一种利用甘露糖结合凝集素阻断新冠病毒感染的方法

摘要

本发明公开了人甘露糖结合凝集素（Mannose‑Binding Lectin）在抗新型冠状病毒中的应用,其特征在于所描述蛋白序列如序列表SEQ NO.1所示。抗病毒实验显示重组表达的MBL可以有效阻断新型冠状病毒对VERO细胞的侵染。因此，可以人甘露糖结合蛋白为活性成分用于制备抗新型冠状病毒的药物。

权利要求

1.一种突变型人甘露糖结合凝集素，其特征在于，所述凝集素序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的突变型人甘露糖结合凝集素在制备治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。

说明书

一种利用甘露糖结合凝集素阻断新冠病毒感染的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种人血浆蛋白——甘露糖结合蛋白阻断新型冠状病毒（SARS‑CoV‑2）入侵及感染细胞的新型阻断方法。

背景技术

[0002] 新型冠状病毒侵染细胞的过程主要由其表面的S蛋白（Spike）结合宿主鼻腔、肺、小肠等器官组织上皮细胞膜上的血管紧张素转换酶2（ACE2）介导的。S蛋白通常以同源三聚体的形式在病毒表面形成“突刺”，结合ACE2、引起病毒与宿主细胞膜融合进入细胞。因此，阻断S蛋白与ACE2蛋白结合可以作为治疗新冠肺炎的靶标。新型冠状病毒S蛋白是一个高度糖基化的蛋白，单体包含至少22个N‑连接的糖链，三聚体的S蛋白至少有66个糖基化位点，表面附着有大量低聚甘露糖型、高甘露糖型以及含甘露糖复杂型的糖链，这些糖链在病毒表面形成了一层壁垒，能够遮蔽抗原表位、阻止抗体与病毒的结合，从而引起免疫逃逸和药物脱靶效应。同时，有研究表明新型冠状病毒表面某些糖链可以稳定S蛋白开放构象，从而促进其与ACE2的结合。因此，新型冠状病毒表面糖链是其免疫逃逸及展现ACE2高亲和性的关键。所以，以新型冠状病毒表面S蛋白糖链为靶点进行阻断将是一个有效的病毒抑制手段。

[0003] 甘露糖结合蛋白是C型凝集素超家族成员，由肝细胞分泌的内源性胶原样糖蛋白，是一种重要的模式识别受体。MBL是一种急性期反应蛋白，主要分泌于血清，在非特异性免疫反应中发挥重要作用。成熟的 MBL肽链从 N端到 C端依次是富含半胱氨酸(Cys)的 N端区域、胶原样区域 CLR、α螺旋状结构的颈区以及 C端的糖识别区CRD。在天然免疫系统中，MBL具有重要的生物调节功能，CRD可选择性地与病原微生物、坏死损伤细胞、凋亡细胞和肿瘤细胞等表面富含甘露寡糖的配体结合，CLR与甘露聚糖相关丝氨酸蛋白酶MASPs结合形成MBL‑MASPs复合物，激活补体凝集素途径，从而发挥免疫调节功能；也可与吞噬细胞表面的特定胶凝素受体（C1qR)结合以启动嗜中性粒细胞介导吞噬作用；还可通过刺激细胞分泌细胞因子等炎症反应而达到保护人体的目的。研究表明，MBL对SARS‑CoV‑1、HIV、甲型流感病毒等有明显的抑制作用；然而，MBL对于新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的抑制还未见报道。因此，本发明对MBL进行S蛋白结合活性及SRAS‑CoV‑2抗病毒活性测定，发现其能特异高效结合S蛋白糖链；抗病毒活性实验表明黄精凝集素蛋白可以有效阻断新型冠状病毒对VERO细胞的侵染，加入甘露糖对MBL蛋白甘露糖糖结合位点进行封闭后凝集素蛋白抗病毒能力大幅降低。因此，可以以MBL蛋白为活性成分制备抗新型冠状病毒的药物。本发明为利用MBL蛋白阻断新型冠状病毒SRAS‑CoV‑2入侵感染以达到阻断和预防病毒感染效果的新型阻断方法提供可能。

发明内容

[0004] 本发明目的是提供一种利用人血清甘露糖结合凝集素蛋白阻断新型冠状病毒入侵感染的方法。

[0005] 本发明的又一目的是在于提供上述利用利用人血清甘露糖结合凝集素蛋白阻断新型冠状病毒入侵感染的应用。

[0006] 本发明的目的通过以下方式实现：

[0007] （1）甘露糖结合蛋白C（Mannose Binding Protein‑C）的表达纯化。

[0008]  （2）进行病毒TCID50（组织半数感染量）测定，检验步骤（1）中待测试蛋白样品甘露糖结合蛋白的抗病毒活性。

[0009] 本发明的有益效果在于：利用人体内源蛋白进行病毒阻断，相较于小分子药物及异源蛋白，免疫原性更低、副作用更小，开发成本低、容易获得；能够特异性靶向结合冠状病毒表面数量众多的低聚甘露糖型、高甘露糖型以及含甘露糖复杂型的糖链。与传统疫苗、抗体等靶向药物不同，以甘露糖结合蛋白为基础进行的病毒阻断靶向新型冠状病毒表面糖链，可在一定程度上解决病毒利用表面糖被遮蔽抗原表位以及氨基酸序列突变进行免疫逃逸的问题。因此，利用甘露糖结合蛋白可通过结合新型冠状病毒表面甘露聚糖糖链来对病毒进行封闭，阻断病毒和宿主细胞的识别结合，从而防止新型冠状病毒侵染宿主细胞，达到低毒副作用的高效抗病毒目的。

附图说明

[0010] 图1：纯化MBL 考马斯亮蓝染色检测；

[0011] 图2：MBL 对新冠病毒感染抑制曲线。

具体实施方式

[0012] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0013] 实施例1：重组甘露糖结合蛋白的表达纯化

[0014] 材料：pCMV‑MBL2质粒（义翘神州）；HEK293T细胞；Manna‑agarose 树脂（Sigma）；ITS‑A（源培）；L‑抗坏血酸（BBI）。

[0015] （1）.pCMV‑MBL2质粒转染HEK293T细胞，6h后将培养基替换为RPM‑1640，加入终浓度1% ITS和50μM抗坏血酸，37℃、5%CO2培养96h后收集培养液，4000g离心后弃去细胞沉淀，称为样品粗品。

[0016] （2）.用TBS（含10mM CaCl2）平衡Manna‑agarose 树脂并充分洗涤后与样品粗品于4℃垂直混匀仪混匀16h。

[0017] （3）.将树脂和样品混合物装入层析柱分离，以TBS‑Ca2+充分洗涤（约15‑20倍柱体积）后，用20mM EDTA进行洗脱。

[0018] （4）.用30kD超滤管4000g离心浓缩洗脱液。

[0019] （5）.将浓缩液对TBS进行透析，并进行SDS‑PAGE凝胶电泳检测，结果见（图1,纯化MBL 考马斯亮蓝染色检测）。

[0020] 实施例2：重组甘露糖结合蛋白对新型冠状病毒阻断实验

[0021] 1. 细胞准备：在实验前1天，取状态良好的Vero细胞，用胰酶消化、计数，再用完全5
培养基稀释细胞，配置成1.5×10 / mL浓度的细胞悬液，向96孔细胞培养板每孔加入100 μL细胞悬液，放置于CO2培养箱中培养过夜，在感染实验前，观察细胞状态，如细胞状态良好，则用TBS洗2‑3次，每孔加入维持液100 μL。

[0022] 2. 将MBL纯品用TBS(含2mM CaCl2）稀释至20μg/mL作为初始浓度；并设置无MBL孔为对照组。

[0023] 3. 样品稀释：按照两倍倍比稀释，在96孔U型板中稀释样品，每一样品至少需有两个重复，保证稀释后每个待测孔有40 μL体积的待测样品。

[0024] 4. 病毒与MBL样品孵育：取已知TCID50滴度的病毒，用维持液将病毒稀释至浓度为100 TCID50/35 μL（可根据实验需要进行调整，部分实验为200 TCID50/35 μL），之后向各MBL样品孔加入35 μL体积的病毒稀释液，放置于安全柜内室温孵育2 h，在此期间，准备好Vero细胞板，用PBS洗两遍，待孵育完成后，按35 μL/孔的量取病毒与样品的孵育混合液，按对应孔加入细胞中，放置于CO2培养箱中37°C孵育2 h。

[0025] 5. 每个细胞培养孔加入病毒维持液120 μL，放置于细胞培养箱37°C培养3‑5天，观察病毒抑制情况，计算IC50,得出IC50=25μg/mL（图2,MBL 对新冠病毒感染抑制曲线）。