一种互叶白千层一步法组织培养方法

摘要

本发明公开了一种互叶白千层一步法组织培养方法。本发明进行芽初步诱导、增殖、伸长及生根培养，均采用同一种含有一种低浓度激素的培养基，为MS培养基添加0.05mg/LBA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH5.8。利用该方法从野外取材到获得栽培苗，整个操作过程仅需4个月。之后，试管苗以42天为一个增殖周期，试管苗增殖效率4倍左右，试管苗移栽到土壤的存活率达100％。本发明方法既节约培养成本又简化操作，增殖时间短、生根率高、移栽成活率高，极大地缩短了互叶白千层种苗的生产周期，减少种苗变异风险；可满足目前对互叶白千层优良品种种苗生产技术的需要，在其优良种质维持中具有显著的科学、经济和社会效益意义。

权利要求

1.一种互叶白千层一步法组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1. 切取互叶白千层新梢顶端的嫩枝，去除叶片，经消毒后切成长度1 cm的茎段，然后–2 –1接种到一步培养基上，先在黑暗下培养7天，然后置于光照度50 μmol·m ·s ，光照12 h/天条件下培养，直到侧芽萌发；所述的消毒为：将嫩枝用自来水冲洗干净后，移入含质量分数0.05%吐温80的质量分数0.1%升汞水溶液中浸泡15 min，取出用无菌水冲洗6遍，然后置无菌纸上吸干水分；

S2. 将长至1 cm长的侧芽切下转接至新鲜的一步培养基，光下培养，侧芽增殖且伸长、生根，至长根的芽高达2.5 cm时，将试管苗移出进行炼苗；

所述的一步培养基：为MS培养基添加0.05 mg/L BA、30 g/L蔗糖和8 g/L琼脂，pH5.8。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的互叶白千层新梢顶端的嫩枝为顶端

6 cm以内的嫩枝。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤S2的炼苗为：洗去试管苗根部培养基，定植在装有栽培基质的盆中，覆盖保鲜膜，3天后在保鲜膜上打孔透气，7天后揭开保鲜膜。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的栽培基质为蛭石。

说明书

一种互叶白千层一步法组织培养方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种互叶白千层一步法组织培养快速获得大量种苗的方法。

背景技术

[0002] 互叶白千层(Melaleuca alternifolia(Maiden&Betche)Cheel)，也称澳洲茶树、茶油树，为桃金娘科白千层属植物，原是澳大利亚著名的芳香油料树种：枝叶富含4‑松油醇、桉叶素、α‑松油烯、γ‑松油烯等，被广泛用于制药、香料、日代、食品等行业。于20世纪90年代初引种进我国，现在广东、广西、福建、云南、贵州等地多有种植，是经济价值极高的人工林。

[0003] 目前，互叶白千层的繁殖有3种：种子繁殖、枝条扦插、组织培养快繁。采用组织培养快速繁殖技术由于其在保持母本优良性状、脱毒培养、并可在短时间内获大量栽培苗，且技术可适合进行大规模标准化种苗生产，该技术一经问世，已在植物种苗生产中发挥极其重要的作用。同样地，在白千层引进国内种植后，就陆续有互叶白千层组织培养技术的研究和专利的报道，甚至2019年12月至2020年4月制订了“广东省地方标准《互叶白千层组培育苗技术规程》”。目前，互叶白千层的组织培养包括有外植体选材、消毒、初代培养、增殖培养、瓶内生根、炼苗移栽等过程，特别是目前互叶白千层的组培研究论文和专利中有关初代培养、增殖培养、瓶内生根均采用添加高浓度的不同种类的激素，以诱导侧芽萌发、获得丛生芽或芽增殖、生根，因此，需要配制不同培养基，试管苗历经初代培养、增殖培养、瓶内生根过程，生产周期长，既不利于种苗生产又不利于种苗优良性状的保持。另一方面，长时间使用高浓度的激素、多种激素进行组织培养，存在不利于芽的继代增殖、正常发育和优良性状的保持、增加组培苗变异风险的缺点。

发明内容

[0004] 本发明的目的是针对目前互叶白千层组培技术中芽诱导、芽增殖、芽生根均采用多种激素组合的不同培养基，所需的操作环节多、成本高、激素浓度高或种类多致试管苗变异风险系数高、周期长等缺点，开发了一种只采用一种培养基同时进行芽诱导、芽增殖、芽生根的组培快繁方法。

[0005] 本发明的一种互叶白千层一步法组织培养方法，包括以下步骤：

[0006] S1.切取互叶白千层新梢顶端的嫩枝，去除叶片，经消毒后切成长度1cm的茎段，然–2 –1后接种到一步培养基上，先在黑暗下培养7天，然后置于光照度50μmol·m ·s ，光照12h/天条件下培养，直到侧芽萌发；

[0007] S2.将长至1cm长的侧芽切下转接至新鲜的一步培养基，光下培养，侧芽增殖且伸长、生根，至长根的芽高达2.5cm时，将试管苗移出进行炼苗；

[0008] 所述的一步培养基：为MS培养基添加0.05mg/L BA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH5.8。

[0009] 优选，所述的互叶白千层新梢顶端的嫩枝为顶端6cm以内的嫩枝。

[0010] 优选，所述的步骤S1的消毒为：将嫩枝用自来水冲洗干净后，移入含质量分数0.05％吐温80的质量分数0.1％升汞水溶液中浸泡15min，取出用无菌水冲洗6遍，然后置无菌纸上吸干水分。

[0011] 优选，所述的步骤S2的练苗为：洗去试管苗根部培养基，定植在装有栽培基质的盆中，覆盖保鲜膜，3天后在保鲜膜上打孔透气，7天后揭开保鲜膜。

[0012] 优选，所述的栽培基质为蛭石。

[0013] 优选，所述的方法，还包括如下的步骤S3：将步骤S2获得的试管苗的芽切为长度1cm左右的茎段外植体或将丛生芽分割开作为增殖用外植体，外植体转接至新鲜的一步培养基进行新一轮的芽增殖、伸长及生根培养。

[0014] 优选，所述的方法，培养温度为24±1℃。

[0015] 所述的MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法见Toshio Murashige,Folke Skoog(1962)A Revised Medium For Rapid Growth And Bio Assays With Tobacco Tissue Cultures.Physiollogia Plantarum,15:473‑497。

[0016] 目前已有互叶白千层组织培养快繁技术的报道，但其中的培养方法均采用多种激素组合、高浓度激素配比，从芽诱导、芽增殖到生根培养均采用多种含有不同激素配比的培养基，高浓度激素刺激下的芽增殖及生根培养，可能会造成芽变、继代效率低、生根率低等问题，不利于种质优良性状的保持，极大地影响互叶白千层林业的生产。

[0017] 本发明进行芽初步诱导、增殖、伸长及生根培养，均采用同一种含有一种低浓度激素的培养基。从野外取材到获得栽培苗，整个操作过程仅需4个月。之后，试管苗以42天为一个增殖周期，试管苗增殖效率4倍左右，试管苗移栽到土壤的存活率达100％。本发明方法既节约培养成本又简化操作，增殖时间短、生根率高、移栽成活率高，极大地缩短了互叶白千层种苗的生产周期，减少种苗变异风险；可满足目前对互叶白千层优良品种种苗生产技术的需要，在其优良种质维持中具有显著的科学、经济和社会效益意义。

[0018] 本发明具有以下优点：

[0019] (1)节约培养成本

[0020] 本发明采用的培养基，只含一种低浓度的激素，极大地节约了试管苗培养的成本。

[0021] (2)简化操作过程

[0022] 目前互叶白千层通过组织培养方法获得栽培苗历经芽初代培养、芽增殖培养、芽生根培养，所需的培养基均不同。本发明只采用一种培养基，同时进行芽诱导、芽增殖、芽伸长及生根培养，极大地简化了互叶白千层的组织培养操作。

[0023] (3)缩短试管苗生产周期

[0024] 本发明采用一种培养基，同时进行芽诱导、芽增殖、芽伸长及生根培养，每42天为一个试管苗增殖周期，极大地缩短了试管苗的生产时间。

[0025] (4)试管苗移栽成活率高

[0026] 本发明技术培育的试管苗，100％移栽成活。

附图说明

[0027] 图1为茎段外植体消毒后接种培养基35天时茎段萌发的侧芽长势。

[0028] 图2为将茎段外植体萌发长约1cm的侧芽切下接种新培养基。

[0029] 图3为长约1cm的侧芽接种生长42天时的表型。

[0030] 图4为试管苗移栽温室2个月时的表型。

具体实施方式

[0031] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0032] 实施例1

[0033] 本实施例的互叶白千层一步法组织培养方法，包括以下步骤：

[0034] a.外植体的消毒：选取健康的互叶白千层新梢，切取新梢约6cm长的嫩枝，去除叶片，用自来水冲洗干净后，移入含质量分数0.05％吐温80的质量分数0.1％升汞水溶液中浸泡15min，取出用无菌水冲洗6遍。然后置无菌纸上吸干水分，切成长度1cm的茎段(互叶白千层的茎间特短，长度1cm的茎段上有5个以上节点)为外植体用于接种。经消毒后接种到一步–2 –1培养基上，先在24±1℃、黑暗下培养7天，然后置于光照度50μmol·m ·s 、光照12h/天条件下培养，直到侧芽萌发(图1)。所述的一步培养基：为MS培养基添加0.05mg/L  BA(benzyladenine)、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH5.8。

[0035] b.芽增殖、伸长及生根的培养：将长约1cm的侧芽切下转接至新鲜的一步培养基(图2)，光下培养，侧芽增殖且伸长、生根(图3)，直至长根的芽高约2.5cm时，将长根的试管苗移出进行炼苗；或将其切为长度1cm左右的茎段外植体、或将丛生芽分割开作为增殖用外植体，外植体转接至新鲜的一步培养基进行新一轮的“芽增殖、伸长及生根培养”，期间每21天更换新鲜培养基。

[0036] c.试管苗的炼苗移栽：将长根的、长高至约2.5cm的试管苗从培养瓶中移出，洗去根部培养基，定植在装有蛭石栽培基质的盆中，覆盖保鲜膜，3天后在保鲜膜上打上几个小孔，7天后揭开保鲜膜，存活率100％。定植栽培基质中2个月时的生长状态好(图4)。

[0037] 关于消毒的方法：

[0038] 实施例2

[0039] 本实施例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本实施例使用含质量分数0.05％吐温80的质量分数0.1％升汞水溶液浸泡的时间为10min，对应的消毒效果如表1所示。

[0040] 实施例3

[0041] 本实施例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本实施例使用含质量分数0.05％吐温80的质量分数0.1％升汞水溶液浸泡的时间为20min，对应的消毒效果如表1所示。

[0042] 实施例4

[0043] 本实施例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本实施例在使用含质量分数0.05％吐温80的质量分数0.1％升汞水溶液浸泡15min前，先用体积分数75％乙醇水溶液浸泡30s，对应的消毒效果如表1所示。

[0044] 对比例1

[0045] 本对比例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本对比例将实施例1中的使用含质量分数0.05％吐温80的质量分数0.％升汞水溶液浸泡15min替换为用质量分数5％的NaClO水溶液浸泡15min，对应的消毒效果如表1所示。

[0046] 对比例2

[0047] 本对比例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本对比例使用的外植体不是去除叶片的茎段，而是带有叶片的茎段，对应的消毒效果如表1所示。

[0048] 分别按照实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例1和对比例2的方法进行平行培养，培养时间21d，经统计，结果如表1所示。

[0049] 表1不同外植体类型、消毒溶液和消毒时间对互叶白千外植体消毒的影响[0050]

[0051] 从表1可以看出，以去叶茎段为外植体，采用含质量分数0.05％吐温80的质量分数0.1％升汞水溶液浸泡消毒15min，在培养21d后外植体污染率为低于10％，消毒效果远远优于实施例2、3，对比例1、对比例2。实施例1的外植体存活率超过83％，远远优于实施例2、实施例3、实施例4、对比例1、对比例2。

[0052] 关于初代芽诱导、增殖、伸长及生根培养基的BA浓度：

[0053] 实施例5

[0054] 本实施例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：所用的一步培养基中BA浓度与实施例1的不同，本实施例的一步培养基含有的BA为0.5mg/L；培养后初代芽诱导、芽增殖、伸长和生根结果如表2所示。

[0055] 实施例6

[0056] 本实施例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：所用的一步培养基中BA浓度与实施例1的不同，本实施例的一步培养基含有的BA为0.01mg/L，培养后初代芽诱导、芽增殖、伸长和生根结果如表2所示。

[0057] 对比例3

[0058] 本对比例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：所用的培养基中不含BA，培养后初代芽诱导、芽增殖、伸长和生根结果如表2所示。

[0059] 对比例4

[0060] 本对比例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：所用的基本培养基都是1/2MS培养基(指将MS培养基中的所有元素减半得到的培养基)，不含BA；即本对比例的培养基为：1/2MS培养基添加30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH5.8；培养后初代芽诱导、芽增殖、伸长和生根结果如表2所示。

[0061] 分别按照实施例1、实施例5、实施例6、对比例3和对比例4的方法进行平行培养，培养时间42d，经统计，初代芽诱导、芽增殖、伸长和生根培养结果如表2所示。

[0062] 表2不同培养基对互叶白千层初代芽诱导、增殖、伸长及生根的影响

[0063]

[0064] 从表2可以看出，培养基为MS培养基添加0.01‑0.5mg/L BA的情况下，初代芽的诱导率均为100％，效果高于对比例3和对比例4；培养基为MS培养基添加0.05‑0.5mg/L BA的情况下，芽增殖系数最高，效果高于实施例6、对比例3和对比例4；生根培养以实施例1的最高，生根率100％，远远优于实施例5、实施例6、对比例3、对比例4。综上，培养基中添加0.05mg/L BA在芽初代培养、芽增殖、生根培养中效果最佳，培养42d后初代芽诱导率达
100％，增殖系数达4.2，生根率达100％且根部长势好。