一种基于环糊精-氨基酸的荧光分子及其合成方法与应用

摘要

本发明涉及一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子及其合成方法与应用，制备方法包括：将醛基环糊精、氨基酸加入至水中配制成混合液，并依次经过调节pH、加热搅拌、固液分离后，即得到基于环糊精‑氨基酸的荧光分子；其中醛基环糊精为采用高碘酸钠预氧化β‑环糊精得到的醛基环糊精。与现有技术相比，本发明所制备的环糊精‑组氨酸荧光分子可作为金霉素的特异性识别荧光探针，其灵敏度高、选择性强，可进行基于荧光图像的可视化便携检测。

权利要求

1.一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子合成方法，其特征在于，该方法包括：将醛基环糊精、氨基酸加入至水中配制成混合液，并依次经过调节pH、加热搅拌、固液分离后，即得到基于环糊精‑氨基酸的荧光分子；其中所述的醛基环糊精为采用高碘酸钠预氧化β‑环糊精得到的醛基环糊精；

其中，所述的醛基环糊精的制备方法包括：

将β‑环糊精与高碘酸钠于水中避光搅拌反应，经纳滤后，与乙醇搅拌混合至沉淀析出，之后依次经过滤、洗涤、冻干后，得到醛基环糊精；

其中，所述的β‑环糊精与高碘酸钠的摩尔比为1:(1‑4)；

所述的避光搅拌反应中，反应温度为30‑50℃，反应时间为3‑5 h；

所述的醛基环糊精、氨基酸的摩尔比为1:(2‑6)。

2.根据权利要求1所述的一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子合成方法，其特征在于，所述的氨基酸包括甘氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或组氨酸中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子合成方法，其特征在于，当氨基酸为甘氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸或苯丙氨酸中的至少一种时，调节反应体系pH至8‑9；

当氨基酸为色氨酸或组氨酸中的一种或两种时，调节反应体系pH至6‑7。

4.根据权利要求1所述的一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子合成方法，其特征在于，加热搅拌过程中，加热温度为60‑80℃，搅拌时间为30‑60 min。

5.根据权利要求1所述的一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子合成方法，其特征在于，所述的固液分离包括透析与冷冻干燥。

6.一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子，其特征在于，采用如权利要求1至5任一项所述的方法合成。

7.如权利要求6所述的一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子的应用，其特征在于，所述的荧光分子作为荧光探针，用于水体中金霉素的定性和/或定量检测。

8.根据权利要求7所述的一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子的应用，其特征在于，检测方法包括以下步骤：

1）绘制标准曲线：将荧光探针分别与多个含不同浓度金霉素的溶液混合并搅拌均匀，得到金霉素浓度范围为0‑5 μM的标准溶液，利用365 nm紫外灯作为激发光源，在黑暗环境下拍摄获得荧光图像，并分析图像B值与G值，以B/G为纵坐标，以金霉素浓度为横坐标绘制标准曲线，以及金霉素检测拟合方程；

2）水样中金霉素的检测：采用同步骤1）中荧光探针与金霉素的溶液的用量比，将荧光探针与待测水样混合，得到混合样，以365 nm紫外灯为激发光源获得荧光图像，并分析计算得到图像的B/G，之后根据标准曲线或拟合方程，得到对应的金霉素浓度。

说明书

一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子及其合成方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于荧光传感器技术领域，涉及一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子及其合成方法与在金霉素荧光检测中的应用。

背景技术

[0002] 有机荧光材料已广泛应用于传感器、细胞成像和显示技术。传统荧光分子均具有基于π‑共轭芳香结构的化学键共轭的结构基础，具有可调的发光颜色和高荧光效率。然而，这些材料通常具有溶解性差、生物毒性高、成本高、合成工艺复杂等特点，极大地限制了其实际应用。相比之下，没有显著共轭结构的非常规发光体具有高生物相容性、低毒性、良好的可加工性和易于合成的独特优势。非常规发光体具有富电子的杂原子，例如氮(N)、氧(O)、硫(S)、磷(P)、卤素(Cl、Br和I)或含有C＝O、C＝C和C≡N的不饱和基团。它们在浓溶液和/或固态中发射，但在稀溶液中往往不发光。这种现象被称为团簇触发发射(CTE)。聚集状态的簇发光体已被用于加密和生物成像。然而，用于细胞成像的簇发光体的浓度比传统发光体高1000倍，这成为其实际应用的一大障碍。此外，在传感应用中，荧光探针需要与分析物进行有效的相互作用。然而，目前基于簇集发光的固态的团簇发光材料和水溶液中的分析物之间的相互作用有限，所报道的非常规发光体作为传感器的性能较差。因此，非常需要寻找新的策略来促进即使在稀溶液中也具有强发光的CTE效应。

[0003] 具有丰富羟基的单‑、双‑、寡‑和多糖结晶作为非常规发光体的发光现象已被广泛研究。它们在稀溶液中是弱发射的，并且仅从浓溶液(>8wt.％)或结晶状态观察到明亮的发射。在稀溶液中，线性多糖，例如海藻酸钠，显示出延伸的蠕虫状构象，这导致由于缺乏足够的电子离域和活跃的分子运动而不发光。因此，开发非线性分子和增强分子堆积对于在稀溶液中获得明亮的发光具有重要意义。

[0004] 相比于传统的检测方法，荧光探针技术由于具有简单便携、高灵敏度、成本低等特点，被认为是检测痕量污染物的最有前景的分析方法之一。目前，四环素作为水体中经常被检出的新型污染物，已经报道了多种荧光传感材料用于检测四环素类抗生素。然而，对于分子主体结构十分相似的四环素抗生素如金霉素、土霉素、美诺环素、四环素等，很难区分。因此，需要设计针对某一特定四环素类抗生素的荧光探针进行开发与应用。

[0005] 目前基于环糊精‑氨基酸的新型荧光分子尚未报道。已报道的技术比如中国专利CN 201810866243.1公开了一种安全简单制备双掺杂氮和磷碳量子点的方法，该方法先将氨基酸、碳前驱体(包括葡萄糖、一水合柠檬酸或环糊精)溶解在去离子水中，加入磷酸溶液，后经超声波处理1～2h；将超声过后的溶液在90‑150℃下油浴加热1‑5小时，制备出氮、磷共掺杂碳点溶液。通过专利对比，该专利中虽然也采用了氨基酸、环糊精等原料，但制备方法和最终产物明显不同，该专利采用超声、高温油浴等方法得到的氮和磷双掺杂碳量子点，合成时间较长，处理过程复杂。相对而言，本发明中基于氨基酸接枝环糊精的新型荧光分子，与碳量子点不同，具有明确的分子组成和空间结构，合成条件温和，合成温度为60‑80℃，反应时间仅为30‑60min。此外，以组氨酸接枝环糊精的荧光分子可作为金霉素的特异性识别探针，可实现对金霉素的高灵敏度、高选择性的便携式检测，显示了良好的应用前景。

[0006] 在金霉素的荧光分析技术方面，已报道的技术比如中国专利CN201710302455.2公开了一种基于聚乙烯亚胺保护的金/铂双金属纳米簇荧光探针及其在检测金霉素中的应用，该方法利用聚乙烯亚胺保护的双金属金/铂纳米簇作为荧光传感材料，基于荧光猝灭的3+
机制用于检测四环素类抗生素；然而，仍需通过加入Al 基于荧光增强的机制，才可将金霉素从四环素中区分开，达到特异性检测金霉素的目的。其对金霉素进行检测，线性范围为
0.5‑30μM，检测限为0.5μM。但该检测方法的检测限仍旧较高，难以满足现有污水中微量金霉素的检测要求。

发明内容

[0007] 本发明的目的就是提供一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子及其合成方法与应用。

[0008] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

[0009] 一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子合成方法，包括：

[0010] 将醛基环糊精、氨基酸加入至水中配制成混合液，并依次经过调节pH、加热搅拌、固液分离后，即得到基于环糊精‑氨基酸的荧光分子；其中所述的醛基环糊精为采用高碘酸钠预氧化β‑环糊精得到的醛基环糊精。

[0011] 进一步地，所述的醛基环糊精的制备方法包括：

[0012] 将β‑环糊精与高碘酸钠于水中避光搅拌反应，经纳滤后，与乙醇搅拌混合至沉淀析出，之后依次经过滤、洗涤、冻干后，得到醛基环糊精；

[0013] 其中，所述的β‑环糊精与高碘酸钠的摩尔比为1:(1‑4)；

[0014] 所述的避光搅拌反应中，反应温度为30‑50℃，反应时间为3‑5h；

[0015] 纯化过程中采用体积比1/4的水/乙醇混合溶液进行洗涤。

[0016] 进一步地，所述的醛基环糊精、氨基酸的摩尔比为1:(2‑6)。

[0017] 进一步地，所述的氨基酸包括甘氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或组氨酸中的至少一种。

[0018] 进一步地，当氨基酸为甘氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸或苯丙氨酸中的至少一种时，调节反应体系pH至8‑9；

[0019] 当氨基酸为色氨酸或组氨酸中的一种或两种时，调节反应体系pH至6‑7。

[0020] 进一步地，加热搅拌过程中，加热温度为60‑80℃，搅拌时间为30‑60min。

[0021] 进一步地，所述的固液分离包括透析与冷冻干燥。

[0022] 一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子，采用如上所述的方法合成。

[0023] 一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子的应用，包括将所述的荧光分子作为荧光探针，用于水体中金霉素的定性和/或定量检测。

[0024] 进一步地，检测方法具体包括以下步骤：

[0025] 1)绘制标准曲线：将荧光探针分别与多个含不同浓度金霉素的溶液混合并搅拌均匀，得到金霉素浓度范围为0‑5μM的标准溶液，利用365nm紫外灯作为激发光源，在黑暗环境下拍摄获得荧光图像，并分析图像B值与G值，以B/G为纵坐标，以金霉素浓度为横坐标绘制标准曲线，以及金霉素检测拟合方程；

[0026] 2)水样中金霉素的检测：采用同步骤1)中荧光探针与金霉素的溶液的用量比，将荧光探针与待测水样混合，得到混合样，以365nm紫外灯为激发光源获得荧光图像，并分析计算得到图像的B/G，之后根据标准曲线或拟合方程，得到对应的金霉素浓度。

[0027] 本发明首先利用高碘酸钠对溶解性低和反应活性低的β‑环糊精进行氧化改性，得到水溶性好且反应活性高并含有双醛结构的醛基环糊精；然后通过醛基环糊精的醛基与各类氨基酸分子中的氨基通过席夫碱反应，得到基于不同种类氨基酸的12种氨基酸接枝环糊精的新型荧光分子。所合成的荧光分子基于增强簇集发光的机理，具有在稀溶液中优良的荧光性能，具有良好的水溶性和优异的环境相容性。合成的组氨酸接枝环糊精的荧光分子作为金霉素的荧光探针，可实现对金霉素的高选择性和高灵敏度的基于可视化技术的便携式检测。

[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下特点：

[0029] 1)本发明的合成方法简单，通过对环糊精简单改性后得到，并且合成条件较为温和，反应温度可控制在80℃以下，基于常规的水浴条件即可提供制备环境要求；

[0030] 2)本发明制备得到的环糊精‑氨基酸的新型荧光分子与传统具有共轭结构的荧光分子相比，具备结构简单、合成成本低、水溶性好、无生物毒性、环境相容性好等优点。

[0031] 3)本发明可合成一系列具有丰富结构和性能的环糊精‑氨基酸新型荧光分子，提供了合成基于氨基酸‑环糊精的非常规荧光材料的通用方法。

[0032] 4)本发明制备得到的环糊精‑组氨酸的新型荧光分子，可直接高特性识别金霉素分子，实现对金霉素的高灵敏性检测(检测范围为0‑5μM，检测限为12nM)，更适合低浓度的微量污染物的精准检测，以及高选择性检测，而其对于分子主体结构十分相似的其他类四环素无信号响应，此外通过基于荧光图像的可视化技术可实现对金霉素的便携式检测。

附图说明

[0033] 图1为实施例1与实施例2中合成的环糊精‑氨基酸的荧光分子的三维荧光图；

[0034] 图2为实施例1与实施例2中合成的环糊精‑氨基酸的荧光分子的在不同激发波长条件下的发射光谱图；

[0035] 图3为实施例3中不同氨基酸添加量的条件下环糊精‑组氨酸的荧光光谱；

[0036] 图4为实施例4中加入不同浓度的金霉素后的荧光发射光谱；

[0037] 图5为实施例4中所绘制的金霉素检测标准曲线；

[0038] 图6为实施例5中不同的有机小分子对合成的环糊精‑组氨酸荧光分子的荧光发射光谱的影响。

具体实施方式

[0039] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

[0040] 一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子，其合成方法包括以下步骤：

[0041] S1：将β‑环糊精与高碘酸钠以摩尔比为1:(1‑4)于水中混合，并在30‑50℃下避光搅拌反应3‑5h，经纳滤后，与乙醇搅拌混合至沉淀析出，之后依次经过滤、纯化、冻干，得到醛基环糊精；

[0042] 其中，纯化过程为采用体积比1/4的水/乙醇混合溶液进行洗涤；

[0043] S2：将醛基环糊精配制成水溶液；

[0044] S3：将氨基酸加入至上述水溶液中，调节体系的pH值，并加热至60‑80℃，持续搅拌30‑60min，得到产品液；

[0045] 其中，醛基环糊精、氨基酸的摩尔比为1:(2‑6)；

[0046] 当氨基酸为甘氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸或苯丙氨酸中的至少一种时，调节反应体系pH至8‑9；

[0047] 当氨基酸为色氨酸或组氨酸中的一种或两种时，调节反应体系pH至6‑7；

[0048] S4：将产品液进行透析12h，得到的透析液进行冷冻干燥，即可得到基于环糊精‑氨基酸的新型荧光材料粉末。

[0049] 一种基于环糊精‑氨基酸的荧光分子的应用，包括将所述的荧光分子作为荧光探针，用于水体中金霉素的定性和/或定量检测。

[0050] 进一步地，检测方法具体包括以下步骤：

[0051] 1)绘制标准曲线：将荧光探针分别与多个含不同浓度金霉素的溶液混合并搅拌均匀，得到金霉素浓度范围为0‑5μM的标准溶液，利用365nm紫外灯作为激发光源，在黑暗环境下拍摄获得荧光图像，利用软件image J进行图像颜色均一化处理，然后利用F取色器直接读取图像的平均B值与G值，以B/G为纵坐标，以金霉素浓度为横坐标绘制标准曲线，以及金霉素检测拟合方程；

[0052] 2)水样中金霉素的检测：采用同步骤1)中荧光探针与金霉素的溶液的用量比，将荧光探针与待测水样混合，得到混合样，以365nm紫外灯为激发光源获得荧光图像，并分析计算得到图像的B/G，之后根据标准曲线或拟合方程，得到对应的金霉素浓度。

[0053] 本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0054] 实施例1：

[0055] 一种基于环糊精‑氨基酸(组氨酸/色氨酸)的荧光分子，其合成方法包括以下步骤：

[0056] S1：将15gβ‑环糊精加入至100mL去离子水中，并搅拌均匀，再加入6g高碘酸钠，并在40℃下避光搅拌反应4h，经220nm滤膜过滤后，取滤出液并与过量无水乙醇(800mL)混合至沉淀析出，之后依次经过滤、乙醇/水(V/V＝80/20)多次洗涤、冷冻干燥，得到水溶性好且反应活性高并含有双醛结构的醛基环糊精；

[0057] S2：将0.1mmol(114mg)醛基环糊精与0.6mmol(93mg)组氨酸或0.6mmol(82mg)色氨酸共溶于20mL水中，调节体系pH为6‑7；

[0058] S3：将上述溶液在80℃下搅拌反应60min，得到环糊精‑氨基酸荧光分子，经过透析(截留分子量1000Da)，冷冻干燥后分别得到2种基于环糊精‑氨基酸(组氨酸/色氨酸)的荧光材料粉末。

[0059] 实施例2：

[0060] 一种基于环糊精‑氨基酸(甘氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸或苯丙氨酸)的荧光分子，其合成方法与实施例1相比区别仅在于：

[0061] 步骤S2中，所用氨基酸为0.6mmol(45mg)甘氨酸或0.6mmol(79mg)异亮氨酸、0.6mmol(105mg)精氨酸、0.6mmol(79mg)天冬酰胺、0.6mmol(73mg)半胱氨酸、0.6mmol(88mg)谷氨酰胺、0.6mmol(88mg)谷氨酸、0.6mmol(88mg)赖氨酸、0.6mmol(90mg)甲硫氨酸、
0.6mmol(99mg)苯丙氨酸；调解体系pH至8‑9；

[0062] 步骤S3中，搅拌反应时间为30min，最终得到10种基于环糊精‑氨基酸的荧光材料粉末；

[0063] 其余同实施例1。

[0064] 如图1所示，为实施例1与实施例2所合成的12种基于环糊精‑氨基酸的新型荧光分子(5mM水溶液)的三维荧光。从图中可以看出，基于在环糊精受限的空间内的增强簇集发光效应，合成的环糊精‑氨基酸新型荧光分子虽然不具有π‑共轭基团，但仍具有明显的荧光信号，发射波长集中在350‑550nm范围内。

[0065] 如图2所示，为所合成的12种基于环糊精‑氨基酸的新型荧光分子(5mM水溶液)在不同激发波长下的发射光谱。从图中可以看出，合成的新型荧光分子具有激发波长依赖性，随着激发波长增大，发射峰逐渐红移。

[0066] 实施例3：不同氨基酸添加量的影响

[0067] 一种基于环糊精‑氨基酸(组氨酸)的荧光分子，其合成方法与实施例1相比区别仅在于：

[0068] 步骤S2中，所用组氨酸用量分别为31mg，62mg，93mg，124mg(醛基环糊精、氨基酸的摩尔比分别为1:2，1:4，1:6，1:8)；其余同实施例1。

[0069] 以365nm紫外灯作为激发光源，测量浓度为5mM(水溶液)时的荧光发射曲线，结果如图3所示，随着组氨酸添加量的增加，荧光强度逐渐增加。当添加摩尔比例为1:8，荧光强度增加不明显。

[0070] 实施例4：

[0071] 本实施例以实施例1所制备的基于环糊精‑组氨酸的荧光分子作为荧光探针，用于检测水样中的金霉素，具体检测过程如下：

[0072] 1)绘制标准曲线：将基于环糊精‑氨基酸荧光分子分散至去离子水中，浓度为200μM，用作荧光探针；

[0073] 分别配制浓度为0、1、2、4、6、8、10μM的金霉素标准溶液，并各取0.5mL与等体积的荧光探针混合，得到混合液，在黑暗环境下利用365nm紫外灯作为激发光源，测量所得混合液的荧光发射曲线，结果如图4所示，从图中可以看出，随着加入金霉素的浓度增大，体系的荧光强度逐渐增强；

[0074] 对上述混合液进行拍照获得荧光图像，随着金霉素浓度增大，图像亮度逐渐增大，利用图像分析软件分析图像的B值与G值，以B/G为纵坐标，以金霉素浓度(μM)为横坐标绘制标准曲线(如图5所示)，并得到金霉素检测拟合方程：y＝0.1431x+1.3319，(R2＝0.998)；根据检出限LOD＝3σ/N(其中，σ为空白样品的标准偏差，N为线性方程的斜率)计算得出，以环糊精‑组氨酸的荧光分子为探针的检出限为12nM。

[0075] 2)待测水样预处理：将待测水样过滤，调节其pH为中性；

[0076] 3)水样中金霉素的检测：取0.5mL预处理水样，与0.5mL荧光探针溶液混合，得到混合样，以365nm紫外灯为激发光源获得荧光图像后并使用图像分析软件得到图像的B/G，之后根据拟合方程，得到对应的金霉素浓度。采集同济大学(四平路校区)校园水及自来水进行加标回收实验，分别添加1μM、3μM、4μM和7μM的金霉素，利用上述方法进行测试，得到的金霉素回收率为97.25％‑101.67％，具体结果如附表1所示。

[0077] 表1加标回收实验结果

[0078]

[0079] 实施例5：

[0080] 以实施例1合成的基于环糊精‑组氨酸作为荧光探针，对不同共存或结构相似的小分子有机物进行选择性检测，具体方法如下：

[0081] 将基于环糊精‑氨基酸荧光分子分散至去离子水中，浓度为200μM，用作荧光探针；同时配置多份200μM的不同小分子有机物溶液分别包括金霉素(CTC)、乙酸(AC)葡萄糖(Glucose)、氨苄青霉素(Amp)、氯霉素(CAP)、链霉素(Str)、萘啶酸(Nal)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、三氯乙酰胺(TCAM)、四环素(TC)、土霉素(OTC)、美诺环素(MOC)、并各取1mL与等体积的荧光探针溶液混合，静置待反应体系稳定后，测试其荧光光谱(以365nm紫外灯为激发光源)，考察其选择性识别能力，如图6所示，加入金霉素后，体系的荧光信号明显增强，同时发射峰蓝移，而其它小分子有机物加入后体系的荧光响应没有明显变化，表明该方法具有良好的选择性，实现了环糊精‑组氨酸荧光探针对金霉素的特异性识别。

[0082] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。