INPP5F的检测试剂在制备口腔癌诊断产品和/或预后评估产品中的应用

摘要

本发明提供了INPP5F的检测试剂在制备口腔癌诊断产品和/或预后评估产品中的应用。INPP5F在口腔癌患者的口腔组织样本和/或体液样本中的表达量相比正常口腔组织样本和/或体液样本显著下降，且ROC曲线下面积(AUC)高达0.97，说明INPP5F是一种优异的口腔癌标志物，具有极高的灵敏度与特异性，适用于制备口腔癌诊断产品和/或预后评估产品。

权利要求

1. INPP5F蛋白的检测试剂在制备口腔鳞状细胞癌的诊断产品中的应用，其特征在于，所述INPP5F在口腔癌患者的口腔组织样本中的表达量相比正常口腔组织样本显著下降，所述口腔组织为口腔癌组织、口腔癌旁组织、口腔脱落细胞中的一种或几种，所述诊断产品为试剂盒、芯片、检测平台中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述检测平台包括质谱检测平台、PRM检测平台、IVD检测平台中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述诊断产品为早期诊断产品。

说明书

INPP5F的检测试剂在制备口腔癌诊断产品和/或预后评估产

品中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及INPP5F的检测试剂在制备口腔癌诊断产品和/或预后评估产品中的应用。

背景技术

[0002] 目前，用于检测早期口腔癌的方法主要包括临床检查、组织学检查、细胞学检查、活体组织染色、免疫组织化学、光学检测系统、血液学、影像学等，然而，现有诊断方法受创伤性、特异性、敏感性等方面的局限，使得口腔癌的诊断，尤其是早期诊断的效果不够理想，无法达到“早发现、早诊断、早治疗”的水平。

[0003] 肿瘤标志物又称肿瘤标记物，是指特征性存在于恶性肿瘤细胞，或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质，或是宿主对肿瘤的刺激反应而产生的物质，并能反映肿瘤的发生和发展，可监测肿瘤对治疗所作反应的一类物质。肿瘤标志物存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中，能够用免疫学、生物学及化学的方法检测到，在临床上常用于肿瘤的早期发现、普查、筛查、诊断、鉴别诊断与分期，还可用于肿瘤的疗效检测、预后评估等，因此，肿瘤标志物成为现今肿瘤诊断和预后评估的研究热点，如现有技术公开了PLAU、KRT15、SPP1、IL1RN、HOPX、KRT13、 TGM3、MAL、EMP1、NMU或MMP1在制备口腔癌早期诊断产品中的应用，但目前尚未有关于INPP5F能否作为口腔癌标志物的报道。

发明内容

[0004] 本发明针对现有技术的不足，旨在提供INPP5F的检测试剂在制备口腔癌诊断产品和/或预后评估产品中的应用。

[0005] 本发明的另一目的是提供一种口腔癌诊断产品。

[0006] 本发明的又一目的是提供一种口腔癌预后评估产品。

[0007] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：

[0008] 本发明首次研究表明口腔癌组织中的INPP5F蛋白质表达量显著低于口腔癌旁组织中的INPP5F蛋白质表达量，且ROC曲线下面积(AUC)高达0.97，说明INPP5F是一种优异的口腔癌标志物，具有极高的灵敏度与特异性，适用于制备口腔癌诊断产品和/或预后评估产品。因此，INPP5F的检测试剂在制备口腔癌诊断产品和/或预后评估产品中的应用应在本发明的保护范围之内。

[0009] 本发明通过对口腔癌患者的癌组织与癌旁组织中的蛋白进行提取、酶解得到多肽，并进行多肽的脱盐、洗脱、干燥、分级、质谱检测，然后利用Proteome Discoverer软件对得到的质谱数据进行一系列的分析，得到口腔癌组织与口腔癌旁组织的INPP5F蛋白质表达矩阵，再利用SPSS软件进行差异表达分析后可知口腔癌组织中的INPP5F蛋白质表达量显著低于口腔癌旁组织中的INPP5F蛋白质表达量，还经过Western验证得到一致的结果，进一步证明INPP5F蛋白质可作为口腔癌的标志物，其检测试剂可适用于制备口腔癌诊断产品和/或预后评估产品；此外，本发明还利用R软件得到了口腔癌组织中INPP5F蛋白的ROC曲线，其AUC高达0.97，说明INPP5F蛋白作为口腔癌的标志物，具有极高的灵敏度与特异性，适用于制备口腔癌诊断产品和/或预后评估产品。

[0010] 优选地，所述INPP5F在口腔癌患者的口腔组织样本和/或体液样本中的表达量相比正常口腔组织样本和/或体液样本显著下降。因此可通过检测患者口腔组织样本或体液样本中INPP5F的表达量来判断其是否患有口腔癌，INPP5F的表达量越低代表患者的口腔癌越严重。

[0011] 其中，口腔组织作为检测标本时检测效率较高。进一步优选地，所述口腔组织包括口腔癌组织、口腔癌旁组织、口腔脱落细胞中的一种或几种。

[0012] 进一步优选地，所述体液包括唾液、全血、血清、血浆中的一种或几种。最优选地，所述体液为唾液。唾液作为无创性的检测标本，检测更方便。

[0013] 优选地，所述INPP5F包括INPP5F蛋白、INPP5F肽段、INPP5F mRNA、 INPP5F mRNA重组载体、INPP5F mRNA重组细胞中的一种或几种。

[0014] 优选地，所述所述诊断产品和/或预后评估产品包括试剂盒、芯片、检测平台中的一种或几种。

[0015] 进一步优选地，所述检测平台包括质谱检测平台、PRM检测平台、IVD检测平台中的一种或几种。

[0016] 优选地，所述诊断产品为早期诊断产品或分期诊断产品。所述早期诊断产品可通过检测INPP5F的表达量来判断口腔癌疑似患者是否患有口腔癌；所述分期诊断产品可通过检测INPP5F的表达量来判断待检测细胞处于何种阶段，如正常、口腔炎症、癌前病变、口腔癌或术后阶段等。

[0017] 本发明还提供了一种口腔癌诊断产品，以及一种口腔癌预后评估产品，该产品包含INPP5F的检测试剂。

[0018] 本发明具有以下有益效果：

[0019] 本发明研究表明口腔癌组织中的INPP5F蛋白质表达量显著低于口腔癌旁组织中的INPP5F蛋白质表达量，且ROC曲线下面积(AUC)高达0.97，表明INPP5F 是一种优异的口腔癌标志物，具有极高的灵敏度与特异性，因此可用于制备口腔癌诊断产品和/或预后评估产品。

附图说明

[0020] 图1是口腔癌组织与口腔癌旁组织中INPP5F蛋白质的差异表达分析结果。

[0021] 图2是口腔癌组织与口腔癌旁组织中INPP5F表达量的Western验证结果。

[0022] 图3是口腔癌组织中INPP5F蛋白的ROC曲线。

具体实施方式

[0023] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0024] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0025] 实施例1口腔癌组织与口腔癌旁组织中蛋白质的检测

[0026] 一、样品收集

[0027] 18例口腔癌患者的癌组织与癌旁组织由郑州大学第一附属医院的口腔颌面外科提供，均为首诊口腔鳞状细胞癌，诊断明确，病理清楚。

[0028] 二、蛋白提取、酶解

[0029] 取10mg癌组织与10mg癌旁组织，分别切碎后，用PBS多次清洗至无血水残留，离心去上清，再在各管中分别加入RIPA裂解液和磁珠，于组织研磨仪上进行充分研磨，离心，分别收集上清(可溶蛋白质部分)与沉淀(不可溶蛋白质部分)。在沉淀(不可溶蛋白质部分)中直接加入100mM NH4HCO3，混匀并超声，然后加入胰酶，于37℃酶切仪上酶切12小时。在上清中加入5倍体积的预冷丙酮，混匀，置于‑80℃下沉淀1小时。接着10000g的速度离心10分钟，弃去上清，分别取沉淀，沉淀分别为癌组织或癌旁组织中的蛋白质(可溶蛋白质部分)。在蛋白沉淀中加入25mM NH4HCO3，超声使之完全溶解。采用BCA法测定蛋白浓度(所用的蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司)，取100μg蛋白并在蛋白溶液中加入胰酶，于37℃酶切仪上酶切12小时后，在各管中再次加入胰酶，于37℃酶切仪上二次酶切2小时，得到多肽。

[0030] 三、多肽脱盐、洗脱、干燥

[0031] 利用Sep‑pak C18固相萃取小柱(购自Waters公司)对酶切后的多肽进行过柱除盐：首先在Sep‑pak C18固相萃取小柱中加入乙腈使柱子活化，再采用含有 0.1％甲酸的质谱水洗脱柱子中残留的乙腈，使乙腈完全洗脱无残留，再向活化好的Sep‑pak C18小柱中加入酶切后的多肽(包括可溶部分多肽及不可溶部分的多肽)，利用重力使其自然流下，收集多肽流出液，并将多肽流出液重复过柱一次，接着，用含有0.1％甲酸的质谱水洗柱2次，确保没有盐离子残留在柱子中，即完成多肽的脱盐。最后，用含有70％的乙腈和0.1％甲酸的质谱水洗脱Sep‑pak C18 小柱上结合的多肽，收集流出液，将流出液置于真空干燥装置中，直至完全抽干。

[0032] 四、多肽分级‑高效液相色谱分离多肽

[0033] 在真空抽干的各样品管中加入70μL的质谱水，重新复溶多肽样品，利用高效液相色谱仪Waters e2695对各样品进行高效液相色谱的分离，每个样品分离的总时长为60分钟，每分钟收集一管流出液(500μL)，且每6管流出液合并为一个组分，即一个样本最终分为10个组分，最后对各组分分别进行真空抽干。

[0034] 高效液相色谱分离的色谱条件为：流动相A：含有0.1％甲酸的水，流动相B：乙腈；高效液相色谱分析系统为Waters e2695。

[0035] 洗脱条件为：0～7min，98％～95％流动相A，2％～5％流动相B；7～40min， 95％～76％流动相A，5％～24％流动相B；40～46min，76％～66％流动相A，24％～34％流动相B；46～50min，66％～20％流动相A，34％～80％流动相B；50～55min， 20％流动相A，80％流动相B；55min～60min，95％流动相A，5％流动相B。流速为500μL/min。

[0036] 五、质谱上机‑质谱检测及质谱数据的采集

[0037] 将上述高效液相色谱分离得到的各组分依次进行质谱检测，采集质谱数据。

[0038] 在真空抽干后的样品管中加入含有0.1％甲酸的质谱水，重新复溶多肽样品，并采用改良型BCA法测定多肽的浓度(所用的定量比色肽测定试剂盒购自赛默飞世尔公司)，最终使各组分多肽浓度达到1μg/μL，以备质谱上样。以10000g 的速度离心10分钟后，再将上清转移到进样瓶中，进样1μL进行质谱检测。所用的质谱仪为超分辨率蛋白质谱仪Q Exactive HF‑X(购自赛默飞世尔公司)，质谱检测的条件为：分析时长：120分钟；检测方式：正离子；母离子扫描范围： 350‑2000m/z；一级质谱分辨率：60000；二级图谱扫描时：
Maximum IT：45ms， Isolation window：1.6m/z；碎裂方式为高能诱导解离(Higher energy Collision induced Dissociation,HCD)，归一化碰撞能量设定为28％，动态排出时间为
50s，液相采用EASY‑nLC 1200。

[0039] 实施例2 INPP5F蛋白质表达矩阵

[0040] 利用Proteome Discoverer软件分析实施例1中得到的口腔癌组织与口腔癌旁组织的RAW DATA，得到各组织样本的蛋白表达矩阵，并从结果中提取INPP5F 蛋白的Abundances列于表1中。

[0041] 表1 INPP5F蛋白质表达矩阵

[0042]

[0043]

[0044] 利用SPSS软件对表1中口腔癌组织和口腔癌旁组织INPP5F蛋白质的表达水平进行差异分析，结果如图1所示：口腔癌组织中的INPP5F蛋白质表达量低于口腔癌旁组织中的INPP5F蛋白质表达量，且P<0.001，说明INPP5F蛋白质在口腔癌组织和口腔癌旁组织中的表达具有显著性差异，可作为口腔癌的标志物，其检测试剂可适用于制备口腔癌诊断产品和/或预后评估产品。

[0045] 实施例3INPP5F表达量的Western验证

[0046] 从郑州大学第一附属医院的口腔颌面外科再另外收集4例口腔癌患者的癌组织与癌旁组织，将组织分别切碎后，用PBS多次清洗至无血水残留，再分别加入RIPA裂解液和磁珠，于组织研磨仪上进行充分研磨，离心，收集上清(可溶蛋白质部分)与沉淀(不可溶蛋白质部分)，依据组织混合液的体积加入相应量的5×SDS LoadingBuffer，使之稀释至1×SDS LoadingBuffer，于99℃煮10分钟，裂解蛋白并通过Western blotting实验检测INPP5F蛋白的表达情况，结果如图2所示。

[0047] 由图2可知，口腔癌组织中的INPP5F蛋白质表达量显著低于口腔癌旁组织中的INPP5F蛋白质表达量，进一步说明INPP5F蛋白质可作为口腔癌的标志物，其检测试剂可适用于制备口腔癌诊断产品和/或预后评估产品。

[0048] 实施例4 INPP5F作为口腔癌标志物的灵敏度与特异性

[0049] 利用R软件的“pROC”包对表1的数据进行ROC分析，以获得AUC，结果如图3所示：口腔癌组织中INPP5F蛋白的AUC高达0.97，说明INPP5F蛋白作为口腔癌的标志物，具有极高的灵敏度与特异性，适用于制备口腔癌诊断产品和 /或预后评估产品。

[0050] 综上，本发明通过对口腔癌患者的癌组织与癌旁组织中的蛋白进行提取、酶解得到多肽，并进行多肽的脱盐、洗脱、干燥、分级、质谱检测，然后利用Proteome Discoverer软件对得到的质谱数据进行一系列的分析，得到口腔癌组织与口腔癌旁组织的INPP5F蛋白质表达矩阵，再利用SPSS软件进行差异表达分析后可知口腔癌组织中的INPP5F蛋白质表达量显著低于口腔癌旁组织中的INPP5F蛋白质表达量，还经过Western验证得到一致的结果，进一步证明INPP5F蛋白质可作为口腔癌的标志物，其检测试剂可适用于制备口腔癌诊断产品和/或预后评估产品；此外，本发明还利用R软件得到了口腔癌组织中INPP5F蛋白的ROC曲线，其AUC高达0.97，说明INPP5F蛋白作为口腔癌的标志物，具有极高的灵敏度与特异性，适用于制备口腔癌诊断产品和/或预后评估产品。

[0051] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。