获得造血干/祖细胞的培养基及培养方法和用途

摘要

本发明涉及细胞工程领域，具体涉及获得造血干/祖细胞的培养基及培养方法和用途。本发明提供一种获取造血干/祖细胞的培养基体系，包括：第一阶段诱导培养基和第二阶段诱导培养基，所述第一阶段诱导培养基含有Bix01294、RG108、PD0325901和VPA；所述第二阶段诱导培养基含有Bix01294和VPA。本发明通过筛选能够诱导成红细胞重编程为造血干/祖细胞的小分子化合物，获得特殊组成的培养基体系，以非转录因子依赖的方式实现红系细胞向造血干/祖细胞的重编程。

权利要求

1.培养基体系在制备造血干/祖细胞中的用途，其特征在于，所述培养基体系包括：第一阶段诱导培养基和第二阶段诱导培养基，所述第一阶段诱导培养基含有Bix01294、RG108、PD0325901和VPA；

所述第二阶段诱导培养基含有Bix01294和VPA，所述第二阶段诱导培养基进一步包括SCF、TPO、IL‑3、Flt3L、hydrocortisone、GlutaMAX。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述第一阶段诱导培养基中，所述Bix01294的浓度为0.3‑0.7 μM；

任选地，所述RG108的浓度为0.02‑0.07 μM；

任选地，所述PD0325901的浓度为0.2‑0.7 μM；

任选地，所述VPA的浓度为0.1‑0.3 mM。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述第二阶段诱导培养基中，所述Bix01294的浓度为0.3‑0.7 μM；

任选地，所述VPA的浓度为0.1‑0.3 mM。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述第一阶段诱导培养基进一步包括SCF、TPO、IL‑3、IL‑6；

任选地，所述SCF的浓度为30‑60 ng/mL；

任选地，所述TPO的浓度为30‑60 ng/mL；

任选地，所述IL‑3的浓度为10‑30 ng/mL；

任选地，所述IL‑6的浓度为30‑60 ng/mL。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，在所述第二阶段诱导培养基中，所述SCF的浓度为10‑40 ng/mL；

任选地，所述TPO的浓度为10‑40 ng/mL；

任选地，所述IL‑3的浓度为10‑40 ng/mL；

任选地，所述Flt3L的浓度为10‑40 ng/mL；

任选地，所述hydrocortisone的浓度为0.5‑2 μM。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述第一阶段诱导培养基进一步包括基础培养基，所述基础培养基包括选自StemSpan SFEM II培养基、RPMI 1640培养基、H5100培养基中的至少之一。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述第一阶段诱导培养基中的基础培养基为StemSpan SFEM II培养基。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述第二阶段诱导培养基进一步包括基础培养基，所述基础培养基包括选自H5100培养基、StemSpan SFEM II培养基、RPMI 1640培养基中的至少之一。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述第二阶段诱导培养基中的基础培养基为H5100培养基。

10.一种制备造血干/祖细胞的方法，其特征在于，包括：（1）获取红系细胞；

（2）将所述红系细胞在权利要求1‑9中任一项所述的制备造血干/祖细胞中的用途中使用的培养基体系中的第一阶段诱导培养基中培养，获取第一阶段诱导细胞；

（3）将所述第一阶段诱导细胞与饲养层细胞共培养，经共培养后转移到权利要求1‑9中任一项所述的制备造血干/祖细胞中的用途中使用的培养基体系中的第二阶段诱导培养基中进行培养，以便获取所述造血干/祖细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述红系细胞是通过单核细胞经红系诱导培养基诱导获取的；

‑ +

任选地，所述红系细胞为CD34CD71的细胞；

任选地，步骤（2）的培养时间为3‑5天；

任选地，所述饲养层细胞选自AFT024细胞、胎肝基质细胞、OP9细胞中的至少之一；

任选地，步骤（3）的培养时间为5‑15天。

‑ + ‑

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述红系细胞为CD34CD71 CD235a的细胞。

说明书

获得造血干/祖细胞的培养基及培养方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞工程领域，具体涉及获得造血干/祖细胞的培养基及培养方法和用途。

背景技术

[0002] 造血系统失调会导致许多疾病，诸如贫血、白血病、淋巴瘤和血小板减少症。目前，造血干/祖细胞移植和造血细胞输注是治疗这些血液病的有效方法，例如地中海贫血和白血病等。然而，传统造血干/祖细胞来源——如脐带血、骨髓和外周血，由于可移植细胞数量有限以及难以高效扩增，导致传统来源的造血干/祖细胞移植治疗常受困于细胞来源短缺的难。因此，通过再生医学技术找到造血干/祖细胞的新来源有很大的应用前景。

[0003] 目前获取造血干/祖细胞的方法主要包括:(1)利用诱导分化技术将人多能干细胞定向诱导分化为造血干/祖细胞；(2)利用细胞谱系重编程技术将成体细胞直接去分化为造血干/祖细胞。然而，利用多能干细胞获取造血干/祖细胞在应用时存在致瘤风险。诱导重编程的方式依赖于病毒介导的转录因子，这种对基因进行操作的方式带来安全性隐患，限制了将来的临床转化。

[0004] 因此，亟需开发一种更为安全的以非转录因子依赖的方式实现红系细胞向造血干/祖细胞的重编程的方法。

发明内容

[0005] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本发明提供一种获取造血干/祖细胞的培养基体系，包括第一阶段诱导培养基和第二阶段诱导培养基，本发明通过筛选能够诱导成红细胞重编程为造血干/祖细胞的小分子化合物，获得特殊组成的培养基体系，以非转录因子依赖的方式实现红系细胞向造血干/祖细胞的重编程。本发明第一方面提供一种获取造血干/祖细胞的培养基体系。根据本发明的一个实施方案，所述培养基体系包括：

[0006] 第一阶段诱导培养基和第二阶段诱导培养基，

[0007] 所述第一阶段诱导培养基含有Bix01294、RG108、PD0325901和VPA；

[0008] 所述第二阶段诱导培养基含有Bix01294和VPA。

[0009] 现有的获取造血干/祖细胞的方式，存在较大的安全隐患。例如，利用多能干细胞获取造血干/祖细胞在应用时存在致瘤风险；诱导重编程的方式依赖于病毒介导的转录因子，这种对基因进行操作的方式带来安全性隐患，限制了将来的临床转化。发明人通过在大量的利于诱导分化的小分子化合物中筛选获得上述特定组成的培养基组分，通过筛选能够诱导成红细胞重编程为造血干/祖细胞的小分子化合物，获得特殊组成的培养基体系，以非转录因子依赖的方式实现红系细胞向造血干/祖细胞的重编程。

[0010] 根据本发明的一个实施方案，所述第一阶段诱导培养基中，所述Bix01294的浓度为0.3‑0.7μM。

[0011] 根据本发明的一个实施方案，所述第一阶段诱导培养基中，所述RG108的浓度为0.02‑0.07μM。

[0012] 根据本发明的一个实施方案，所述第一阶段诱导培养基中，所述PD0325901的浓度为0.2‑0.7μM。

[0013] 根据本发明的一个实施方案，所述第一阶段诱导培养基中，所述VPA的浓度为0.1‑0.3mM。

[0014] 根据本发明的一个实施方案，所述第二阶段诱导培养基中，所述Bix01294的浓度为0.3‑0.7μM。

[0015] 根据本发明的一个实施方案，所述第二阶段诱导培养基中，所述VPA的浓度为0.1‑0.3mM。

[0016] 根据本发明的一个实施方案，所述第一阶段诱导培养基进一步包括SCF、TPO、IL‑3、IL‑6。

[0017] 根据本发明的一个实施方案，所述第一阶段诱导培养基中所述SCF的浓度为30‑60ng/mL。

[0018] 根据本发明的一个实施方案，所述第一阶段诱导培养基中所述TPO的浓度为30‑60ng/mL。

[0019] 根据本发明的一个实施方案，所述第一阶段诱导培养基中所述IL‑3的浓度为10‑30ng/mL。

[0020] 根据本发明的一个实施方案，所述第一阶段诱导培养基中所述IL‑6的浓度为30‑60ng/mL。

[0021] 根据本发明的一个实施方案，所述第二阶段诱导培养基进一步包括SCF、TPO、IL‑3、Flt3L、hydrocortisone、GlutaMAX。

[0022] 根据本发明的一个实施方案，所述第二阶段诱导培养基中所述SCF的浓度为10‑40ng/mL。

[0023] 根据本发明的一个实施方案，所述第二阶段诱导培养基中所述TPO的浓度为10‑40ng/mL。

[0024] 根据本发明的一个实施方案，所述第二阶段诱导培养基中所述IL‑3的浓度为10‑40ng/mL。

[0025] 根据本发明的一个实施方案，所述第二阶段诱导培养基中所述Flt3L的浓度为10‑40ng/mL。

[0026] 根据本发明的一个实施方案，所述第二阶段诱导培养基中所述hydrocortisone的浓度为0.5‑2μM。

[0027] 根据本发明的一个实施方案，所述第一阶段诱导培养基进一步包括基础培养基，所述基础培养基包括选自StemSpan SFEM II培养基、RPMI 1640培养基、H5100培养基中的至少之一。

[0028] 根据本发明的一个实施方案，所述第一阶段诱导培养基中基础培养基为StemSpan SFEM II培养基。

[0029] 根据本发明的一个实施方案，所述第二阶段诱导培养基进一步包括基础培养基，所述基础培养基包括选自H5100培养基、StemSpan SFEM II培养基、RPMI 1640培养基中的至少之一。

[0030] 根据本发明的一个实施方案，所述第二阶段诱导培养基中所述基础培养基为H5100培养基。

[0031] 本发明第二方面提供第一方面所述的培养基体系在制备造血干/祖细胞中的用途。

[0032] 本发明第三方面提供一种制备造血干/祖细胞的方法。根据本发明的一个实施方案，所述方法包括：

[0033] (1)获取红系细胞；

[0034] (2)将所述红系细胞在第一方面所述的培养基体系中的第一阶段诱导培养基中培养，获取第一阶段诱导细胞；

[0035] (3)将所述第一阶段诱导细胞与饲养层细胞共培养，经共培养后转移到第一方面所述的培养基体系中的第二阶段诱导培养基中进行培养，以便获取所述造血干/祖细胞。

[0036] 将第一阶段诱导细胞与饲养层细胞共培养，能够进一步提升了红系细胞诱导效率，能够获得更多的造血干/祖细胞。

[0037] 根据本发明的一个实施方案，所述红系细胞是通过单核细胞经红系诱导培养基诱导获取的。

[0038] 根据本发明的一个实施方案，所述红系细胞为CD34‑CD71+的细胞。

[0039] 根据本发明的一个实施方案，所述红系细胞为CD34‑CD71+CD235a‑的细胞。

[0040] CD34‑CD71+CD235a‑细胞更易于被重编程获得造血干/祖细胞。

[0041] 根据本发明的一个实施方案，步骤(2)的培养时间为3‑5天。

[0042] 根据本发明的一个实施方案，所述饲养层细胞选自AFT024细胞、胎肝基质细胞、OP9细胞中的至少之一。

[0043] 根据本发明的一个实施方案，步骤(3)的培养时间为5‑15天。

[0044] 本发明提供的制备造血干/祖细胞的方法可以将红系细胞利用无外源基因成分的小分子化合物诱导的方式重编程为造血干/祖细胞细胞，适用于临床前研究和临床应用。

[0045] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

[0046] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

[0047] 图1显示了成红细胞经过各种小分子化合物组合的处理后ERG基因的表达情况，图中，图中，各大写字母分别代表：B，Bix01294；R，RG108；V，VPA；P或PD，PD0325901；PS，PS48；CHIR，CHIR99021；Y27，Y27632；FSK，Forskolin；

[0048] 图2显示了第二阶段诱导培养基中加入的小分子化合物的筛选，其中，A图显示了+第二阶段用不同小分子组合诱导7天后，流式检测CD34 细胞比例；B图显示了不同处理组+ +
CD34细胞比例的柱状图；C图显示了三次独立重复实验不同处理组CD34 细胞比例的统计图，图A‑C中，各大写字母分别代表：B，Bix01294；R，RG108；V，VPA；P，PD0325901；

[0049] 图3显示了以CD34‑CD71+CD235a‑和CD34‑CD71+CD235a+细胞为起始细胞分别诱导获得造血干/祖细胞的结果比较；其中(a)：诱导后第十天细胞共培养组明场图(标尺为+ +100um)；(b)：流式检测CD34细胞比例结果；(c)：CD34细胞比例的流式检测统计图，*表示P<
0.05；

[0050] 图4显示了成红细胞转化为造血干/祖细胞的诱导过程；

[0051] 图5显示了流式细胞术分析重编程获得的造血祖细胞中各种造血祖细胞的比例结果；

[0052] 图6显示了重编程获得的细胞造血转录因子mRNA表达量检测结果，其中，EC表示‑ + ‑ +CD34CD71 CD235a 成红细胞，iHPC为重编程获得的造血祖细胞；CD34 HSPC为脐血来源的+
CD34造血干/祖细胞；

[0053] 图7显示了起始细胞造血集落形成实验结果，标尺为200um；

[0054] 图8显示了iHPC造血集落形成实验结果，A图为多系集落形成图，B图为统计结果，标尺为500μm；

[0055] 图9显示了巨核集落形成实验结果，其中A图为起始细胞与重编程得到的iHPC巨核集落形成图，B图为统计结果，标尺为100μm；

[0056] 图10显示了起始细胞与重编程获得的细胞基于mRNA测序分析的差异表达基因火山图，其中，红点代表表达上调的差异基因(3934个)，绿点代表表达下调的差异基因(2469个)，灰色点代表无显著差异基因；

[0057] 图11显示了基于mRNA测序分析的部分差异表达基因热图分析，与起始细胞组相比，红色代表差异基因表达量增加，蓝色代表差异基因表达量降低。

具体实施方式

[0058] 下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

[0059] 实施例的实验中所用到的试剂，如无特殊说明，均可通过市售获得。

[0060] 此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

[0061] 根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供一种获取造血干/祖细胞的培养基体系，包括：

[0062] 第一阶段诱导培养基和第二阶段诱导培养基，

[0063] 所述第一阶段诱导培养基含有Bix01294、RG108、PD0325901和VPA；

[0064] 所述第二阶段诱导培养基含有Bix01294和VPA。

[0065] 本发明提供的培养基体系中含有的组分包括但不限于上述特殊的小分子化合物，例如，培养基体系还含有本领域已知的其他用于红系细胞诱导分化为造血干/祖细胞的组分以及一些基础培养基，也都在本发明提供的培养基体系的保护范围之内。

[0066] 根据本发明一个具体的实施方案，所述第一阶段诱导培养基中，所述Bix01294的浓度为0.3‑0.7μM，所述RG108的浓度为0.02‑0.07μM，所述PD0325901的浓度为0.2‑0.7μM，所述VPA的浓度为0.1‑0.3mM。发明人发现，当诱导培养基中加入其他的小分子化合物，例如PS48、CHIR99021、Y27632、Forskolin，对成红细胞诱导转化为造血干/祖细胞的诱导作用相对较弱。而本发明提供的特殊组成的诱导培养基，能够显著提升造血干/祖细胞关键基因的表达量。

[0067] 根据本发明一个具体的实施方案，所述第一阶段诱导培养基进一步包括SCF、TPO、IL‑3、IL‑6；所述SCF的浓度为30‑60ng/mL；所述TPO的浓度为30‑60ng/mL；所述IL‑3的浓度为10‑30ng/mL；所述IL‑6的浓度为30‑60ng/mL。

[0068] 根据本发明一个具体的实施方案，所述第一阶段诱导培养基进一步包括基础培养基，所述基础培养基包括选自StemSpan SFEM II培养基、RPMI 1640培养基、H5100培养基中的至少之一，优选地，所述基础培养基为StemSpan SFEM II培养基。

[0069] 根据本发明一个具体的实施方案，所述第二阶段诱导培养基中，所述Bix01294的浓度为0.3‑0.7μM，所述VPA的浓度为0.1‑0.3mM。本发明提供的第二阶段诱导培养基中+Bix01294和VPA的加入，相比其他的小分子化合物组合，能够进一步提升CD34细胞比例。

[0070] 根据本发明一个具体的实施方案，所述第二阶段诱导培养基进一步包括SCF、TPO、IL‑3、Flt3L、hydrocortisone、GlutaMAX；所述SCF的浓度为10‑40ng/mL；所述TPO的浓度为10‑40ng/mL；所述IL‑3的浓度为10‑40ng/mL；所述Flt3L的浓度为10‑40ng/mL；所述hydrocortisone的浓度为0.5‑2μM。

[0071] 根据本发明一个具体的实施方案，所述第二阶段诱导培养基进一步包括基础培养基，所述基础培养基包括选自H5100培养基、StemSpan SFEM II培养基、RPMI 1640培养基中的至少之一，优选地，所述基础培养基为H5100培养基。

[0072] 根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供一种制备造血干/祖细胞的方法，包括：

[0073] (1)获取红系细胞；

[0074] (2)将所述红系细胞在上述培养基体系中的第一阶段诱导培养基中培养，获取第一阶段诱导细胞；

[0075] (3)将所述第一阶段诱导细胞与饲养层细胞共培养，经共培养后转移到上述培养基体系中的第二阶段诱导培养基中进行培养，以便获取所述造血干/祖细胞。

[0076] 根据本发明一个具体的实施方案，关于红系细胞的来源，并没有特别的限制，例如可以是通过单核细胞经红系诱导培养基诱导获取的，也可以是通过方式获得的，关于红系细胞所有来源的方式均在本发明的保护范围内。

[0077] 根据本发明一个具体的实施方案，所述红系细胞为CD34‑CD71+的细胞，优选为‑ + ‑ ‑ + ‑ ‑ + +CD34CD71CD235a的细胞。CD34CD71CD235a 细胞相比CD34CD71CD235a细胞能够进一步+ ‑ + ‑
提升诱导获得的CD34细胞比例，CD34CD71CD235a细胞更易于被重编程。

[0078] 根据本发明一个具体的实施方案，步骤(2)的培养时间为3‑5天，例如3天、4天、5天，步骤(3)中培养时间为5‑15天，例如可以是5天、7天、10天、12天、15天。

[0079] 根据本发明一个具体的实施方案，所述饲养层细胞选自AFT024细胞、胎肝基质细胞、OP9细胞中的至少之一，本发明提及的饲养层细胞的种类并不限于此，也可以是其他种类的饲养层细胞。

[0080] 下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0081] 实施例1培养基中小分子化合物的筛选

[0082] 1、成红细胞转化为造血祖细胞第一诱导阶段小分子化合物的筛选

[0083] 1)从血液标本中抽提单个核细胞(mononuclear cells,MNC)，通过红系诱导培养基(StemSpan中添加SCF、EPO、IGF‑1、Transferrin、地塞米松)进行培养，获取成红细胞，诱‑ +导7‑10天后流式分选CD34CD71的细胞；

[0084] 2)将分选的细胞用不同小分子组合的培养基进行处理，培养基基础成分为StemSpan SFEM II培养基中添加50ng/mL SCF、50ng/mL IL‑6、20ng/mL IL‑3和50ng/mL TPO，向其中分别加入以下小分子化合物，具体分组如下：

[0085] Con组：0.2％DMSO；

[0086] BRV组：0.5μM Bix01294、0.04μM RG108、0.2mM VPA；

[0087] BRV+PD组：0.5μM Bix01294、0.04μM RG108、0.2mM VPA、0.5μM PD0325901；

[0088] BRV+PS组：0.5μM Bix01294、0.04μM RG108、0.2mM VPA、5μM PS48；

[0089] BRV+CHIR组：0.5μM Bix01294、0.04μM RG108、0.2mM VPA、3μM CHIR99021；

[0090] BRV+Y27组：0.5μM Bix01294、0.04μM RG108、0.2mM VPA、10μM Y27632；

[0091] BRV+FSK组：0.5μM Bix01294、0.04μM RG108、0.2mM VPA、10μM Forskolin。

[0092] 分别利用含有上述7组组分的培养基培养3天后，收集细胞提取RNA，利用qRT‑PCR检测造血干/祖细胞关键基因ERG的表达水平。

[0093] 实验结果如图1所示，CD34‑CD71+的成红细胞经过上述条件诱导后，造血干/祖细胞关键基因ERG在BRV+PD组的表达水平高于其他组，也就是说，含有0.5μM Bix01294、0.04μM RG108、0.2mM VPA、0.5μM PD0325901的培养基更有利于成红细胞转化为造血干/祖细胞，而其他的小分子的加入，例如PS48、CHIR99021、Y27632、Forskolin对成红细胞诱导转化为造血干/祖细胞的诱导作用相对较弱。

[0094] 2、初步建立的成红细胞转化为造血祖细胞的过程：

[0095] 1)从血液标本中抽提单个核细胞，通过红系诱导培养基(StemSpan中添加SCF、EPO、IGF‑1、Transferrin、地塞米松)进行培养，获取成红细胞，诱导7‑10天后流式分选‑ +CD34CD71的细胞；

[0096] 2)用第一阶段诱导培养基(StemSpan SFEM II培养基，加入50ng/mL SCF、50ng/mL TPO、20ng/mL IL‑3、50ng/mL IL‑6，以及Bix01294 0.5μM、RG108 0.04μM、PD03259010.5μM、VPA 0.2mM)培养上述分选的成红细胞；

[0097] 3)三天后将经过第一阶段诱导的细胞换成第二阶段诱导培养基(H5100培养基中，加入SCF 25ng/mL、TPO 25ng/mL、IL‑3 25ng/mL、Flt3L 25ng/mL、hydrocortisone 1μM、1×GlutaMAX、Bix01294 0.5μM、VPA 0.2mM)；

[0098] 4)诱导10‑14天后获得的CD34+细胞即为造血干/祖细胞。

[0099] 3、第二诱导阶段培养基组成的探索

[0100] 第一阶段诱导先将CD34‑CD71+CD235a‑成红细胞在含有Bix01294、RG108、PD0325901和VPA的培养基中培养3天，然后第二阶段将细胞与丝裂霉素C处理过的AFT024细胞共培养，并将这四个小分子化合物(Bix01294、RG108、PD0325901和VPA)分别进行组合用+来筛选适合诱导造血祖细胞的小分子化合物，继续培养7天后用流式细胞检测CD34细胞比例。初步筛选结果显示第二阶段用Bix01294和VPA这两个小分子组合(BV)的培养基诱导组+ +
的CD34 细胞比例较其他组高(图2中A和B图)。进一步将CD34 细胞比例较高的7个组进行重+
复实验，三次独立重复实验结果显示BV组的CD34 细胞比例最高，为7.26％(图2中C图)。初+
步建立了利用小分子化合物将成红细胞转分化为CD34 造血祖细胞的分阶段诱导体系，第一阶段将成红细胞在含有Bix01294、RG108、PD0325901和VPA的培养基中培养3天，第二阶段将上述细胞与饲养层细胞AFT024细胞共培养，并用含Bix01294和VPA的培养基培养7天。

[0101] 实施例2培养体系的优化

[0102] 进一步对小分子化合物诱导成红细胞转分化为造血祖细胞的体系进行优化。

[0103] 首先从起始细胞和饲养层细胞这两个方面进行了分析，将由实施例1中MNC分化获‑ + ‑ ‑ + +得的成红细胞分选得到的CD34 CD71CD235a和CD34CD71CD235a两群细胞，经第一阶段诱导培养基诱导3天后，再分别在有AFT024细胞共培养和无共培养的条件下用第二阶段诱导+ ‑ +
培养基诱导7天，用流式检测CD34 细胞比例，结果如图3中A‑C图所示，显示以CD34 CD71‑ + ‑ + +
CD235a细胞为起始细胞组的CD34细胞比例显著高于以CD34CD71CD235a 细胞为起始细胞‑ + ‑
组，说明CD34CD71CD235a细胞更易于被重编程。另一方面，在两种起始细胞中，与AFT024+
细胞共培养组的CD34 细胞比例均明显高于无共培养组，说明饲养层细胞发挥了重要的作用(图3中B图和C图)。因此，确定小分子化合物诱导成红细胞转分化为iHPC的诱导体系为：
‑ + ‑
以CD34 CD71CD235a成红细胞为起始细胞，将其用含有Bix01294、RG108、PD0325901和VPA的培养基培养3天(第一阶段)，然后将细胞与AFT024细胞共培养，用含有Bix01294和VPA的培养基培养7天(第二阶段)，培养过程如图4所示。

[0104] 实施例3优化后的成红细胞转化为造血祖细胞的过程

[0105] 1)从血液标本中抽提单核细胞，通过红系诱导培养基(StemSpan中添加SCF、EPO、‑IGF‑1、Transferrin、地塞米松)进行培养，获取成红细胞，诱导7‑10天后流式分选CD34+
CD71的细胞；

[0106] 2)用第一阶段诱导培养基(StemSpan SFEM II培养基，加入50ng/mL SCF、50ng/mL TPO、20ng/mL IL‑3、50ng/mL IL‑6，Bix01294 0.5μM、RG108 0.04μM、PD0325901 0.5μM、VPA 0.2mM)培养上述分选的成红细胞；

[0107] 3)三天后将细胞与AFT024细胞共培养，并换成第二阶段诱导培养基(H5100培养基中，加入SCF 25ng/mL、TPO 25ng/mL、IL‑3 25ng/mL、Flt3L 25ng/mL、hydrocortisone 1μM、1×GlutaMAX、Bix01294 0.5μM、VPA 0.2mM)；

[0108] 4)诱导10‑14天后获得的CD34+细胞即为造血干/祖细胞。

[0109] 实施例4重编程获得的造血祖细胞的比例以及造血相关基因鉴定

[0110] 1、检测重编程获得的造血祖细胞的比例

[0111] 对实施例3重编程获得的iHPC通过流式细胞术对各种造血祖细胞的比例进行分+ + + + ‑ +析，结果显示在造血干/祖细胞(CD34CD38)中，CMP(CD34 CD38CD45RACD123)的比例约为+ + + + + + ‑ ‑
10％，GMP(CD34CD38CD45RACD123)的比例约为3.33％，MEP(CD34CD38CD45RACD123)的比例约为53.3％(图5)。

[0112] 2、对重编程获得的造血祖细胞的造血相关基因鉴定

[0113] 将重编程获得的iHPC和分选得到的起始CD34‑CD71+CD235a‑成红细胞(EC)分别提取RNA，通过实时荧光定量PCR发现，结果如图6所示，iHPC(重编程获得的造血祖细胞)的RUNX1基因表达较EC提高3倍，ERG基因在起始细胞中表达量低未检测到，iHPC(重编程获得+ +的造血祖细胞)中ERG基因表达较CD34HSPC(脐血来源的CD34造血干/祖细胞)提高1倍以上，GFI1基因在iHPC中较起始细胞提高24倍以上。这些数据表明，通过小分子化合物两阶段的培养能够诱导造血相关转录因子的表达。

[0114] 实施例5重编程细胞集落培养

[0115] 为验证重编程获得的iHPC是否具备形成一个或多个血细胞谱系的能力，通过集落形成实验检验其多系分化的潜能。

[0116] 具体如下：将EC和iHPC分别接种于人甲基纤维素培养基(MethoCultTM H4434 Classic)中培养，观察显示半固体培养基表面形成肉眼可见的多谱系集落。EC只能形成爆式红系集落(BFU‑E)(图7)，而iHPC形成了多种集落，其中粒细胞－巨噬细胞形成单位(CFU‑GM)数量最多，约为BFU‑E的2倍，每个CFU‑GM包含至少20个粒细胞及巨噬细胞，而较为原始的粒细胞－红细胞－巨噬细胞－巨核细胞集落形成单位(CFU‑GEMM)数量最少且多为>500个细胞的大型的集落(图8中A和B图)。另外，通过免疫化学法对获得巨核集落(CFU‑MK)进行染色鉴定，结果显示重编程获得iHPC具有形成CD41阳性巨核集落的能力，且多为来源于较为成熟的巨核祖细胞的中小集落，而起始细胞EC无法形成CD41阳性巨核集落(图9中A图和B图)。进一步说明重编程获得iHPC是具有多向分化潜能的造血祖细胞。

[0117] 实施例6重编程获得的细胞转录组测序分析

[0118] 收集EC和两阶段诱导十天后的iHPC，进行了转录组测序。首先对EC与iHPC的差异表达基因进行分析，结果显示，iHPC相对于EC共有3934个基因表达量显著上调，2469个基因表达量显著下调(图10)。其中有大量的红系相关基因显著下调，包括红系发育关键性转录因子MYB、GATA1和KLF1，红系特征性表面标志物EPOR、GYPA和EPB42，以及红系特征性胞内蛋白ADD2、PLEK2和AHSP等，另外血红蛋白基因诸如HBA1、HBA2、HBG1和HBG2等也表现出显著下调。在iHPC中上调表达的基因中，发现了大量造血干/祖细胞相关的基因，例如造血干/祖细胞特征性基因RUNX1、HLF、GATA2、CD34、VWF和CCN1等；调控造血干/祖细胞维持扩增的HOXA家族基因(如HOXA1、HOXA2、HOXA3和HOXA5)以及WNT信号通路相关基因(如WNT3A、WNT5A、WNT4、WNT9A、WNT10B)显著上调；干祖细胞相关基因SOX2、KLF4、GATA3、GATA4、TCF4、SALL4等也显著上调(图11)。上述数据表明，经过小分子化合物两阶段的诱导，重编程获得的iHPC在转录组水平失去了起始成红细胞的红系特征，获得了干性和造血干/祖细胞特征。

[0119] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

[0120] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。