续有效的消除新冠疫苗接种后，或者病毒感染发病后，产生的免疫逃逸从而引发的突破性感染。

附图说明

[0014] 以下是本发明说明书附图的图面说明：

[0015] 图1是本发明采用共聚焦动态扫描技术研究具有胚芽层发育的胚胎样类拟胚体3D微球(3D‑sph)形成过程中的荧光动态，揭示了在物理动态悬浮环境下5‑15天形成具有中空胚芽层模型的3D胚囊构形。

[0016] 图2是本发明的类拟胚体3D微球的胚层组织镜下观察。结果提示，组织中含有三个胚层的多个不同组织：外胚层(Ectoderm:从上而下)：体表外胚层毛囊(HF)、神经外胚层的原始神经管(NC)。中胚层(Mesoderm:从上而下)：原始的肌纤维(MF)、原始的软骨组织(CT)；内胚层(Endoderm:从上而下)：原始肠管(IC)、肺泡(PA)。表明本发明基于物理动态悬浮法培养形成的类拟胚体3D微球具备了胚胎全能干性。

[0017] 图3是本发明基于肺泡上皮细胞物理动态悬浮法诱导并通过SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白进行遗传改良的带EGFP标记的多能活性制剂。

[0018] 图4是本发明动物模型中枢免疫器官胸腺更新情况。图4A为胸腺结构的组织形态学H&E染色；图4B 为原位胸腺共聚焦免疫荧光扫描已确定再生髓质和皮质中不同胸腺细胞亚群(CD4+,CD8+,CD57+)的比例和分布。接种多能活性制剂宿主的中枢免疫微环境相关T和NKT细胞亚群活性动态指数最高，可以更好的修复萎缩退化的胸腺。

[0019] 图5是本发明动物模型外周免疫微环境的更新情况。图5A为原位脾脏共聚焦免疫荧光扫描脾脏细胞亚群(CD4+,CD8+,CD57+)的比例和分布。图5B为外周血单个核细胞中功能T细胞及NKT细胞亚群的比例。

[0020] 图6是本发明多能活性制剂在恒河猴模型对SARS‑CoV‑2及其突变体Omicron andδ‑mutants阻断效率。接种后，对Omicron andδ‑mutants上的阻断效率高于野生型SARS‑CoV‑2的阻断效率。

[0021] 图7是本发明的动物模型建立9个月后抵抗突破性侵袭后，各组肺的结构组织形态学H&E染色，显示各组的气道肺泡上皮在接受或抵抗突破性侵袭后，显示只有对照组的肺泡间隔增厚，并伴有明显的炎性细胞浸润，而多能活性制剂组没有。

[0022] 图8是本发明构建动物模型后，对恒河猴体重和摄食量的动态监测。图8A为恒河猴的体重动态变化；图8B为恒河猴的摄食量动态变化，显示所有宿主的生存指标没有明显波动和其他不良毒性反应。

具体实施方式

[0023] 本发明以下将结合实施例和说明书附图作进一步详述：

[0024] 实施例1.一种多能活性制剂：使用恒河猴肺泡上皮细胞，通过带EGFP标记的含有SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白的重组腺病毒载体转染类拟胚体3D微球，构建表达含有SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白的类拟胚体3D微球，装入2ml冻存小管，每支类拟胚体3D3
微球为2×10 个,微球直径为190±30μm，冻存液为人的AB血浆，总体积为1ml，于－196℃液氮中贮存，解冻后直接使用。

[0025] 实施例2.一种多能活性制剂的制备：使用恒河猴肺泡上皮细胞，通过物理动态悬浮法诱导为类拟胚体 3D微球，并通过含有SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白以基因修饰的模式进行遗传改良而制备的，共分为以下步骤：(1)肺泡上皮细胞的扩大培养；(2)物理动态悬浮法是采用物理轨道震荡悬浮技术诱导肺泡上皮细胞转化为类拟胚体3D微球；(3)类拟胚体3D微球胚胎干性检测；(4)类拟胚体3D微球的基因修饰，使其可表达含有SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白，并带有EGFP标记。详述如下：

[0026] (1)肺泡上皮细胞的扩大培养：显微镜下观察细胞的贴壁情况，避免剧烈晃动，根据细胞的生长状况，进行换液和传代，并留一部分进行保种备用；

[0027] (2)肺泡上皮细胞在物理动态悬浮培养体系中诱导转化成类拟胚体3D微球：取上述对数生长期的肺泡上皮细胞，用DMEM/F12培养基重悬于培养皿中，将培养皿放在水平摇床(37℃，5％CO2培养箱)上，根据细胞状态进行动态轨道调整、加液或换液，形成类拟胚体3D微球(参见说明书附图1)；

[0028] (3)类拟胚体3D微球胚胎干性检测：将诱导形成的类拟胚体3D微球在免疫缺陷鼠上，观察其具有三个胚层分化潜能(参见说明书附图2)；

[0029] (4)通过带EGFP标记的含有SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白的重组腺病毒载体转染类拟胚体3D 微球，构建表达含有SARS‑CoV‑2受体结合域的S‑糖蛋白的类拟胚体3D微球，制备为多能活性制剂(参见说明书附图3)，装入2ml冻存小管，每支类拟胚体3D微球为23
×10 个,微球直径为190±30μm，冻存液为人的AB血浆，总体积为1ml，于－196℃液氮中贮存，解冻后直接使用。

[0030] 实施例3.恒河猴抵抗新冠病毒及其突变体感染免疫防治模型的建立：采用12‑15年龄的老龄恒河猴9 只，随机分成3组，分别是生理盐水组(Control)，类拟胚体3D微球组(3D‑Sph)和多能活性制剂组(Synth‑1)，分别皮下接种一支冻存小管剂量在恒河猴的上臂。

[0031] 实施例4.接种完成9个月后，摘取各组恒河猴的中枢免疫器官胸腺进行组织形态学观察(参见说明书附图4A)，接种Synth‑1组和3D‑Sph组的胸腺仍然存在且保留活性，恒河猴退化微环境中的泡沫状胸腺残余物可以内生化修复为具有活性微环境的皮质和髓质，而Control组已经完全退化没有得到更新。同时，采用原位胸腺共聚焦免疫荧光扫描已确定再生髓质和皮质中不同胸腺细胞亚群(CD4+,CD8+,CD57+)的比例和分布(参见说明书附图4B)，接种Synth‑1组和3D‑Sph组的宿主中枢免疫微环境相关T和NKT细胞亚群活性动态指数最高，可以更好的修复萎缩退化的胸腺，而在Control组中，胸腺已经萎缩成泡沫状胸腺残余雏形，没有产生和输出淋巴细胞，表明恒河猴的中枢免疫器官胸腺在Control组中没有得到内源性更新。3D‑Sph组的作用就是仅仅激活宿主免疫抵抗病毒，而Synth‑1组是既可以产生抗体(虽然随着时间抗体效价会降低)又同时也能激活宿主免疫，两者相辅相成，达到持久有效抵抗病毒及不断进化突变体。

[0032] 实施例5.接种完成9个月后，对恒河猴的外周免疫器官脾脏进行了原位共聚焦免疫荧光扫描检测脾脏细胞亚群(CD4+,CD8+,CD57+)的比例和分布(参见说明书附图5A)，同时对外周血单个核细胞中NKT 细胞的比例进行统计分析(参见说明书附图5B),Synth‑1组和3D‑Sph组宿主的外周免疫微环境相关T 和NKT细胞亚群活性动态指数较Control组显著提高，表明恒河猴的外周免疫微环境也得到了更新活化。

[0033] 实施例6.分别在接种完成后的第3个月，6个月和9个月采集恒河猴的外周血，进行对SARS‑CoV‑2 及其突变体Omicron andδ‑mutants阻断效率的检测，显示对Omicron andδ‑mutants上的阻断效率高于野生型SARS‑CoV‑2的阻断效率(参见说明书附图6)，表明该恒河猴免疫防治动物模型对新冠病毒及其突变体的侵袭具有很好地抵抗效果。

[0034] 实施例7.恒河猴免疫防治模型建立9个月后，抵抗新冠病毒及突变体突破性侵袭后，对各组肺的结构组织形态学H&E染色，显示各组的气道肺泡上皮在接受或抵抗新冠病毒及其突变体突破性侵袭后，只有 Control的肺泡间隔增厚，并伴有明显的炎性细胞浸润，而Synth‑1组和3D‑Sph组没有(参见说明书附图 7)。

[0035] 实施例8.对构建的恒河猴免疫防治动物模型进行体重和摄食量的动态监测(参见说明书附图8)，显示所有宿主的生存指标没有明显波动和其他不良毒性反应,表明构建恒河猴抵抗新冠病毒及其突变体感染免疫防治模型过程并没有对宿主健康产生不良反应。