一种国兰组培诱导方法

摘要

本发明公开了一种国兰组培诱导方法，包括下述步骤：第一步：种子消毒；第二步：种子萌发及龙根诱导；第三步：龙根增殖；第四步：龙根分化出苗；第五步：生根及移栽，第二步种子萌发及龙根诱导以及第三步龙根增殖步骤采用的培养基配方均为：MS培养基+花宝2号4g/L+蛋白胨4g/L+激动素(KT)1mg/L+萘乙酸(NAA)1mg/L+活性炭0.5g/L以及蔗糖30g/L和琼脂6.5g/L，pH值为5.0‑5.5，且培养方式为光照强度为0的暗培养，培养温度为25±2℃。根据本发明的国兰组培诱导方法具有无污染、种子萌发率高、增殖倍数多、根状茎分化率高，大幅降低组培成本等优点。

权利要求

1.一种国兰组培诱导方法，其包括下述步骤：

第一步：种子消毒；第二步：种子萌发及龙根诱导；第三步：龙根增殖；第四步：龙根分化出苗；第五步：生根及移栽，其特征在于，第一步种子消毒步骤具体为：选择成熟度达70‑80％的国兰蒴果，用水冲洗干净，无菌超净工作台上75％酒精消毒1‑2分钟，再将蒴果果荚放入95％酒精速蘸后取出，在酒精灯处点燃，自然熄灭后重复操作3次；

第二步种子萌发及龙根诱导以及第三步龙根增殖步骤采用的培养基配方均为：MS培养基+花宝2号4g/L+蛋白胨4g/L+激动素1mg/L+萘乙酸1mg/L+活性炭0.5g/L以及蔗糖30g/L和琼脂6.5g/L，pH值为5.0‑5.5，且培养方式为光照强度为0的暗培养，培养温度为25±2℃；

第四步龙根分化出苗采用的培养基配方为：MS+花宝2号2g/L+蛋白胨0.25g/L+精氨酸

0.05g/L+6‑苄氨基嘌呤2mg/L+萘乙酸0.75mg/L+活性炭0.35g，蔗糖35g/L，琼脂6g/L，pH值

5.0‑5.5，培养条件为光照强度1500‑2000LX的光培养；

第五步生根及移栽采用的培养基配方为：MS+花宝2号1g/L+蛋白胨0.5g/L+吲哚丁酸

1mg/L+萘乙酸1mg/L+活性炭0.75g/L,蔗糖35g/L，琼脂6g/L，pH值为5.4。

2.根据权利要求1所述的国兰组培诱导方法，其特征在于，所述光培养的光照时长为

10‑12小时，温度25±2℃。

3.根据权利要求1所述的国兰组培诱导方法，其特征在于，所述暗培养为：将培养基置于培养装置中，以黑色不透光材料覆盖培养装置。

4.根据权利要求3所述的国兰组培诱导方法，其特征在于，所述国兰可以是春兰、蕙兰、建兰、墨兰、寒兰、莲瓣兰和春剑中的任一种。

说明书

一种国兰组培诱导方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及植物组织培养技术。特别是，本发明涉及一种国兰组培诱导方法。

背景技术

[0002] 以下对本发明的相关技术背景进行说明，但这些说明并不一定构成本发明的现有技术。

[0003] 国兰是我国传统名花，具有悠久的栽培历史，其品种主要包括春兰、蕙兰、建兰、墨兰、寒兰、莲瓣兰和春剑等。国兰主要分布于我国的东南地区和西南地区，大部分品种具有较高的观赏价值和开发、利用价值。

[0004] 但是众所周知，国兰野生资源有限，不能随意采挖。有一些市场化运行的国兰品种单价高，无性繁殖速度慢，也不能满足市场的大量需求。因而，通常以种子作为外植体，进行组织培养，以达到大规模繁殖的目的，而且能有效避免对国兰植株的破坏。然而，国兰的兰花种子非常细小，一个蒴果中有几十万到上百万粒种子，微小种子的胚多未成熟或发育不全，难以提供种子萌发所需要的营养，导致种子在自然条件下萌发率极低。通过组织培养的方法，人工配制合适的培养基，可以有效提高种子萌发率，推广大规模繁殖。

[0005] 现有技术的方法中，关于种子消毒步骤，一般是在杂交蒴果7‑8分成熟且未开裂时采下，然后进行消毒处理。具体地，例如，用体积分数75％酒精擦洗果实表面，再用质量分数0.1％升汞溶液或质量分数1％‑2％的次氯酸钠溶液消毒15‑20min，再以无菌水冲洗4‑5次。
然后将消毒后的蒴果在无菌纸上纵切，将其粉末状的种子悬浮于无菌水中，超声清洗5‑
10min。然后将清洗后的种子悬浮液均匀滴播在种子萌发培养基培养，培养温度26±0℃，光照强度1500‑2000LX，光照时间12小时/天，种子在萌发培养基上萌发形成龙根，即，根状茎。
常用的种子萌发培养基为：每升含有肌醇80‑120mg、萘乙酸(NAA)0.5‑2.0mg、椰子汁50‑
200ml、香蕉汁50‑100ml、活性炭1‑2g、蔗糖15‑20g、琼脂5‑6g，其余为ZJ1培养基，pH值约为
5.5‑5.7。然而，升汞属于剧毒化学试剂，因而存在不易清洗干净，容易有残留，而且对环境污染大，不环保，还需要专门机构对相关废液进行处理等缺点。次氯酸钠是强碱弱酸盐，有强氧化性，主要用于物体表面和环境等的消毒。例如，家庭消毒用的84消毒液就是一种以次氯酸钠为主要成分的消毒剂，也存在易残留、不环保等缺点，污染率为10％。此外，以前述方法及培养基培养的国兰种子的萌发率较低，仅为20‑30％左右。龙根增殖倍数不高，最多为4倍，且培养时间较长，通常为90天之久。

[0006] 为了解决上述问题，本申请的发明人团队经过长期的试验获得了一种国兰组培诱导方法，其能够避免前述问题，不产生污染，且提高发芽率及龙根增殖倍数，减少培养时间，降低了成本，提高了效率。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提出一种国兰组培诱导方法，其具有无污染、种子萌发率高、增殖倍数多、根状茎分化率高，并且同时能大幅降低组培成本。

[0008] 根据本发明的一个方面，提供了一种国兰组培诱导方法，包括下述步骤：第一步：种子消毒；第二步：种子萌发及龙根诱导；第三步：龙根增殖；第四步：龙根分化出苗；第五步：生根及移栽，第二步种子萌发及龙根诱导以及第三步龙根增殖步骤采用的培养基配方均为：MS培养基+花宝2号4g/L+蛋白胨4g/L+激动素(KT)1mg/L+萘乙酸(NAA)1mg/L+活性炭
0.5g/L以及蔗糖30g/L和琼脂6.5g/L，pH值为5.0‑5.5，且培养方式为光照强度为0的暗培养，培养温度为25±2℃。

[0009] 优选地，第四步龙根分化出苗采用的培养基配方为：MS+花宝2号2g/L+蛋白胨0.25g/L+精氨酸0.05g/L+6‑苄氨基嘌呤(6‑BA)2mg/L+萘乙酸(NAA)0.75mg/L+活性炭
0.35g，蔗糖35g/L，琼脂6g/L，pH值5.0‑5.5，培养条件为光照强度1500‑2000LX的光培养。

[0010] 优选地，第五步生根及移栽采用的培养基配方为：MS+花宝2号1g/L+蛋白胨0.5g/L+吲哚丁酸(IBA)1mg/L+萘乙酸(NAA)1mg/L+活性炭0.75g/L，蔗糖35g/L，琼脂6g/L，pH值为5.4。

[0011] 优选地，所述种子消毒步骤为：选择成熟度达70‑80％的国兰蒴果，用水冲洗干净，无菌超净工作台上75％酒精消毒1‑2分钟，再将蒴果果荚放入95％酒精速蘸后取出，在酒精灯处点燃，自然熄灭后重复操作3次。

[0012] 优选地，所述光培养的光照时长为10‑12小时，温度25±20C。

[0013] 优选地，所述暗培养为：将培养基置于培养装置中，以黑色不透光材料覆盖培养装置。

[0014] 优选地，所述国兰可以是春兰、蕙兰、建兰、墨兰、寒兰、莲瓣兰和春剑中的任一种。

[0015] 根据本发明的国兰组培诱导方法能够避免了消毒产生的污染，提高发芽率及龙根增殖倍数，减少了培养时间，降低能耗，具有较强的推广应用价值。

具体实施方式

[0016] 下面结合具体的示例性实施方式来对本发明进行详细描述。但对示例性实施方式的描述仅仅是出于示范目的，而绝不是对本发明及其应用或用法的限制。

[0017] 国兰主要包括春兰、蕙兰、建兰、墨兰、寒兰、莲瓣兰和春剑，或者说，这些品种都可统称为国兰。在以下的描述中，所有的步骤方法均适用于上述国兰中的任一品种。换言之，如无特别说明，上述所有的国兰品种均可应用。为描述简便起见，下面统称为国兰。

[0018] 在根据本发明的国兰组培诱导技术的一实施方式中，第一步：种子消毒。具体地，选择成熟度达到70‑80％的国兰蒴果，用水冲洗干净，无菌超净工作台上75％酒精消毒1‑2分钟，例如，1.5分钟，随后将蒴果果荚用镊子夹住放入95％酒精速蘸后取出，在酒精灯处点燃，自然熄灭后重复此操作3次，完成消毒。蒴果消毒后即表明种子已完成消毒。

[0019] 需要说明的是：现有技术中的国兰组织培养大部分是以国兰未开口的芽为外植体，但是以芽为外植体材料有限，而且对母株会有一定的伤害性。本发明选取种子作为外植体材料，优点在于外植体材料充足，不会对母体造成损害。

[0020] 以前述消毒方法消毒接种的种子消毒成功率可达80％‑100％。在接种30瓶的试验中，污染瓶数为0瓶，即污染率为0％。试验中，同样对比了现有技术的消毒处理，即将兰花蒴果以75％酒精消毒后，再放入0.1％升汞或次氯酸钠消毒剂中进行消毒，污染率为10％。这是由于升汞属于剧毒化学试剂，对人和环境有害，易于污染，此外还需专门机构对相关废液进行处理。次氯酸钠是强碱弱酸盐，有强氧化性，易残留。本发明中由于不再需要使用0.1％升汞或次氯酸钠消毒剂进行消毒，因而，不仅节省了步骤和操作时间，更避免了环境污染，使得本发明的种子消毒步骤更简化，也更环保。下述表1为本发明与现有技术消毒污染情形对比。

[0021] 表1.本发明与现有技术消毒污染情形对比；

[0022]

[0023] 第二步：种子萌发及龙根诱导。具体地，将消毒后的蒴果放在无菌纸上以手术刀切开，注意无菌操作时严禁手部碰触到切开的蒴果内部，防止人为操作污染。然后将其中的种子均匀播撒到第一培养基上，播种完成后加少量无菌水。该第一培养基也称为种子萌发及龙根诱导培养基。该第一培养基配方为：MS培养基+花宝2号4g/L+蛋白胨4g/L+激动素(KT)1mg/L+萘乙酸(NAA)1mg/L+活性炭0.5g/L以及蔗糖30g/L和琼脂6.5g/L，pH值为5.0‑5.5。MS培养基与花宝2号均购自易生石木(北京)生物科技有限公司。蛋白胨，也称胰蛋白胨，购自国药集团化学试剂公司。激动素(KT)也称6‑糠氨基嘌呤，购自国药集团化学试剂公司。萘乙酸(NAA)也称1‑萘乙酸，购自国药集团化学试剂有限公司。活性炭也称活性炭粉，购自易生石木(北京)生物科技有限公司。蔗糖可采用普通的绵白糖。琼脂也购自易生石木(北京)生物科技有限公司。

[0024] 在第一培养基上采用的培养方式为暗培养，培养温度为25±2℃，即培养装置完全处于黑暗状态，例如可以采用黑色不透光材料覆盖，光照强度为0。作为示例，第一培养基置于例如为培养瓶的培养装置中，种子接种到第一培养基后，将培养瓶放入培养室的培养架上，用报纸或黑色不透光材料覆盖培养瓶。整个培养过程不见光。相比于光培养，暗培养在能够达到同样培养效果的情况下，可以节电，明显降低组培成本。

[0025] 之后经大约60‑90天萌发出原球茎，种子萌发率为80％。原球茎再经过60天左右可诱导形成龙根。

[0026] 实验证明，种子萌发及龙根诱导阶段采用暗培养，能够实现种子萌发率达80％。现有技术中通常是在该阶段采用光培养，其发芽率仅为20‑30％。下述表2为本发明的暗培养及现有技术的光培养的种子发芽率比较：

[0027] 表2.本发明的暗培养与现有技术的光培养的种子萌发率对比

[0028]

[0029] 第三步：龙根增殖。具体地，在第二步形成龙根到龙根长满组培瓶后，将其及时转接到第二培养基进行龙根增殖。该第二培养基也称为龙根增殖培养基。第二培养基配方与上述的第一培养基配方完全相同。

[0030] 在第二培养基中的培养条件也为暗培养，培养温度25±2℃。即，使培养瓶完全处于黑暗状态。例如，用黑色塑料袋覆盖培养瓶，使之完全处于黑暗状态，光照强度为0。暗培养60天后龙根长满培养瓶，重新切分转接，龙根增殖倍数可达6.3倍。相比于现有技术大大提高了龙根增殖倍数。龙根增殖倍数的计算方式为：龙根增殖倍数＝增殖后龙根数/接种龙根数。龙根增殖越多，后续分化出苗越多。下述表3为本发明的龙根增殖倍数与现有技术的增殖倍数对比表格。

[0031] 表3.本发明与现有技术龙根增殖倍数对比

[0032]

[0033]

[0034] 上述对比表明，相比于现有技术中的光培养，本发明在第一培养基和第二培养基中的培养阶段均采用了光照强度为零的暗培养，大大提高了龙根增殖倍数。同时具有节电、降低组培成本的技术效果。

[0035] 现有技术中，在第一和第二培养基中的培养阶段多为光照培养，通常采用的光照强度1500‑2000LX。光照时长一般10‑12小时，非常耗电。

[0036] 第四步：龙根分化出苗。具体地，将第三步中暗培养出的龙根切成长约1.5cm长度，接种到分化出苗培养基，也称第三培养基中。该第三培养基配方为：MS+花宝2号2g/L+蛋白胨0.25g/L+精氨酸0.05g/L+6‑苄氨基嘌呤(6‑BA)2mg/L+萘乙酸(NAA)0.75mg/L+活性炭0.35g，蔗糖35g/L，琼脂6g/L。pH值5.0‑5.5。精氨酸也称L‑精氨酸，购自国药集团化学试剂公司。6‑BA为6‑苄氨基嘌呤购自易生石木(北京)生物科技有限公司。在第三培养基中的培养条件为光培养，其中光照强度1500‑2000LX，光照时间10‑12小时，温度25±2℃。接着，50天‑60天开始转化出芽。实验证明使用该第三培养基并且采用上述光培养，根状茎分化率可达到100％，大大高于现有技术的根状茎分化率。

[0037] 在该阶段现有技术中的培养基通常为：花宝1号+萘乙酸0.1‑5mg/L+6‑苄氨基嘌呤1‑5mg/L+香蕉汁500‑1500mg/L+马铃薯汁500‑1500mg/L+蛋白胨500‑1500mg/L+活性炭0.5‑
2mg/L，出芽率为53.3‑80％。现有技术中的根状茎分化率为53.3‑80％。下述表4为本发明与现有技术的龙根分化出苗、根状茎分化率及培养时间的对比表：

[0038] 表4.本发明与现有技术的龙根分化出苗、根状茎分化率及培养时间的对比[0039]

[0040] 第五步：生根及移栽。具体地，将第四步龙根分化出的生长健壮试管苗转移到生根培养基中，该生根培养基也称为第四培养基，其配方为：MS+花宝2号1g/L+蛋白胨0.5g/L+吲哚丁酸(IBA)1mg/L+萘乙酸(NAA)1mg/L+活性炭0.75g/L，蔗糖35g/L，琼脂6g/L。pH值为5.4。吲哚丁酸(IBA)购自国药集团化学试剂公司。30‑50天试管苗长出3‑4条根，根长1cm左右时即可移栽。移栽基质选择水苔，提前使水苔充分吸水备用。将国兰组培苗从培养瓶中轻轻取出，洗净根部附着的培养基，1000倍多菌灵浸泡消毒，充分吸水的水苔将国兰种苗根部包裹严实，栽入栽培盆中。瓶苗不打瓶口提前2‑3天放到移栽温室，使其提前适应移栽环境可有效提高移栽成活率。实验证明，移栽成活率可达95％‑100％。与现有技术相比，在大幅降低能耗和组培成本的情况下，移栽成活率仍可高达95％‑100％。

[0041] 根据本发明的国兰组培诱导方法相比于现有技术由于采用种子作为外植体，具体外植体材料充足，不会对母体造成损害的优点。此外，在种子消毒阶段不使用升汞或次氯酸钠消毒剂，种子消毒步骤的污染率降低至0％。进一步地，根据本发明的国兰组培诱导方法通过在种子萌发及龙根诱导阶段，以及在龙根增殖阶段采用了新的培养基配方以及暗培养条件，能够在大幅提高萌发率及龙根增殖倍数的同时降低能耗。此外，根据本发明的国兰组培诱导方法通过在龙根分化出苗阶段和生根及移栽阶段采用新的培养基配方能够增加分化出苗数，提高根状茎分化率，缩短培养时间的同时，具有较高的移栽成活率，提高了经济效益。

[0042] 虽然参照示例性实施方式对本发明进行了描述，但是应当理解，本发明并不局限于文中详细描述和示出的具体实施方式，在不偏离权利要求书所限定的范围的情况下，本领域技术人员可以对所述示例性实施方式做出各种改变。