proNGF突变体及其用途

摘要

本发明涉及proNGF突变体及其用途。本发明通过对proNGF中的弗林蛋白酶切割位点进行突变以改变弗林蛋白酶(Furin)对所得proNGF突变体的切割效率，使其在细胞表达过程中，在减少proNGF比例的同时提高β‑NGF的表达量。本发明提供的proNGF突变体有助于减小下游纯化去除proNGF的压力，增加上游工艺提高β‑NGF表达量的空间。

权利要求

1. proNGF突变体，其特征在于，所述proNGF突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1、3‑

11所示。

2.一种多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸编码权利要求1所述的proNGF突变体。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2所述的多聚核苷酸。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为原核表达载体或真核表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述真核表达载体为pcDNA3.1、pEGFP/pEGFT、pCHO1.0、pCMV、pSV2或pGN。

6.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求2所述的多聚核苷酸或权利要求3所述的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述细胞为原核细胞或真核细胞。

8.根据权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述真核细胞为CHO细胞或293细胞。

9.权利要求1所述的proNGF突变体、权利要求2所述的多聚核苷酸、权利要求3‑5任一项所述的重组表达载体和/或权利要求6‑8任一项所述的细胞在制备β‑NGF中的用途。

10. β‑NGF的制备方法，其特征在于，包括：将编码权利要求1所述的proNGF突变体的多聚核苷酸插入表达载体中，得到重组表达载体；

将所述重组表达载体转染至细胞中；

所述细胞经培养，获得β‑NGF。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述重组表达载体为真核表达载体，所述细胞为真核细胞。

12. β‑NGF的制备方法，其特征在于，包括：提供权利要求1所述的proNGF突变体；

使用蛋白酶体外切割所述proNGF突变体，得到β‑NGF；

所述蛋白酶为弗林蛋白酶。

说明书

proNGF突变体及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及蛋白质工程领域，尤其涉及在蛋白酶切割位点处具有取代的proNGF突变体及其制备方法，编码该proNGF突变体的多核苷酸及相应的重组表达载体和细胞，以及proNGF突变体在制备β‑神经生长因子中的用途。

背景技术

[0002] 神经生长因子(NGF)能够促进神经元的分化，维持神经元的存活，已报道的临床试验适应症有神经营养性角膜炎、视网膜色素变性、阿尔兹海默氏病等急性或退行性神经系统疾病。完整的人NGF外显子编码241个氨基酸组成的蛋白质，通常称为preproNGF。在内质网中preproNGF的信号肽被切割下来，形成神经生长因子前体(proNGF，223个氨基酸)。proNGF在内质网中以同源二聚体形式存在，然后转移至高尔基体中，经蛋白酶酶切形成成熟的β‑NGF二聚体(单体含有120个氨基酸)。

[0003] proNGF是大脑中NGF的主要形式，在神经退行性疾病和神经外伤的动物模型中检测到proNGF的量增加，提示proNGF与NGF的比例在神经系统疾病的发生和进展中可能具有相关性。proNGF能够激活p75NTR‑sortilin受体复合物(Nykjaer等，2004)，引起神经细胞的凋亡，是影响β‑NGF质量的关键杂质。proNGF还存在两种主要的剪接变体，长proNGF‑A和短proNGF‑B，更增加了NGF相关蛋白产品的复杂性。

[0004] 目前，国内上市的均为鼠神经生长因子，从小鼠颌下腺提取，生产上存在鼠源病毒污染的风险且批间质量控制难度大。意大利Dompé公司2017年上市的世界上第一个重组人β‑NGF药物，其生产工艺是采用原核表达系统(E.coli)表达重组人β‑神经生长因子前体蛋白(rhpro‑NGF)包涵体，包涵体经过稀释复性，用胰蛋白酶切掉前导肽后再纯化得到β‑NGF蛋白。然而，包涵体复性后，β‑NGF的活性会受影响。

[0005] 真核细胞表达的NGF产物中有较多的前体，包括完整的proNGF以及酶切不完全的各种前体变异体。体外使用胰蛋白酶切割proNGF来生产β‑NGF的效率较低，需要大量的酶，这无疑增加了下游纯化工序来去除大量的酶。如果不使用体外酶切，直接纯化去除各种前体变异体，给纯化工艺带来很大的挑战。同时，前体变异体由于含rhNGF序列，与rhNGF产品理化性质相近，以及不同剪接变异体的产生，增加了纯化的复杂性。

发明内容

[0006] 本发明提供了神经生长因子前体的突变体，及其在生产β‑神经生长因子中的用途，旨在提高成熟肽β‑NGF的表达量，降低proNGF的比例，以减轻β‑NGF生产下游的纯化压力。

[0007] 第一方面，本发明提供了proNGF突变体，所述proNGF突变体包含：

[0008] (i)如SEQ ID NO:1‑12所示的氨基酸序列；

[0009] (ii)与SEQ ID NO:1‑12所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或

[0010] (iii)与SEQ ID NO:1‑12所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列。

[0011] 第二方面，本发明提供了一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸编码本发明所提供的所述proNGF突变体。

[0012] 第三方面，本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明所提供的所述多聚核苷酸。

[0013] 在一些实施方案中，所述重组表达载体为原核表达载体或真核表达载体。

[0014] 在一些实施方案中，所述真核表达载体为pcDNA3.1、pEGFP/pEGFT、pCHO1.0、pCMV、pSV2或pGN。

[0015] 第四方面，本发明提供了一种细胞，所述细胞包含本发明所提供的所述重组表达载体。

[0016] 在一些实施方案中，所述细胞为原核细胞或真核细胞。

[0017] 在一些实施方案中，所述真核细胞为CHO细胞或293细胞。

[0018] 第五方面，本发明提供了所述proNGF突变体、所述多聚核苷酸、所述重组表达载体和/或所述细胞在制备β‑NGF中的用途。

[0019] 第六方面，本发明提供了β‑NGF的制备方法，包括：

[0020] 将编码所述proNGF突变体的多聚核苷酸插入表达载体中，得到重组表达载体；

[0021] 将所述重组表达载体转染至细胞中；

[0022] 所述细胞经培养，获得β‑NGF。

[0023] 在一些实施方案中，所述重组表达载体为真核表达载体，所述细胞为真核细胞。

[0024] 第七方面，本发明提供了另一种β‑NGF的制备方法，包括：

[0025] 提供所述proNGF突变体；

[0026] 使用蛋白酶体外切割所述proNGF突变体，得到β‑NGF。

[0027] 在一些实施方案中，所述蛋白酶为前体蛋白转化酶。

[0028] 在一些实施方案中，所述蛋白酶选自弗林蛋白酶、胰蛋白酶、纤溶酶中的至少一种。

[0029] 本发明提供的proNGF突变体均是对proNGF中的弗林蛋白酶切割位点进行突变以改变弗林蛋白酶(Furin)对所得proNGF突变体的切割效率，使其在细胞表达过程中，在减少proNGF比例的同时提高β‑NGF的表达量，所得β‑NGF的N端序列正常并且具有正常的生物学活性。本发明提供的proNGF突变体有助于减小下游纯化去除proNGF的压力，增加上游工艺提高β‑NGF表达量的空间。

附图说明

[0030] 图1是野生型prepro NGF全长氨基酸序列(包括信号肽)；

[0031] 图2是补料批培养(Fed‑Batch)第8天的培养上清还原型SDS‑PAGE分析，图中的0表示野生型NGF，1‑12依次表示NGF突变体1‑12；

[0032] 图3是补料批培养第8天的培养上清Western Blot分析(一抗为β‑NGF抗体)，其中，0表示野生型NGF，1‑12依次表示NGF突变体1‑12；

[0033] 图4是补料批培养第8天的培养上清Western Blot分析(一抗为proNGF抗体)，其中，0表示野生型proNGF，1‑12依次表示proNGF突变体1‑12；

[0034] 图5是补料批培养收获液上清还原型SDS‑PAGE分析，其中，0为野生型NGF，1‑12依次为NGF突变体1‑12；

[0035] 图6是补料批培养收获液上清Western Blot分析(一抗为β‑NGF抗体)，其中，0表示野生型NGF，1‑12依次表示NGF突变体1‑12；

[0036] 图7是补料批培养收获液上清Western Blot分析(一抗为proNGF抗体)，其中，0表示野生型proNGF，1‑12依次表示proNGF突变体1‑12；

[0037] 图8是补料批培养收获液上清SEC层析图谱；

[0038] 图9是纯化后样品的生物学活性曲线，其中，0为野生型NGF，1‑11依次为NGF突变体1‑11；

[0039] 图10是纯化后样品LC‑MS解卷积图谱(野生型0)；

[0040] 图11是纯化后样品LC‑MS解卷积图谱(突变体1)；

[0041] 图12是纯化后样品LC‑MS解卷积图谱(突变体5)；

[0042] 图13是纯化后样品LC‑MS解卷积图谱(突变体11)。

具体实施方式

[0043] 下面将结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

[0044] 本发明提供了proNGF突变体，所述proNGF突变体包含：

[0045] (i)如SEQ ID NO:1‑12所示的氨基酸序列；

[0046] (ii)与SEQ ID NO:1‑12所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或

[0047] (iii)与SEQ ID NO:1‑12所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列。

[0048] 具体地，本发明所述proNGF或proNGF突变体是指人proNGF或人proNGF突变体。为了获得成熟的β‑NGF，proNGF必须被蛋白酶切割。所述proNGF突变体是在野生型proNGF的基础上，对其弗林蛋白酶切割位点进行突变而得。其中，proNGF的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

[0049] 弗林蛋白酶底物的一个显著特点是要求切割序列中P1位和P4位(切割位点氨基端的第1个和第4个氨基酸)必须为精氨酸。‑R‑X‑X‑R↓‑(X：任意氨基酸；↓：切割位点)是弗林蛋白酶最短的切割序列。本发明的发明人发现，对proNGF的P1‑P7位点可以进行不限于单个位点的突变，并且特定组合的突变有助于提高弗林蛋白酶的酶切效率，进而有助于提高β‑NGF的表达量。

[0050] 野生型proNGF的弗林蛋白酶切割位点(115‑121位)以及本发明所述proNGF突变体1‑12的弗林蛋白酶切割位点的氨基酸序列如表1所示。突变后P1‑P7位的氨基酸数目不限于
7个，部分为6个氨基酸，个别为8个氨基酸。

[0051] 表1proNGF突变体与野生型proNGF的弗林蛋白酶切割位点

[0052]来源 氨基酸序列 序列编号
proNGF突变体1 RTHRRKR 14
proNGF突变体2 RTHRRRR 15
proNGF突变体3 RTRRRRR 16
proNGF突变体4 RTHRRRRR 17
proNGF突变体5 RRRVRR 18
proNGF突变体6 RRRRVRR 19
proNGF突变体7 RRRRRR 20
proNGF突变体8 RRRRRRR 21
proNGF突变体9 RRRSKR 22
proNGF突变体10 RRRRSKR 23
proNGF突变体11 RGIRRKR 24
proNGF突变体12 QTKRSKR 25
野生型proNGF RTHRSKR 26

[0053] 相应地，proNGF突变体1‑12与野生型proNGF的氨基酸序列如下(不含信号肽)：

[0054] proNGF突变体1的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：

[0055] EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRRKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA*

[0056] proNGF突变体2的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

[0057] EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRRRRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA*

[0058] proNGF突变体3的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：

[0059] EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTRRRRRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA*

[0060] proNGF突变体4的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：

[0061] EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRRRRRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA*

[0062] proNGF突变体5的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：

[0063] EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRRRVRRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA*

[0064] proNGF突变体6的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)：

[0065] EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRRRRVRRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA*

[0066] proNGF突变体7的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)：

[0067] EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRRRRRRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA*

[0068] proNGF突变体8的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)：

[0069] EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRRRRRRRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA*

[0070] proNGF突变体9的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)：

[0071] EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRRRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA*

[0072] proNGF突变体10的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)：

[0073] EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRRRRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA*

[0074] proNGF突变体11的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)：

[0075] EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRGIRRKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA*

[0076] proNGF突变体12的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)：

[0077] EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNQTKRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA*

[0078] 人野生型proNGF的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)：

[0079] EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA*

[0080] 本发明中，与SEQ ID NO:1‑12所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性是指，在比对时，该百分比的氨基酸在两个序列的比较中是相同的。具体地，本发明包括那一部分氨基酸序列，其与SEQ ID NO:1‑12所示的氨基酸序列的任一条序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

[0081] 本发明的proNGF突变体还包括与SEQ ID NO:1‑12所示的氨基酸序列相比具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列，同时，该“具有一个或多个位点取代、缺失或插入的氨基酸序列”与SEQ ID NO:1‑12所示的氨基酸序列相比，对应proNGF突变体的功能和/或活性没有显著改变，均可以提高弗林蛋白酶对proNGF突变体的切割效率。

[0082] 本发明提供了一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸编码本发明所提供的所述proNGF突变体。

[0083] 本发明中，术语“多聚核苷酸”是指任意长度的核苷酸的聚合形式，可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多聚核苷酸可以包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在修饰，可以在多核苷酸组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多聚核苷酸可以在聚合后进一步修饰，如通过与标记组分的偶联。该术语还指双链分子和单链分子。除非另有说明或要求，本发明的任何实施方案中的多聚核苷酸都包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。

[0084] 应用于多聚核苷酸的术语“编码”是指一种多聚核苷酸，如果在其天然状态下或当通过本领域技术人员熟知的方法操作时，可以被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA，则该多聚核苷酸被称为“编码”多肽。反义链是这种核酸的互补物，编码序列可以从中推导出来。

[0085] 本发明中，可通过基因工程改造方法对野生型proNGF的弗林蛋白酶切割位点进行突变。野生型proNGF的编码核酸序列在本领域是已知的。在一些实施方案中，通过对编码野生型proNGF的核酸序列进行基因水平的诱变，使其编码不同于野生型proNGF的弗林蛋白酶切割位点的氨基酸。对编码野生型proNGF的核酸序列进行基因水平的诱变方法为本领域的常规方法。此外，在已知proNGF突变体的氨基酸序列的情况下，合成相应的编码核苷酸序列也是本领域已知的常规方法。

[0086] 本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明所提供的所述多聚核苷酸。

[0087] 可以使用任何本领域已知的适合的载体用于构建所述重组表达载体。将所述多聚核苷酸连接到表达载体上以构建所述重组表达载体的方法为本领域的常规方法。

[0088] 在一些实施方案中，所述重组表达载体为原核表达载体或真核表达载体。所述真核表达载体可选本领域已知的真核表达载体或其升级改构后的载体，包括但不限于pcDNA3.1、pEGFP/pEGFT、pCHO1.0、pCMV、pSV2、pGN。优选地，所述真核表达载体为pcDNA3.1。

[0089] 本发明还提供了一种细胞，所述细胞包含本发明所提供的所述重组表达载体。

[0090] 可以使用任何本领域已知的适合的细胞用于表达β‑NGF。将所述多聚核苷酸导入所述细胞以表达β‑NGF、或将所述重组表达载体转染至所述细胞表达β‑NGF的方法均为本领域的常规方法。

[0091] 在一些实施方案中，所述细胞为原核细胞或真核细胞。所述真核细胞可选本领域已知的真核宿主细胞或其改建后的细胞，包括但不限于CHO细胞或293细胞。优选地，所述真核细胞为CHO K1细胞。通过使用真核细胞进行表达，可以直接提高宿主细胞弗林蛋白酶的酶切效率，进一步提高β‑NGF的比例，还可得到均一的β‑NGF产物，解决了原核细胞以包涵体形式表达、需要体外复性后酶切、蛋白酶消化不均一的问题。

[0092] 本发明还提供了所述proNGF突变体、所述多聚核苷酸、所述重组表达载体和/或所述细胞在制备β‑NGF中的用途。

[0093] 本发明提供的proNGF突变体可以改变弗林蛋白酶对的proNGF突变体的切割效率，在表达时可以明显减少proNGF的分泌，提高β‑NGF的表达量。同时，所得β‑NGF的N端序列正常并且具有正常的生物学活性。

[0094] 本发明还提供了β‑NGF的制备方法，包括：

[0095] (11)将编码所述proNGF突变体的多聚核苷酸插入表达载体中，得到重组表达载体；

[0096] (12)将所述重组表达载体转染至细胞中；

[0097] (13)所述细胞经培养，获得β‑NGF。

[0098] 具体地，步骤(11)中，对proNGF的弗林蛋白酶切割位点(115‑121位)进行突变的方法为本领域常规方法。将编码所述proNGF突变体的多聚核苷酸插入表达载体构建所述重组表达载体的方法为本领域的常规方法。在一些实施方案中，所述重组表达载体为原核表达载体或真核表达载体。优选地，所述真核表达载体为pcDNA3.1。

[0099] 步骤(12)中，将所述重组表达载体转染至所述细胞的方法为本领域的常规方法。在一些实施方案中，所述细胞为原核细胞或真核细胞。优选地，所述真核细胞为CHO K1细胞。

[0100] 步骤(13)中，对所述细胞进行培养的方法为本领域的常规方法。在一些实施方案中，所述培养方法为补料批培养(Fed‑Batch)。

[0101] 可以理解的是，在生产β‑NGF时，本发明提供的proNGF突变体不仅可以在真核细胞表达过程中直接提高弗林蛋白酶的酶切效率以获得β‑NGF，所述proNGF突变体同样也适用于体外酶切以获得β‑NGF。相应地，本发明还提供了另一种β‑NGF的制备方法，包括：

[0102] (21)提供所述proNGF突变体；

[0103] (22)使用蛋白酶体外切割所述proNGF突变体，得到β‑NGF。

[0104] 具体地，步骤(22)中，具有蛋白酶底物特异性的蛋白酶会切割蛋白质底物，但不会消化蛋白质的活性部分。有多种前体蛋白转化酶可用于切割proNGF以获得β‑NGF。在一些实施例中，所述蛋白酶优选为弗林蛋白酶、胰蛋白酶、纤溶酶中的至少一种，更优选弗林蛋白酶。

[0105] 通过适当调整所述蛋白酶与所述proNGF突变体的比例和切割时间，可以使所述proNGF突变体被完全切割。调整所述比例和所述切割时间的方法为本领域的常规方法。

[0106] 为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例proNGF突变体及其用途的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。

[0107] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0108] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0109] 实施例1proNGF突变体表达载体的构建

[0110] prepro NGF全长241个氨基酸，切除N端18个氨基酸的信号肽以后，形成proNGF，同时还有2个酶切位点，分别酶切形成不完全proNGF，即proA和proB。弗林蛋白酶可以识别118‑121位的RSKR并在最后一个R后面切开，形成120个氨基酸成熟的β‑NGF蛋白。本发明对野生型proNGF的115‑121位RTHRSKR进行突变，形成12个突变体。基因合成12条突变体的全长核苷酸序列，酶切后分别连接到真核表达载体pcDNA3.1上构建12种重组表达载体(1‑
12)，将野生型和突变体1‑12的proNGF全长核苷酸序列经HindIII和BamHI酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1上构建对照重组表达载体。经测序验证序列正确。

[0111] 实施例2不同proNGF突变体的表达评估

[0112] 将构建的13种表达载体，分别转染至CHO K1细胞，并使用L‑氨基亚砜蛋氨酸(MSX)加压筛选，保持压力培养。至细胞活率恢复至90％以上，将获得的细胞池进行补料批培养，至细胞活率接近80％时收获细胞。培养第8天(D8)时，分别取样1ml离心取上清，‑80℃冻存。将D8培养上清和最终收获液分别进行SDS‑PAGE分析、β‑NGF和proNGF抗体的Western Blot分析。

[0113] 补料批培养第8天上清的还原型SDS‑PAGE结果如图2所示。将第8天的SDS‑PAGE成熟肽β‑NGF和前体肽proNGF进行Western Blot分析灰度扫描(如图3、图4所示)，量化分析蛋白的表达量，以及成熟肽与前体肽的比例。由于proNGF的复杂性，检测到的proNGF有两种不同的分子量大小，分别进行灰度扫描。

[0114] 第8天还原型SDS‑PAGE中proNGF、β‑NGF的灰度值及比例如表2所示。

[0115] 表2补料批培养第8天还原型SDS‑PAGE灰度扫描

[0116]

[0117]

[0118] 通过表2可以看出，突变体5、突变体4、突变体3、突变体1的β‑NGF表达量高，且proNGF的比例较低，虽然突变体8、突变体9的proNGF的比例较低，但β‑NGF表达量最低；其中，0表示野生型proNGF，样品1‑12依次表示proNGF突变体1‑12。

[0119] 补料批培养第8天样品的Western Blot灰度扫描数据如表3所示。

[0120] 表3补料批培养第8天Western Blot(proNGF和β‑NGF抗体)灰度扫描

[0121]

[0122] 表3中，由于不同抗体的灵敏度和曝光度不一样，β‑NGF/proNGF的比例为相对值。通过表3(第5列‑β‑NGF)可以看出，β‑NGF表达量较高的依次为突变体0、1、3、2、4、12和5。突变体6、7、10和11表达的proNGF比例很低(第6列为NGF/proNGF，数值高说明proNGF比例低)，但其β‑NGF表达量太低，可能proNGF的表达量低于检测线，而凸显NGF的比例高。而突变体2、
12和0的NGF表达量高，proNGF比例也高。其中，0表示野生型proNGF，样品1‑12依次表示proNGF突变体1‑12。

[0123] 补料培养的最终收获液上清也进行了SDS‑PAGE(如图5所示)和两种抗体的Western Blot分析(如图6‑7所示)。通过图5‑7可以看出，后面几天的表达量明显累积，根据经验，最后几天表达量几乎每天翻倍，收获时间对表达量影响较大。由于最终收获时间12‑14天不一致(突变体2‑5培养12天收样；突变体1、6、7、11培养13天收样；对照0、突变体8‑10培养14天收样)，不同突变体的表达量与D8的检测结果不完全一致。因此第8天的SDS‑PAGE和Western Blot检测结果更有参考意义。除了突变体12比对照野生型的proNGF比例高以外，其他突变体均比对照野生型的proNGF比例低。因此proNGF突变体1‑11均能实现降低proNGF表达的目的，表达量可在后期的克隆筛选及工艺开发优化中提高。现选择突变体1、
5、11及对照野生型0，将最终收获液的上清进行纯化，进一步分析突变位点是否影响弗林蛋白酶的酶切，即成熟β‑NGF的N端是否与野生型一致。

[0124] 实施例3纯化上清制备小量样品

[0125] 将实施例2所选择的突变体1、5、11与野生型对照0的补料批培养最终收获液进行纯化分析，分别制备纯度90％以上的样品。补料批培养最终收获液离心取上清，使用阳离子层析Hitrp SPFF 5ml(Cytiva，29401108)和分子筛凝胶过滤Chromedex 75pg(博格隆，Ezload，16/60，120ml)纯化，收取纯度较高的样品。分子筛凝胶过滤层析洗脱3个主要的紫外吸收峰，大分子蛋白洗脱峰，然后是proNGF，再次是β‑NGF。4个样品的SEC洗脱峰如图8所示，并对proNGF和β‑NGF洗脱峰分析，如表4。

[0126] 表4分子筛纯化层析图分析

[0127]

[0128] 通过图8和表4可以看出，1号样品(突变体1)和对照0(野生型)表达的proNGF比例较高，5号样品(突变体5)和11号样品(突变体11)的proNGF比例较低。1号样品SEC层析前的样品处理方式与其他样品不同，1号样品SP洗脱样品用10kD超滤管浓缩，出现沉淀，0.22μm过滤掉沉淀后上样SEC层析。可能部分NGF形成聚体/沉淀，导致proNGF的含量偏高。因此其他样品没有超滤，取SP洗脱中浓度最高的部分直接进行SEC层析，浓度的低的部分(20‑30％)再次SEC层析，表4以浓度高的部分数据进行比较。

[0129] 由于proNGF的分子量大小与β‑NGF二聚体的大小接近，proNGF不同剪接形式形成的变异体较复杂，可能检测到的proNGF含有β‑NGF二聚体。

[0130] 实施例4纯化样品生物学活性分析(TF‑1细胞增殖法)

[0131] 将生长状态良好的人红细胞白血病细胞(TF‑1细胞，GM‑CSF依赖型，来源于中国食品药品检定研究院重组蛋白室)用基础培养基(1640+10％FBS)以10000个细胞每孔的量接入96孔板，每孔体积100μL；然后每孔分别加入100μL以基础培养基3倍梯度稀释的待测样品溶液，浓度设置为1000、333.33、111.11、37.03、12.34、4.12、1.37、0.46、0.15、0.05ng/ml，每浓度两个复孔；混匀后放入37℃，5％CO2培养箱中培养72h；每孔加入20μL MTS，混匀，37℃孵育4h；于酶标仪490nm处检测各孔的OD值；以Graphpad Prism 7.0软件拟合各组的吸光值‑浓度关系曲线(选择四参数非线性回归方程拟合)；计算出各样品刺激TF‑1细胞增殖的EC50值，结果如图9和表5所示。其中，0表示野生型proNGF，1‑11依次表示proNGF突变体1‑11。

[0132] 表5生物学活性检测结果

[0133]样品 浓度(mg/ml) EC50(ng/ml)
0 0.533 10.77
1 0.756 6.896
2 1.396 28.31
3 0.443 30.20
4 0.854 8.48
5 1.013 10.16
6 0.332 16.73
7 0.674 20.49
8 0.568 12.73
9 0.377 9.38
10 0.81 7.61
11 0.673 11.48

[0134] 生物学活性为细胞法，变异系数较高，与对照0活性EC50的50‑200％范围都可认为相近。除突变体2和突变体3的活性略低以外，其他样品的EC50与对照样品0的EC50相差不大。因此酶切位点的突变不影响β‑NGF蛋白的生物学活性。

[0135] 实施例5纯化样品N端氨基酸测序

[0136] 将纯化的突变体1、5、11和野生型对照0进行氨基酸测序(如图10‑13所示)。图10‑13的测序结果表明：样品1、5、11三种proNGF突变体与野生型proNGF表达的β‑NGF除了含120个氨基酸的完整序列，还有两种氨基酸缺失变异体，即N端缺失5个氨基酸(6‑120aa)和C端缺失2个氨基酸(1‑118aa)。根据研究报道，N端和C端氨基酸缺失的现象在β‑NGF自然表达中比较常见。由表6可见，proNGF突变体与野生型proNGF表达的β‑NGF氨基酸序列一致，仅比例略有差别。因此，突变体1、突变体5和突变体11酶切位点的突变不影响目的蛋白的酶切与成熟。此外，还检测到全长成熟肽NGF可能存在的修饰：氧化和糖化，突变体1、突变体5、突变体
11和野生型都有这两种修饰现象，与突变无关。

[0137] 表6proNGF突变体及野生型proNGF及其2种缺失片段的含量(％)

[0138]样品 完整分子(120aa) 片段(6‑120aa) 片段(1‑118aa)
0 85.02 6.10 8.88
1 81.44 5.57 12.99
5 86.91 5.10 7.99
11 86.79 4.55 8.66

[0139] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。