一种模拟膀胱结构的类器官培养装置及其应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种模拟膀胱结构的类器官培养装置及其应用。本发明所述的模拟膀胱结构的类器官培养装置，包括上层通道结构和下层通道结构，在所述上层通道结构和所述下层通道结构之间设置一层多孔膜进行分隔，以及在所述上层通道结构和所述下层通道结构的上下两侧分别设置盖部和底部。本发明所述的装置可以模拟膀胱癌静脉给药和灌注给药。

权利要求

1.一种模拟膀胱结构的类器官培养装置进行模拟膀胱癌给药的方法，其特征在于，所述类器官培养装置包括上层通道结构和下层通道结构，在所述上层通道结构和所述下层通道结构之间设置一层多孔膜进行分隔，以及在所述上层通道结构和所述下层通道结构的上下两侧分别设置盖部和底部；所述上层通道结构由至少2个上层加样孔、1个上层连接通道和1个上层培养通道组成，所述上层加样孔中的1个与所述上层连接通道和所述上层培养通道相互连通；所述下层通道结构由至少1个下层加样孔、至少1个下层连接通道和1个下层培养通道组成，所述下层加样孔的数量与所述下层连接通道的数量一致，并与所述下层培养通道相互连通；所述多孔膜上设置至少1个连接孔，与至少1个上层加样孔和至少1个下层加样孔对应并连通；所述盖部上面设置盖部加样孔与上层通道结构上的加样孔相对应并连通；所述底部直接与所述下层通道结构连接；所述模拟膀胱癌给药的方法包括以下步骤：步骤1：将所述类器官培养装置的盖部、上层通道结构、多孔膜、下层通道结构和底部按顺序组装在一起；

步骤2：通过所述类器官培养装置盖部上与上层通道结构相连通的盖部加样孔加入肌母细胞、成纤维细胞以及HUVEC脐静脉血管内皮细胞，同时加入相应的细胞培养基，摇匀后静置培养，待细胞贴壁以后再通过盖部上与下层通道结构相连通的盖部加样孔加入肌母细胞、成纤维细胞、HUVEC脐静脉血管内皮细胞和相应的细胞培养基，动态培养3‑4天使其形成模拟的膀胱结构，所述动态培养包括摇床摇动或使用恒流泵灌注培养，其中所述摇床摇动的方法是将所述类器官培养装置放置在摇床上，使摇床的摇动方向与类器官培养装置的长轴一致，观察到所述类器官培养装置中的多孔膜向上层通道结构中节律性突起即可；或者，所述使用恒流泵灌注培养时控制液体流量使多孔膜产生节律性形变即可；

步骤3：将膀胱癌患者来源的原代膀胱癌细胞或类器官与Matrigel基质胶通过与步骤2一样的加样方法分别加入装置的上层通道结构和下层通道结构中，所述膀胱癌患者来源的原代膀胱癌细胞加入后静置培养3‑4天使其形成类器官；

步骤4：通过与步骤2一样的加样方法向该装置中加入抗肿瘤的药物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上层通道结构上的加样孔为2个或3个，所述多孔膜上的连接孔为1个或2个，所述下层通道结构上的加样孔为1个或2个。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上层通道结构厚度为1‑3mm，所述上层加样孔为直径1‑3mm的圆形孔，所述上层连接通道宽0.5‑2mm，所述上层培养通道为28‑30mm长的两端圆滑的长形沟槽结构；所述下层通道结构厚度为1‑4mm，所述下层加样孔、所述下层连接通道和所述下层培养通道的形状与尺寸均与上层结构一致。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多孔膜厚度为10‑50μm，材质为PET或PDMS。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述盖部厚度为2‑5mm，所述底部厚度为0.5‑

2mm。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述摇床摇动的频率为50‑300rpm；或者，所述恒流泵灌注培养的流量流速设置为20μl‑1ml/min。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述模拟膀胱癌给药包括模拟膀胱癌静脉给药和灌注给药。

说明书

一种模拟膀胱结构的类器官培养装置及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种模拟膀胱结构的类器官培养装置及其应用。

背景技术

[0002] 膀胱癌是一种临床常见的泌尿系统恶性肿瘤，在患者早期病灶切除后，膀胱灌注给药可预防其复发。肿瘤的体外模型为抗肿瘤药物筛选提供了新方法。其中类器官作为一种新的平台，具有广泛的应用前景。然而目前的膀胱癌类器官的体外给药方法中，由于普通类器官模型缺乏模拟膀胱的间质以及肌层结构，难以模拟正常生理结构下的给药途径。虽已有报道可制备具有三层结构的膀胱构造体模拟膀胱生理结构，但其培养时间过长，难以实现临床的快速诊断应用。因此，提供一种可以模拟膀胱组织结构并进行灌注给药的装置，可以缓解现有技术的不足。

发明内容

[0003] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种模拟膀胱结构的类器官培养装置，以及模拟膀胱癌灌注给药的方法。具体技术方案如下。

[0004] 一种模拟膀胱结构的类器官培养装置，包括上层通道结构和下层通道结构，在所述上层通道结构和所述下层通道结构之间设置一层多孔膜进行分隔，以及在所述上层通道结构和所述下层通道结构的上下两侧分别设置盖部和底部；所述上层通道结构由至少2个上层加样孔、1个上层连接通道和1个上层培养通道组成，所述上层加样孔中的1个与所述上层连接通道和所述上层培养通道相互连通；所述下层通道结构由至少1个下层加样孔、至少1个下层连接通道和1个下层培养通道组成，所述下层加样孔的数量与所述下层连接通道的数量一致，并与所述下层培养通道相互连通；所述多孔膜上设置至少1个连接孔，与至少1个所述上层加样孔和至少1个所述下层加样孔对应并连通。

[0005] 进一步，所述上层通道结构上的加样孔可以是2个或3个，所述多孔膜上的连接孔可以是1个或2个，所述下层通道结构上的加样孔可以是1个或2个。

[0006] 进一步，所述盖部上面设置盖部加样孔与上层通道结构上的加样孔相对应并连通；所述底部直接与所述下层通道结构连接。

[0007] 进一步，所述上层通道结构厚度为1‑3mm，所述上层加样孔为直径1‑3mm的圆形孔，所述上层连接通道宽0.5‑2mm，所述上层培养通道为28‑30mm长的两端圆滑的长形沟槽结构；所述下层通道结构厚度为1‑4mm，所述下层加样孔、所述下层连接通道和所述下层培养通道的形状与尺寸均与上层结构一致。

[0008] 进一步，所述多孔膜厚度为10‑50μm，材质为PET或PDMS。多孔膜上的孔用于上下通道间物质与信息的交换。

[0009] 进一步，所述盖部厚度为2‑5mm，所述底部厚度为0.5‑2mm。

[0010] 采用上述类器官培养装置进行模拟膀胱癌模拟给药的方法，包括如下步骤：

[0011] 步骤1：将所述类器官培养装置的盖部、上层通道结构、多孔膜、下层通道结构和底部按顺序组装在一起；其中底部可以与玻璃或培养皿相连接以便于显微镜下观察或固定；

[0012] 步骤2：通过所述类器官培养装置盖部上与上层通道结构相连通的盖部加样孔加入肌母细胞、成纤维细胞以及HUVEC脐静脉血管内皮细胞，同时加入相应的细胞培养基，摇匀后静置培养，待细胞贴壁以后再通过盖部上与下层通道结构相连通的盖部加样孔加入肌母细胞、成纤维细胞、HUVEC脐静脉血管内皮细胞和相应的细胞培养基，动态培养3‑4天使其形成模拟的膀胱结构；

[0013] 步骤3：将膀胱癌患者来源的原代膀胱癌细胞或类器官与Matrigel基质胶通过与步骤2一样的加样方法分别加入装置的上层通道结构和下层通道结构中（即，通过所述类器官培养装置盖部上与上层通道结构相连通的盖部加样孔加入膀胱癌患者来源的原代膀胱癌细胞或类器官与Matrigel基质胶到上层通道结构中；通过盖部上与下层通道结构相连通的盖部加样孔加入膀胱癌患者来源的原代膀胱癌细胞或类器官与Matrigel基质胶到下层通道结构中），所述膀胱癌患者来源的原代膀胱癌细胞加入后静置培养3‑4天使其形成类器官；

[0014] 步骤4：通过与步骤2一样的加样方法向该装置中（上/下层通道结构中）加入抗肿瘤的药物。

[0015] 通过上述步骤2和步骤3，实际上形成了模拟的膀胱癌结构。步骤4的给药方式模拟了膀胱癌的静脉给药和灌注给药。具体来说，当类器官位于上层通道结构中时，通过往上层通道结构中加入抗癌药物进而模拟出通过静脉进行给药，因为在这种条件下药物可直接作用于肿瘤类器官。往下层通道中给药，药物需要通过类器官培养装置中制备的肌肉层、纤维层，这些结构模拟了膀胱壁结构，通过这些膀胱壁结构后，药物才能作用于类器官，进而模拟出膀胱的灌注给药途径。

[0016] 进一步，所述步骤2中的动态培养包括摇床摇动或使用恒流泵灌注培养。

[0017] 进一步，所述摇床培养的方法是将所述类器官培养装置放置在摇床上，使摇床的摇动方向与类器官培养装置的长轴一致；摇床摇动的频率为50‑300rpm。

[0018] 进一步，所述恒流泵灌注培养的流量流速设置为20μl‑1ml/min。

[0019] 上述类器官培养装置在制备膀胱癌给药模型中的应用，所述膀胱癌给药模型可以模拟膀胱癌静脉给药和灌注给药。

[0020] 本发明还可以包含一种结构改进的模拟膀胱结构的类器官培养装置。

[0021] 所述改进的类器官培养装置在前述装置的基础上增加与大气连通的通气孔；且将上下层培养通道的形状改为圆环状的闭合沟槽结构，在此基础上，下层培养通道的长度长于上层培养通道。

[0022] 有益技术效果

[0023] 本发明通过类器官芯片技术，体外构建模拟膀胱的组织结构，通过构建生理性的膀胱上皮、肌层结构和结缔组织，模拟出膀胱结构，再通过表面癌细胞的生长，模拟出真实的膀胱癌模型，并进一步模拟了膀胱的静脉给药和灌注给药途径，为膀胱癌的药物筛选创造更有利的条件和平台。

[0024] 本发明利用压力引起芯片中多孔膜的形变而对其表面的细胞产生机械拉伸作用，从而促进肌肉细胞的分化形成肌纤维而模拟肌层，成纤维细胞分化模拟基质结构，血管内皮细胞分化模拟血管结构。

[0025] 本发明模拟的膀胱癌给药途径有两种，包括灌注给药和静脉给药。灌注给药是从尿道将药物递送进膀胱，静脉给药是从血管进行药物递送。本发明的装置从上层通道给药可模拟静脉给药，从下层通道给药可模拟灌注给药。

附图说明

[0026] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

[0027] 图1为I型膀胱芯片整体图；

[0028] 图2为I型膀胱芯片俯视图和侧视图；

[0029] 图3为I型膀胱芯片盖部和盖部加样孔A/ B结构示意图；

[0030] 图4为I型膀胱芯片上层通道结构示意图，展示加样孔、连接通道和培养通道；

[0031] 图5为I型膀胱芯片多孔PET膜或PDMS膜结构示意图；

[0032] 图6为I型膀胱芯片下层通道结构示意图，展示加样孔、连接通道和培养通道；

[0033] 图7为I型膀胱芯片底部示意图；

[0034] 图8为I型膀胱芯片培养的细胞屏障示意图；

[0035] 图9为II型膀胱芯片整体图；

[0036] 图10为II型膀胱芯片俯视图和左视图；

[0037] 图11为II型膀胱芯片盖部和盖部加样孔A/ B/ C结构示意图；

[0038] 图12为II型膀胱芯片上层通道结构示意图，展示加样孔、连接通道和培养通道；

[0039] 图13为II型膀胱芯片多孔PET膜或PDMS膜结构示意图；

[0040] 图14为II型膀胱芯片下层通道结构示意图，展示加样孔、连接通道和培养通道；

[0041] 图15为II型膀胱芯片底部示意图；

[0042] 图16为II型膀胱芯片培养的细胞屏障示意图；

[0043] 图17为III型膀胱芯片整体图；

[0044] 图18为III型膀胱芯片俯视图和侧视图；

[0045] 图19为III型膀胱芯片盖部和盖部加样孔A、加样孔B、通气孔结构示意图；

[0046] 图20为III型膀胱芯片上层通道结构示意图，展示加样孔、连接通道和培养通道；

[0047] 图21为III型膀胱芯片多孔PET膜或PDMS膜结构示意图；

[0048] 图22为III型膀胱芯片下层通道和底部结构示意图，展示加样孔、连接通道和培养通道；

[0049] 图23为III型膀胱芯片培养的细胞屏障示意图。

具体实施方式

[0050] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0051] 需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。

[0052] 如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/‑5%，更典型的是所述值的+/‑4%，更典型的是所述值的+/‑3 %，更典型的是所述值的+/‑2 %，甚至更典型的是所述值的+/‑1 %，甚至更典型的是所述值的+/‑0.5%。

[0053] 在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1〜6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。

[0054] 说明书附图标记汇总

[0055] I型芯片：盖部：110；盖部加样孔A：111；盖部加样孔B：112；上层通道结构：120；上层加样孔A：121；上层加样孔B：122；上层连接通道：123；上层培养通道：124；多孔膜：130；连接孔（1）：131；下层通道结构：140；下层加样孔B：141；下层连接通道：142；下层培养通道：143；底部：150。

[0056] II型芯片：盖部：210；盖部加样孔A：211；盖部加样孔B：212；盖部加样孔C（出液孔C）：213；上层通道结构：220；上层加样孔A：221；上层加样孔B：222；上层加样孔C：223；上层连接通道：224；上层培养通道：225；多孔膜：230；连接孔（1）：231；连接孔（2）：232；下层通道结构：240；下层加样孔B：241；下层加样孔C：242；下层连接通道B：243、下层连接通道C：244；下层培养通道：245；底部：250。

[0057] III型芯片：盖部：310；盖部加样孔A：311；盖部加样孔B：312；盖部通气孔：313；上层通道结构：320；上层加样孔A：321；上层加样孔B：322；上层连接通道：323；上层培养通道：324；上层通气孔：325；多孔膜：330；连接孔（1）：331；膜通气孔：332；下层通道结构：340；下层加样孔B：341；下层连接通道：342；下层培养通道：343。

[0058] 实施例1

[0059] 本发明设计了两种模拟膀胱结构的类器官培养装置（以下简称膀胱芯片），分别简称为I型膀胱芯片和II型膀胱芯片。

[0060] 在本发实施例中，两种膀胱芯片都采用PDMS材质，且都包含5部分结构，从上到下依次为盖部、上层通道结构、多孔膜结构、下层通道结构和底部。

[0061] I型膀胱芯片，结构参见图1‑图7。

[0062] 盖部110：厚度2‑5mm，包括盖部加样孔A111、B112。每个盖部加样孔均为直径1‑3mm的圆形开口。

[0063] 上层通道结构120：厚度为1‑3mm，由上层加样孔A121和B122、上层加样孔与通道间形成的上层连接通道123和上层培养通道124三部分组成，其中上层加样孔为直径1‑3mm的圆形开口，在上层培养通道124左右两侧1‑5mm处各有一孔，与通道结构相连的孔为上层加样孔A121，该孔还与盖部加样孔A111相对应且连通；另一个独立的孔为上层加样孔B122，其作用是与下层通道结构140相连通；上层连接通道123宽0.5‑2mm，其中一端与上层加样孔A121相连，另一端与上层培养通道124相连；上层培养通道124是由28‑30 mm长的两端圆滑的长形沟槽所构成。

[0064] 多孔膜130：材质为多孔的PET膜或PDMS膜，厚度为10‑50μm。在I型膀胱芯片中，膜上存在一圆形连接孔（1）131，与上/下层加样孔B 122/141相连通。该层可将芯片的上层通道和下层通道相分隔，形成芯片的双通道结构。其中，聚对苯二甲酸乙二醇酯 （PET）膜具有0.4‑8μm的孔；PDMS膜具有约9μm左右的孔。

[0065] 下层通道结构140：厚度为1‑4mm，由下层加样孔B141、下层加样孔B141与通道间形成的下层连接通道142和下层培养通道143三部分组成。并且下层加样孔B141、连接通道142和培养通道143的尺寸与上层通道结构的尺寸一致。

[0066] 底部150：厚度为0.5‑2mm，上方与下层通道结构相连接，下方可通过等离子处理与玻璃或培养皿相连接，起到固定芯片的作用。

[0067] II型膀胱芯片：

[0068] II型芯片与I型芯片在加样孔的设计上略有不同，II型芯片结构参见图9‑图15。

[0069] II型芯片的盖部210上设置有A211、B212、C213 3个加样孔，其中加样孔C213又可以称为出液孔C。盖部加样孔A211与上层通道结构220的上层加样孔221相对应且连通，盖部加样孔B212和盖部加样孔C213通过多孔膜230上设置的连接孔（1）231和连接孔（2）232分别与下层通道结构240中的下层加样孔B241和下层加样孔C242相连通。

[0070] 上层通道结构220中设置有3个加样孔，其中上层加样孔A221与上层连接通道224和上层培养通道225连通；上层加样孔B222和C223分别与盖部的孔B212、C213和下层的孔B241、C242相通。

[0071] 可以理解的是，由于下层通道结构240中设置有两个加样孔，其分别与通道相连，因此下层通道结构中具有两个下层连接通道，分别是243和244，其中一端分别与加样孔B241、C242相连，另一端与一共同的下层培养通道245相连。

[0072] 本发明在I型和II型芯片的基础上，实际上还包含一种改进的芯片结构，简称为III型膀胱芯片。

[0073] III型膀胱芯片，结构参见图17‑图22。

[0074] 芯片整体结构也包含5部分，从上到下依次为盖部、上层通道结构、多孔膜、下层通道结构和底部。

[0075] 盖部310：设置有两个盖部加样孔A311和B312，此外，还设置有多个通气孔313，包括但不限于4个，所述通气孔为0.5‑1mm的圆形开口。盖部加样孔A311与上层通道结构相连接，盖部加样孔B312与下层通道结构相连接，盖部通气孔313与上层通道结构320和下层通道结构340相连，另一端与大气相通。

[0076] 上层通道结构320：厚度为1‑3mm，由上层加样孔A321/B322、上层加样孔A321与通道间形成的上层连接通道323和上层培养通道324三部分组成。其中，上层培养通道324为一圆环状的闭合沟槽结构。此外还设置有上层通气孔325。

[0077] 多孔膜330：材质为PET膜或PDMS膜。膜上设置有1个连接孔（1）331与上/下层加样孔B322/341相连通，此外，膜上还设置有两个膜通气孔332。

[0078] 下层通道结构340：由下层加样孔B341、下层加样孔B341与通道间形成的下层连接通道342和下层培养通道343三部分组成。其中，下层培养通道343的长度略长于上层培养通道324，长出培养通道的部分通过膜通气孔332与大气连接。

[0079] 可以理解的是，III型芯片还可以包括与I型或II型芯片底部150或250结构类似的底部结构。

[0080] 实施例2

[0081] 本发明芯片的制备方法。

[0082] 1.设计并制备3D打印类器官芯片模具

[0083] 使用水洗光敏树脂作为模具的打印墨水，使用LCD光固化打印的方法制备打印模具。打印完成后模具需经水洗、脱水、二次固化、二次脱水、90℃高温烘烤、喷涂脱模剂的流程进行后处理。

[0084] 2.芯片的制备

[0085] 将PDMS基质材料与固化剂混合，放入模具中，真空排出气泡，90℃加热固化。固化后PDMS芯片采用等离子处理。

[0086] 3.微孔薄膜的裁剪

[0087] 裁剪多孔聚酯（聚对苯二甲酸乙二醇酯 [PET]）膜（具有0.4‑8μm的孔）或 PDMS 膜（10‑50μm 厚；具有约9μm左右的孔），裁剪为长30‑50mm宽20‑30mm的矩形，并在具其中心左或右侧1‑5mm处打1或2个直径1‑3mm圆孔。后采取等离子处理，紫外灭菌后进行胶原涂层处理。

[0088] 可以理解的是，本发明芯片的形状和膜的形状并不限于方形或矩形。

[0089] 实施例3

[0090] 采用本发明的I型和II型类器官培养装置进行模拟膀胱癌给药的方法（芯片的使用方法）。

[0091] 1.在细胞培养皿（瓶）中饲养C2C12肌母细胞、3T3成纤维细胞以及HUVEC脐静脉血管内皮细胞。在细胞长满皿（瓶）底后，将细胞消化制备成细胞悬液，计数细胞量。

[0092] 2.加样及类器官培养。

[0093] 使用注射器连接毛细硅胶管从I型膀胱芯片盖部加样孔A111加入混合的肌母细胞、成纤维细胞以及HUVEC脐静脉血管内皮细胞，摇匀后静置培养，待细胞贴壁以后再从盖部加样孔B112向下层通道装置中加入肌母细胞、成纤维细胞、HUVEC脐静脉血管内皮细胞和培养基，放入摇床动态培养3‑4天，使其形成模拟的膀胱结构。放入摇床时使摇床的摇动方向与类器官培养装置的长轴一致；设置摇床的摇动频率为50‑300rpm。

[0094] 膀胱壁的结构分为内皮、粘膜下层、肌层和结缔组织等结构，膀胱芯片中添加肌母细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞，通过芯片中膜的形变而对其表面的细胞产生机械拉伸作用，促进肌肉细胞的分化形成肌纤维而模拟肌层，成纤维细胞分化模拟结缔组织结构，血管内皮细胞分化模拟血管结构。

[0095] 3.加入膀胱癌细胞。

[0096] 将病人来源的膀胱癌细胞或类器官与Matrigel基质胶通过盖部的加样孔A111、B112加入到装置中，放入摇床继续动态培养，待观察到肿瘤细胞黏附于多孔膜时，从盖部加样孔A111、B112移除上/下层通道中的废旧培养基。

[0097] 4.模拟给药。

[0098] 从盖部加样孔A111或B112分别向上/下通道结构120/140加入抗肿瘤药物后放置于摇床中继续培养，即可通过观察芯片中膀胱癌类器官的生长状态观察抗肿瘤药物对肿瘤的杀伤作用，以优化临床药物筛选途径，观测患者药物敏感性。

[0099] I型膀胱芯片在使用时应注意下层通道中培养基的量不易过多，在动态培养时观测到多孔膜130向上层通道中节律性突起即可。

[0100] I型芯片使用摇床进行细胞培养，将芯片底部150固定在培养皿底部，放置于37℃培养箱内。放置方向为将摇床的摇动方向与芯片的长轴一致，以满足芯片内的液体流动需求。I型膀胱芯片培养的细胞屏障示意图参见图8。

[0101] 可以理解的是，还能采用II型芯片进行模拟膀胱癌灌注给药。

[0102] 1.培养C2C12肌母细胞、3T3成纤维细胞以及HUVEC脐静脉血管内皮细胞。

[0103] 2.加样及类器官培养。

[0104] 使用注射器连接毛细硅胶管将细胞悬液或类器官从盖部加样孔A211加入到芯片上层通道结构220中，从盖部加样孔B212和C213加入到芯片的下层通道结构240中。II型芯片的B孔为下层通道培养基加样孔，从该孔可完成下层培养基的加样工作。C孔为下层通道培养基出液孔，可从该孔中吸出下层通道的培养基，改变下层通道中的压力以研究机械力对类器官于细胞的作用效果。

[0105] II型芯片与I型芯片在动态培养时略有不同。

[0106] II型芯片可连接恒流泵灌注培养，设置恒流泵灌注培养的流量流速为20μl‑1ml/min。

[0107] II型芯片的盖部上的加样孔B212与加样孔C213还可与外部的管道相连接，控制芯片中的液体流量、流速与时间，从而改变下层通道中的压力而引起多孔膜形态变化，从而产生对细胞和类器官的机械力作用，模拟真实膀胱的节律性充盈与收缩，还原生理性的膀胱癌生长环境。

[0108] II型膀胱芯片在下层加液时应注重液体充盈下层通道，充盈量达到多孔膜230发生形变即可，并通过控制液体流量使多孔膜产生节律性的形变。II型膀胱芯片培养的细胞屏障示意图参见图16。

[0109] 可以理解的是，本发明中的III型膀胱芯片可同时满足I型、II型膀胱芯片的培养需求，按照I型芯片的培养方法培养后，待细胞黏附于PET膜表面，可继续摇床动态培养，亦可通过下层通道的通气孔与恒流泵相连接，进行灌注培养。III型膀胱芯片培养的细胞屏障示意图参见图23。

[0110] 上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。